Identifikation potenzieller Anti-TB-Kandidaten: Ein Schritt-für-Schritt-Leitfaden zur Synthese, MIC-Bestimmung und Zytotoxizitätsbewertung in Säugetierzellen

Der Schwerpunkt unserer Forschung liegt auf der Entwicklung und Validierung neuartiger Anti-Tuberkulose-Medikamentenkandidaten, die darauf abzielen, therapeutische Strategien voranzutreiben. Die präventive phänotypische Screening-Pipeline kann bei der Suche nach neuen Arzneimitteln gegen Mycobacterium tuberculosis-Stämme eingesetzt werden. Zu Beginn sammeln Sie die benötigten Reagenzien und beginnen Sie mit der Herstellung der Reaktionsmischung mit den angegebenen Proportionen.

Rühren Sie die Reaktionsmischung 16 Stunden lang bei 85 Grad Celsius um. Verwenden Sie einen Rotationsverdampfer, um das Lösungsmittel zu entfernen. Fügen Sie etwa 20 Milliliter gesättigte Natriumbicarbonatlösung zum Rückstand hinzu.

Filtern Sie diese Suspension mit einem 11-Mikrometer-Cellulose-Qualitätsfilterpapier, um die Restfeststoffe zu sammeln. Lösen Sie die Restfeststoffe in 50 Millilitern Chloroform. Verwenden Sie einen Trenntrichter, um die Chloroformlösung dreimal mit 15 Millilitern Wasser abzuspülen.

Jedes Mal wird die Wasserschicht entfernt. Gib der organischen Phase anhydriertes Natriumsulfat hinzu, um das Restwasser zu entfernen und zu trocknen. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wird der entstehende grüne Feststoff viermal mit 10 Millilitern heißem Hexan bei etwa 50 Grad Celsius gewaschen.

Zu einem Milligramm Verbindung 6 wird ein Milliliter einer Eins-zu-eins-Mischung aus Acetonitril und Methanol hinzugefügt, um eine Grundlösung herzustellen. Verdünnen Sie die Standardlösung auf 0,5 Milligramm pro Milliliter und filtern Sie sie vor der Analyse. Laden Sie die Probe in das HPLC-System.

Verwenden Sie Chromatographie-Datenerfassungssoftware, um die Daten zu erfassen und zu verarbeiten. Stellen Sie die chromatographische Methode so ein, dass eine 250 mal 4,6 Millimeter umgekehrte Phase C18-Säule mit einer Partikelgröße von fünf Mikrometern verwendet wird. Stellen Sie den Durchfluss auf 1,5 Milliliter pro Minute ein und stellen Sie die UV-Detektion auf 254 Nanometer ein.

Richten Sie einen Gradienten ein, wie er mit programmierten Änderungen der mobilen Phasenzusammensetzung präsentiert wird. Transferiere etwa 15 bis 20 Milligramm Verbindung 6 in ein Kernspinresonanz- oder NMR-Rohr. Löse es in einem passenden Volumen von DMSOD6 auf.

Sobald die Erfassungsparameter wie dargestellt gesetzt sind, wird das Protonen-NMR-Spektrum mit einer Standard-Pulssequenz erfasst. Passen Sie die Erfassungsparameter an. Initiieren Sie das Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR-Spektrum und melden Sie chemische Verschiebungen in Teilen pro Million.

Visualisieren und verarbeiten Sie die NMR-Daten mit der aus dem Experiment gewonnenen Free Induction Decay-Datei. Für die chromatografiebasierte Reinigung von Verbindung 6 wird eine Säule mit Siliziumgel gefüllt. Lade das rohe Compound 6 auf die Säule.

Elutieren Sie die Verbindung und sammeln Sie Fraktionen. Überwachen Sie die Fraktionen mittels Dünnschichtchromatographie und kombinieren Sie die Fraktionen, die das reine Produkt enthalten. Fügen Sie 100 Mikroliter 7H9-Brühe, ergänzt mit 10 % Albumin-Dextrosekatalase oder ADC, in Säule 12 der 96-Well-Platte hinzu.

Dann übertrage 100 Mikroliter 7H9-Brühe mit 10 % ADC und 5 % DMSO in Spalte 11. Und dann nacheinander von Spalte neun bis eins. Fügen Sie 200 Mikroliter der Verbindung in Spalte 10 hinzu und weisen Sie pro Verbindung eine Reihe zu.

Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Verbindungslösung mit doppelter höchster Testkonzentration auf Säule 12 der 96-Well-Platte. Übertragen Sie 100 Mikroliter von Säule 10 auf Säule neun und mischen Sie gut durch Pipettieren, um eine zweifache Getreideverdünnung zu beginnen. Setzen Sie die serielle Verdünnung sequentiell bis Spalte eins fort.

Fügen Sie 100 Mikroliter der bakteriellen Suspension von Mycobacterium tuberculosis nacheinander von Spalte 11 bis Spalte eins hinzu und decken Sie die Platte ab. Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und brüten Sie sieben Tage bei 37 Grad Celsius aus. Gib als Nächstes 60 Mikroliter 0,01%-Resazurin-Lösung in jede Mulde der Platte und decke sie ab.

Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und bebrüten Sie sie 48 Stunden bei 37 Grad Celsius. Dann prüfe die Farbänderung von Blau zu Rosa. Bereiten Sie eine Arbeitslösung mit 0,5 Milligramm pro Milliliter MTT in serumfreiem DMEM vor.

Nehmen Sie Vero- und HEPG2-Zellen, die mit Verbindung 6 behandelt werden, für 48 Stunden und inspizieren Sie sie, um die Behandlungseffekte zu beurteilen. Saugen Sie das Medium von den Platten ab und fügen Sie unter schwachem Lichtverhältnis 50 Mikroliter MTT-Arbeitslösung zu jedem Brunnen hinzu. Nach einer dreistündigen Inkubation werden 100 Mikroliter DMSO zu jedem Brunnen hinzugefügt, um die Formazan-Kristalle unter schwachen Umgebungslichtverhältnissen aufzulösen.

Setzen Sie die Platte für 15 Minuten auf einen Orbitalshaker bei 100 U/min und schützen Sie sie vor Licht. Inspiziere die Kontrollbrunnen, um die vollständige Kristalllösung zu bestätigen. Stecke die Platte in einen Mikroplattenleser.

Stellen Sie die Referenzwellenlänge auf 630 bis 690 Nanometer ein und prüfen Sie die Absorption auf 570 Nanometer. Bereiten Sie eine 40 Mikrogramm pro Milliliter neutrale rote Arbeitslösung in serumfreiem DMEM vor. Anschließend bereitet die neutrale rote Desorptionslösung vor, die 1 % Gletscheressigsäure, 49 % Ethanol und 50 % ultrareines Wasser nach Volumen enthält.

Sobald die Wirkung von Compound 6 auf Vero- und HEPG2-Zellen bewertet wurde, entfernen Sie das Medium und geben Sie 100 Mikroliter der gefilterten neutralen roten Arbeitslösung zu jedem Bohrloch. Inkubiere die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Nach dem Entfernen der neutralen roten Arbeitslösung spülen Sie jeden Brunnen einmal mit 150 Mikrolitern sterilem PBS.

Gib jedem Brunnen 150 Mikroliter der neutralen roten Desorptionslösung zu. Legen Sie die Platte 15 Minuten lang auf einen Orbitalshaker bei 150 U/min, um den Farbstoff zu entfernen. Überprüfen Sie die Kontrollbrunnen, um die vollständige Farbstoffextraktion zu bestätigen.

Misse die Absorption bei 540 Nanometern mit einem Mikroplattenleser. Das HPLC-Chromatogramm zeigte, dass Verbindung 6 eine Retentionszeit von 14,11 Minuten und eine Reinheit von 99 % hatte. Das Protonen-NMR-Spektrum zeigte charakteristische Signale für die Piperidingruppe zwischen 1,50 und 3,13 Teilen pro Million. Ein Methyl-Singlet mit 2,38 Teilen pro Million.

Und aromatische Signale, darunter Doppelsignale mit 6,97 und 7,17 Teilen pro Million sowie ein Multiplet mit 7,63 bis 7,75 Teilen pro Million. Das Kohlenstoff-13-NMR-Spektrum zeigte ein Methylkohlenstoffsignal bei 23,81 Teilen pro Million und piperidinbezogene Signale zwischen 24,85 und 49,70 Teilen pro Million. Die MTT-Platte zeigte einen klaren Farbverlauf über die Verbindungskonzentrationen, was darauf hindeutet, dass die Zytotoxizität bei hohen Verbindungskonzentrationen bei durchscheinenden Bohrungen am höchsten und bei niedrigen Verbindungskonzentrationen bei tiefvioletten Bohrlöchern am niedrigsten war.

Die neutral rote Aufnahmeplatte zeigte einen klaren Farbverlauf über die Verbindungskonzentrationen, was darauf hindeutet, dass die Zytotoxizität bei hohen Verbindungskonzentrationen bei durchscheinenden Brunnen am höchsten und bei niedrigen Verbindungskonzentrationen bei tiefpinken Brunnen am niedrigsten war. Dieses Protokoll stellt eine Pipeline für die Entwicklung von Medikamentenkandidaten gegen Tuberkulose auf Basis phänotypischer Screenings dar. Es ist wichtig, die geringe Löslichkeit der synthetisierten Verbindungen bei der Anwendung des Protokolls zu berücksichtigen und zu bewerten.

Diese Forschung kann als Grundlage für zukünftige Bioverfügbarkeit, Makrophageninfektionen und In-vivo-Studien dienen.