Name: Eine Methode zur Anpassung von Euglena gracilis an maniokbasierte Substrate für heterotrophe Kultivierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Anpassung von Euglena gracilis an Manioksubstrate für heterotrophe Kultivierung. Diese Methode ermöglicht robustes Algenwachstum auf Abfallprodukten zur nachhaltigen Bioprozessierung.

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<table><tbody><tr><td>Autoklav - 533LS Dampf Sterilisator</td><td>Getinge</td><td>533LS</td><td>Damfsterilisation von Cassava-Medium. Sterilisieren Sie Medien mit dem Flüssigzyklus.</td></tr><tr><td>Bright-Line&trade; Hämozytometer Ersatz Deckglas</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR723015- 100EA</td><td>Speziell dicke Deckgläser, die für den Gebrauch mit dem Hämozytometer konzipiert sind.</td></tr><tr><td>Cassava getrockneter Brei</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Liefern Cassava-Substrat</td></tr><tr><td>Cassava Pellets</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Liefern Cassava-Substrat</td></tr><tr><td>Cassava Schalen</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Liefern Cassava-Substrat</td></tr><tr><td>Cassava Substrat (Garri)</td><td>Lokal Lieferant</td><td>N/A</td><td>Cassava-abgeleitetes Garri Einsatzstoff, der als Kohlenstoff Quelle verwendet wird; zubereitet mit deionisiertem Wasser.</td></tr><tr><td>Zentrifuge Thermo Scientific Sorvall ST16 Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific Sorvall ST16 Zentrifuge</td><td>75004241</td><td>Fähig für &ge;3.500 &times; g, verwendet für die Ernte von Biomasse.</td></tr><tr><td>Zentrifugenrohre Z.B. Axygen (A Corning Brand)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C-S</td><td>Steriler, mindestens 1,5 mL Volumen</td></tr><tr><td>Sauberes Wasser Z.B. UltraPure&trade; DNase/RNase- Frei destilliertes Wasser</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977035</td><td>Deionisiert oder destilliert. Verwendet für die Medienvorbereitung</td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Standardlichtmikroskop, geeignet für die routinemäßige Zellbeobachtung und -zählung.</td></tr><tr><td>Cyanid Test Streifen, kolorimetrisch. CN- 10-30 mg/L</td><td>MQuant</td><td>110044</td><td>Halbquantitative Cyanid-Erkennung. Als Sondermüll entsorgen</td></tr><tr><td>Steriler Standard Wägeschiffchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-549-750</td><td>Verwendet zum Wiegen von Cassava-Substraten und Trockenbiomasse.</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (angepasste Linie)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>In dieser Studie erzeugter Cassava-angepasster Stamm</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (Wildtyp)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Nicht angepasste Referenzstämme. Halten Sie die gleichen Standardbedingungen ein.</td></tr><tr><td>Euglena Wachstum Medium Komponenten</td><td>Verschiedene</td><td>N/A</td><td>Basisches Euglena-Medium, das nach Laborstandardformulierungen zubereitet wurde.</td></tr><tr><td>FreeZone 6 Liter Konsole Gefriertrockner</td><td>Labconco</td><td>70061xxxx</td><td>Verwendet für die Biomasse-Dehydrierung</td></tr><tr><td>Hämozytometer mit Standard Linien</td><td>Weber Scientific</td><td>NC1587539</td><td>Verwendet für manuelle Zellzählung.</td></tr><tr><td>Magnetrührer mit Heizplatte</td><td>IKA</td><td>N/A</td><td>Optional; verbessert die Konsistenz bei der Medienvorbereitung und Substratsuspension.</td></tr><tr><td>Mikropipetten (P20, P200, P1000)</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Einstellbare Volumenpipetten, die für aseptische Flüssigkeitsübertragungen verwendet werden.</td></tr><tr><td>Mini-Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Optional; erleichtert das schnelle Pelletieren während der Biomasseernte.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>Verwendet zum vorübergehenden Versiegeln von Kolben oder Platten, wenn keine Belüftungskappen verfügbar sind.</td></tr><tr><td>pH-Indikator Streifen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-520</td><td>Alternative zum pH-Meter für die schnelle qualitative Beurteilung des Kulturmediums.</td></tr><tr><td>pH-Meter mit Sonde Thermo Scientific Orion Star A211 Tisch-pH Meter</td><td>Thermo Scientific Orion Star A211 Tisch-pH Meter</td><td>13-645-519</td><td>Vor der Verwendung kalibriert. Zum Messen des pH-Werts des Kulturüberstands</td></tr><tr><td>Gekühlter Lagerraum (4&deg;C)</td><td>Frigidaire</td><td>FRT18S6JW7</td><td>Kurzzeitlagerung von Medien</td></tr><tr><td>Rüttelinkubator (dunkel)</td><td>Thermolyne</td><td>M49235</td><td>Orbitaler Rüttelschrank, der 100&ndash;150 U/min, Temperaturbereich 24&ndash;28 &deg;C erreichen kann; unter dunklen Bedingungen verwendet, um das heterotrophe Wachstum von Euglena zu unterstützen.</td></tr><tr><td>Sprühflasche (32oz)</td><td>Boardwalk</td><td>BWK03010</td><td>Verwendet zur Sterilisation am Arbeitsplatz und für die routinemäßige aseptische Handhabung (70% Ethanol-Lösung)</td></tr><tr><td>Tabellenkalkulation Software</td><td>Microsoft Excel</td><td>N/A</td><td>Datenerfassung, -organisation und -analyse</td></tr><tr><td>Steriler Pipettenspitzen</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Steriler, Einwegspitzen, die mit P20, P200 und P1000 Pipetten kompatibel sind.</td></tr><tr><td>Steriler serologischer Pipetten (5, 10, 25 mL)</td><td>Corning</td><td>N/A</td><td>Einzeln verpackte sterile Pipetten, die für Kulturtransfers und Probenahmen verwendet werden.</td></tr><tr><td>Trypanblau Lösung 0,4%, flüssig, steril gefiltert, geeignet für Zell Kultur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Vitalfarbstoff, der für die Beurteilung der Zelllebensfähigkeit mittels Trypanblau-Exklusionstest verwendet wird.</td></tr><tr><td>Röhrchen für Proben Entnahme (50 mL)</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>Für pH-Wert und Cyanid-Probenahme</td></tr><tr><td>Ventilkappen Erlenmeyer- Kolben (250&ndash;500 mL)</td><td>Corning&reg; 250 mL Polycarbonat-Erlenmeyer-Kolben mit Ventilkappe</td><td>431144</td><td>Polycarbonat-Erlenmeyer-Kolben mit belüftbaren Kappen; autoklavierbar; verwendet für sterile und nicht-sterile Flüssigkeitskulturen.</td></tr><tr><td>Abfallbehälter</td><td>Verschiedene - in Übereinstimmung mit festgelegten Laborstandards</td><td>N/A</td><td>Autoklavbeutel und Behälter für scharfe oder Glasabfälle für die biosicherheitskonforme Entsorgung.</td></tr></tbody></table>

eine methode zur anpassung von euglena gracilis an maniokbasierte substrate für heterotrophe kultivierung

A Method for Adapting Euglena gracilis to Cassava-Based Substrates for Heterotrophic Cultivation

Die folgenden repräsentativen Ergebnisse veranschaulichen die erwarteten Ergebnisse, wenn das beschriebene Protokoll erfolgreich angewendet wird, sowie die Bandbreite der unter suboptimalen Bedingungen beobachteten Ergebnisse. Repräsentative Daten, die diesen Ergebnissen entsprechen, sind in Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7 dargestellt. Zusammen bieten diese Ergebnisse praktische Leitlinien zur Interpretation von Wachstumsdynamiken, Viabilität, Morphologie und Proteinergebnissen bei der Anpassung von E. gracilis an maniokbasierte Substrate unter heterotrophen, vollständig dunklen Kultivierungsbedingungen. Darüber hinaus bestätigen diese Ergebnisse wichtige biologische Ergebnisse des Protokolls, darunter erfolgreiche Anpassung, nachhaltiges Wachstum, hohe Lebensfähigkeit, stabile Morphologie, konsistente Leistung über Substrate hinweg und messbare Proteinproduktion.
Während der Experimente wurden pro Behandlung drei Replikate (alle Arten von Maniokmedium) verwendet. Wir erkennen an, dass die Anzahl der Replikate dem Ermessen und den logistischen Einschränkungen jeder Gruppe abhängt, die die oben genannten Protokolle befolgt. Die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls führt zu einem anhaltenden heterotrophen Wachstum von E. gracilis in Garri-basierten Medien unter vollständig dunklen Bedingungen. Positive Ergebnisse zeichnen sich durch glatte, sigmoidale Wachstumspfade, begrenzte Divergenz zwischen Replikaten und stabile Zelldichten in der späten Phase aus. Morphologische Merkmale, die auf positive Ergebnisse hindeuteten und in adaptierten Populationen konsistent beobachtet wurden, umfassten Zellrundheit und dicke Zellmembranen. Im Gegensatz dazu erscheinen ungesunde kollabierte Zellen typischerweise unregelmäßig, fragmentiert oder strukturell kompromittiert und sind mit einer verminderten Lebensfähigkeit verbunden, was sie von intakten runden oder halb-enzysten Formen unterscheidet, die in adaptierten Kulturen beobachtet wurden. Zur Referenz sind repräsentative Bilder von Wildtyp-E. gracilis mit charakteristischer länglicher Morphologie enthalten (Abbildung 8), um die Basiszellstruktur von adaptierten oder veränderten Formen zu unterscheiden. Kulturen mit 30 g L-1 Garri zeigten ein höheres integriertes Wachstum, gemessen an der Fläche unter der Wachstumskurve (AUC), im Vergleich zu niedrigeren Konzentrationen, was auf eine effizientere Nutzung des Maniok-Substrats und eine erfolgreiche physiologische Anpassung hindeutet (Abbildung 1).
Suboptimale Ergebnisse werden häufig bei niedrigeren Garri-Konzentrationen (10–20 g L-1) beobachtet, wo Wachstum nachweisbar, aber in der Größe reduziert ist und je nach Replikation variabler ist. Bei höheren Konzentrationen (40–50 g L-1) können Kulturen erhöhte Zelldichten erreichen; diese Bedingungen zeigen jedoch häufig eine verzögerte Stabilisierung oder erhöhte zeitliche Variabilität (Abbildung 2).
In erfolgreichen Experimenten bleibt die Zelllebensfähigkeit während der gesamten Kulturperiode hoch, mit nur geringfügigen Schwankungen in der Mitte des Experiments. Trypan-Blau-Ausschlusstests zeigen, dass Kulturen, die bei 30 g L-1 Garri gehalten werden, einen hohen Anteil lebensfähiger (ungefärbter) Zellen im Vergleich zu nicht lebensfähigen (blau gefärbten) Zellen über die beprobten Zeitpunkte hinweg behalten (Abbildung 3). Abweichungen von diesem Muster, einschließlich eines erhöhten Anteils gefärbter Zellen, verminderter Beweglichkeit oder Verschiebungen hin zu abgerundeten oder kollabierten Morphologien, können auf suboptimale Bedingungen hinweisen und als frühe Auslöser für Fehlersuche dienen. Die Lebensfähigkeit und morphologische Bewertungen basierten auf konsistenten Beobachtungskriterien, darunter Zellintegrität, richtungsbewegliche Beweglichkeit und die relative Prävalenz von verlängerten versus abgerundeten oder kollabierten Formen.
Suboptimale Ergebnisse zeichnen sich durch vorübergehende Verringerungen der Viabilität aus, die am häufigsten bei höheren Garri-Konzentrationen beobachtet werden. Eine teilweise Erneuerung kann zu späteren Zeitpunkten beobachtet werden; diese Bedingungen zeigen jedoch eine erhöhte Variabilität der Lebensfähigkeit über die Kultur hinweg (Abbildung 4). Diese Wachstumsmuster zeigen, dass Zwischensubstratkonzentrationen (z. B. 30 g L-1) ein Gleichgewicht zwischen Nährstoffverfügbarkeit und Stress bieten, was zu einem stabileren Wachstum führt. Diese Trends spiegeln die Auswirkungen von Vorverarbeitungsbedingungen und gestufter Anpassung auf die Kultur wider, da die allmähliche Exposition gegenüber zunehmender Substratkomplexität eine verbesserte physiologische Stabilität und reproduzierbares Wachstumsverhalten unterstützt. Niedrigere Konzentrationen begrenzen die Biomasseproduktion, während höhere Konzentrationen zu größerer Variabilität und verzögerter Stabilisierung führen.
Die morphologische Bewertung liefert einen qualitativen Indikator für den Anpassungsstatus. Positive Ergebnisse umfassen das Entstehen und Fortbestehen runder oder halb-enzyster Zellen mit verminderter Beweglichkeit, die auch bei wiederholter Subkultivierung intakt bleiben (Abbildung 5).
Im Gegensatz dazu zeigen suboptimale Kulturen, die meist mit Wildtyp-Stämmen oder frühen Anpassungsphasen assoziiert werden, abrupte Übergänge von verlängerten, beweglichen Zellen zu unregelmäßigen oder kollabierten Morphologien, die mit einer verminderten Wachstumsstabilität einhergehen.
Wenn das Protokoll auf weitere Maniok-Substrate wie Pulpa, Pellets und Schalen angewendet wird, zeigen angepasste E. gracilis-Kulturen reproduzierbares Wachstum über mehrere Substrattypen hinweg. Positive Ergebnisse zeichnen sich durch eine frühere Stabilisierung der Wachstumskurven und einen reduzierten Rückgang im späten Stadium im Vergleich zu Wildtypkulturen aus (Abbildung 6).
Suboptimale Ergebnisse umfassen verzögerte Wachstumsinitiation oder erhöhte Replikationsvariabilität, insbesondere in Substraten mit größerer physikalischer Heterogenität.
Eine erfolgreiche Umsetzung des Protokolls liefert E. gracilis-Biomasse mit messbarem Rohölgehalt, wie durch externe Laboranalysen mit der Verbrennungsmethode (Dumas) quantifiziert. Die in adaptierten Kulturen beobachteten Proteinanteile sind vergleichbar mit denen in Wildtypkulturen, wobei eine höhere Gesamtproteinproduktion einer erhöhten Biomassakkumulation entspricht (Abbildung 7).
Die Überwachung der Medienchemie unterstützte Kultur-Substrat-Interaktionen während der Anpassung und validierte die Einbeziehung von pH- und Cyanidmessungen in das Protokoll. pH-Werte zeigten allmähliche Veränderungen über die Zeit, was auf metabolische Aktivität und Substratnutzung hinweist, mit stabileren Trends in adaptierten Kulturen. Cyanidmessungen bestätigten dies weiter, da angepasste Kulturen Rückgänge nachweisbarer Werte zeigten, während Wildtypkulturen variabler blieben. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass diese Überwachungsschritte Veränderungen in der Medienchemie im Zusammenhang mit der Anpassung effektiv erfassen und die Interpretation der Kulturleistung unterstützen. Obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen nicht untersucht wurden, stellt dies ein wichtiges Forschungsfeld für zukünftige Forschungen dar, insbesondere für Anwendungen im industriellen Maßstab.
Der langfristige Erhaltungs- und Konsolidierungsworkflow unterstützte die fortgesetzte Lebensfähigkeit der angepassten Euglena gracilis-Linie über längere Kulturperioden. Kulturen, die durch wiederholtes Passieren erhalten wurden, behielten durchgehend Beweglichkeit, charakteristische Morphologie und stabiles Wachstumsverhalten über Erhaltungszyklen hinweg. Obwohl die langfristige Leistung nicht quantitativ bewertet wurde, liefern diese Beobachtungen repräsentative Hinweise darauf, dass die angepasste Linie unter den festgelegten Bedingungen zuverlässig erhalten werden kann.
Zusammen bestätigen diese Ergebnisse, dass das Anpassungsprotokoll robustes Wachstum, Lebensfähigkeit und Biomasseproduktion von E. gracilis über Maniok-basierte Substrate hinweg unterstützt, mit konstanter Leistung und über die Zeit reduzierten Cyanidwerten.
Alle Abbildungen und Tabellen werden als separate Dateien bereitgestellt und sind nicht im Manuskriptdokument eingebettet. Präferenzen für die Platzierung von Figuren und Tabellen werden im Manuskripttext mit Anmerkungen in Klammern angegeben (z. B. (Abbildung 1)). Sofern nicht anders angegeben, sollen alle Abbildungen und Tabellen in der endgültigen Veröffentlichung unterhalb des Abschnitts "Repräsentative Ergebnisse" erscheinen.
Alle Figuren werden als einzelne Dateien eingereicht, wobei mehrteilige Figuren als ein einziges kombiniertes Bild bereitgestellt werden. Mikroskopische Bilder enthalten in jedem Panel Maßstabsbalken. Die Datenabbildungen enthalten beschriftete Achsen mit definierten Messeinheiten, und Fehlerbalken sind in den entsprechenden Abbildungslegenden angegeben.
Alle Tabellen werden als einzelne .xls- oder .xlsx Dateien eingereicht und enthalten Roh- oder zusammengefasste numerische Daten ohne dekorative Formatierung.
<img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Abbildung 1: Wachstumsdynamik von E. gracilis, die bei 10, 20 und 30 gL-1 Garri unter vollständig dunklen Bedingungen kultiviert wurde. Die mittleren Zelldichten werden über die Zeit für jede Substratkonzentration gezeigt. Fehlerbalken repräsentieren SEM über biologische Replikaten hinweg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Abbildung 2: Wachstumsleistung von E. gracilis bei erhöhten Garri-Konzentrationen (30–50 g L-1). Zelldichte-Trajektorien zeigen Unterschiede in der Spitzendichte, dem Stabilisierungszeitpunkt und der Variabilität über höhere Substratkonzentrationen hinweg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Abbildung 3: Zellviabilitätstrends von E. gracilis, kultiviert bei 30 gL-1 Garri, gemessen durch Trypan Blue-Ausschluss. Der Anteil der lebensfähigen Zellen wird über die ausgewählten Zeitpunkte hinweg dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Abbildung 4: Viabilitätsschwankungen von E. gracilis , kultiviert bei höheren Garri-Konzentrationen. Vorübergehende Veränderungen der Zelllebensfähigkeit zeigen sich im Versuchszeitraum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig5.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
Abbildung 5: Repräsentative Morphologie adaptierter E. gracilis-Populationen . Repräsentative Bilder der invertierten Lichtmikroskopie zeigen abgerundete und halb-enzyste Zellen, die nach der Anpassung beobachtet wurden. Maßstabsleiste = XX μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Abbildung 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig6.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 6"> 
Abbildung 6: Wachstumsleistung von adaptierten und Wildtyp-E. gracilis über Maniok-abgeleitete Substrate. Wachstumspfade werden für angepasste und Wildtyp-Kulturen gezeigt, die auf mehreren Maniokprodukten kultiviert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig7.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 7"> 
Abbildung 7: Rohproteingehalt und Gesamtproteinproduktion der in Maniok gezüchteten E. gracilis-Biomasse . Der Proteingehalt wurde durch externe Analyse mit der SGS Combustion (Dumas)-Methode quantifiziert. Die gesamte Proteinproduktion wird zusammen mit der Biomassakkumulation angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig8.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 8"> 
Abbildung 8: Repräsentative Morphologie des Wildtyps E. gracilis unter Standardbedingungen (40-fache Vergrößerung). Repräsentatives Bild gesunder, nicht angepasster Euglena gracilis mit charakteristischer länglicher Morphologie unter Lichtmikroskopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>

Eine Methode zur Anpassung von Euglena gracilis an maniokbasierte Substrate für heterotrophe Kultivierung

Cassava processing generates nutrient-rich by-products that remain underutilized due to variable composition, cyanogenic compounds, and active microbial ...

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