Eine Methode zur Anpassung von Euglena gracilis an maniokbasierte Substrate für heterotrophe Kultivierung

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Anpassung neuer Euglena gracilis-Blätter an Maniokabfälle und auf die Untersuchung von Wachstum, Cyanidreduktion und proteinreicher Biomasseproduktion. Dieses Protokoll kann in der nachhaltigen Maniokverarbeitung, der Verwertung landwirtschaftlicher Abfälle, der Futtermittelproduktion und kostengünstigen Biotechnologiesystemen angewendet werden. Zu Beginn beschriften Sie sterile 500-Milliliter-Belüftungsflaschen mit dem Substrattyp Garri.

Markiere die entsprechende Zielkonzentration auf der Flasche. Beschriften Sie die Flasche mit der Replikationsidentifikation und dem geplanten Sterilisationszustand als autoklaviert oder nicht-autoklaviert. Legen Sie ein Wiegeboot auf die analytische Waage.

Nach dem Drücken von Tare wiege man die Garri, damit sie mit dem endgültigen Arbeitsvolumen übereinstimmen. Geben Sie die gewogenen Garri aseptisch in eine sterile 500-Milliliter-Flasche mit 300 Millilitern deionisiertem oder destilliertem Wasser. Setzen Sie den belüfteten Deckel auf jede Flasche wieder auf.

Jede Suspension drei Minuten lang verrühren, bis die Mischung homogenisiert ist. Wenn magnetisches Rühren verwendet wird, wird die Kolben auf eine Rührplatte gelegt und die Geschwindigkeit auf 200 G eingestellt, um einen flachen Wirbel ohne Spritzen zu bilden. Lassen Sie die Suspension 10 Minuten lang ungestört bei 25 Grad Celsius hydratieren.

Ziehen Sie den Entlüftungsdeckel unmittelbar vor der Gärung fest und bewegen Sie den Kolben fünfmal von Hand, um die Mischung sanft zu homogenisieren und das abgesetzte Material wieder aufzuhängen. Um zusätzliches Maniokproduktmedium herzustellen, werden die Kolben beschriftet und das Substrat wie zuvor demonstriert, um 30 Gramm pro Liter basierend auf dem Arbeitsvolumen zu erreichen. Das gewogene Substrat wird aseptisch in eine sterile Flasche mit 300 Millilitern deionisiertem oder destilliertem Wasser gegeben.

Setzen Sie den belüfteten Deckel auf jede Flasche wieder auf. Hydrieren und mischen Sie die Suspension wie zuvor demonstriert. Überprüfen Sie, dass die Flaschen mit einer sterilen, gasdurchlässigen Entlüftungskappe ausgestattet sind, um einen Gasaustausch zu ermöglichen und gleichzeitig Umweltkontamination zu minimieren.

Stellen Sie die Flaschen bei 25 Grad Celsius in einem bestimmten Bereich aufrecht auf, fern von direktem Sonnenlicht und starkem Luftstrom, und inkubieren Sie die Flaschen mindestens 72 Stunden ohne Rührung. Notieren Sie das Startdatum und die Uhrzeit der Gärung für jede Flasche und jeden Zustand. Überprüfen Sie, dass jede 500-Milliliter-Flasche nach der Gärung nicht mehr als 300 Milliliter Flüssigkeit enthält, um ein Überkochen während der Sterilisation zu verhindern.

Sobald der entlüftete Deckel in eine fingerfeste Position gelockert ist, klebt das Autoklaven-Indikatorband an der Kolben. Nachdem Sie die Kolben in ein autoklavensicheres Tray gelegt haben, setzen Sie das Tablett in das Autoklav und wählen Sie den P13-Flüssigkeitszyklus. Stellen Sie die Sterilisationsparameter für 30 Minuten auf 121 Grad Celsius für die Flüssigkeitssterilisation ein.

Starte den Autoklavenzyklus. Nachdem der Zyklus abgeschlossen ist, lassen Sie den Druck der Autoklavenkammer auf den atmosphärischen Druck zurückkehren und öffnen Sie die Autoklaventür langsam. Mit hitzebeständigen Handschuhen nehmen Sie die Flaschen ab und lassen Sie sie auf Zimmertemperatur abkühlen.

Lagern Sie die gekühlten Flaschen über Nacht bei Zimmertemperatur vor der Impfung. Verwenden Sie das fermentierte Maniokmedium direkt ohne Autoklaven, um native mikrobielle Gemeinschaften zu erhalten. Inokulieren Sie das nicht-autoklavierte Medium sofort nach der 72-stündigen Fermentationsphase, um unbeabsichtigte Umweltkontaminationen zu minimieren.

Halten Sie eine gleichmäßige Handhabung über Replikate hinweg aufrecht, indem Sie denselben Typ 500-Milliliter-Kondensatorflaschen, das gleiche Arbeitsvolumen und die gleiche Gärdauer für alle Substratbedingungen verwenden. Euglena gracilis in ein frisches heterotrophes Nährmedium inokulieren. Inkubieren Sie die Kulturen in völliger Dunkelheit bei 28 Grad Celsius mit kontinuierlichem Orbital-Schütteln bei 120G, bis die Kulturen ein mittleres logarithmisches Wachstum erreichen.

Untersuchen Sie mit einem Compound-Lichtmikroskop im Hellfeldmodus die Kulturen bei 100- bis 400-facher Gesamtvergrößerung und bestätigen die aktive Beweglichkeit, verlängerte Zellmorphologie und niedrige Betonungsgrade. Ausschließen Sie Kulturen mit übermäßigem Zellabfall, abnormaler Morphologie oder erhöhtem Beharren vor Anpassungsexperimenten. Nach vorsichtiger Homogenisierung der Starterkulturen durch Anziehen des Entlüftungsdeckels wirbeln Sie die Kolben von Hand für 15 Sekunden, um eine gleichmäßige Zellverteilung ohne Überspannung zu gewährleisten.

Bestimmen Sie mit einem Neubauer-Hämozytometer die Zelldichte. Nachdem die Kultur durch 15 Sekunden Wirbeln des Kolbens gemischt wurde, pipettieren Sie einen Milliliter Kultur in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Reinigen Sie das Hämozytometer und die Deckschicht mit 70 % Ethanol und lassen Sie das Hämozytometer sowie den Deckmantel an der Luft trocknen.

Pipettieren Sie 10 Mikroliter Kultur auf die beiden Gitter des Hämozytometers und legen Sie den Deckel auf die Nassprobe. Mit Brightfield-Mikroskopie mit einem 10-fachen Ziel konzentriert man sich auf das Gitter und zählt die Zellen innerhalb einer definierten Menge von Quadraten auf dem großen Gitter unter Anwendung der Standardgrenzregeln. Wiederholen Sie die Zellzählungen in der zweiten Kammer und berechnen Sie die mittlere Zellzahl pro Milliliter und die Zelldichte.

Stellen Sie das Impfvolumen so an, dass ein finales Inokulum von 5 % Volumen über alle experimentellen Medien hinweg erreicht wird. Bereiten Sie für jede Behandlungsbedingung separate Inokula vor, um die konstante Anfangszelldichte zwischen den Versuchsgruppen aufrechtzuerhalten. Gib das zubereitete E. gracilis inoculum zu autoklaviertem und nicht-autoklaviertem Maniok-Medien, das mit einer Endkonzentration von 10, 20 und 30 Gramm pro Liter zubereitet wurde.

Verwenden Sie gleiche Impfmengen über alle Behandlungsbedingungen, um die anfängliche Zelldichte zu standardisieren. Nach dem Anziehen des belüfteten Deckels wirbeln Sie den Kolben vorsichtig in einer kreisenden Bewegung für 15 Sekunden, um die Zellen zu verteilen. Inkubieren Sie die Kulturen in völliger Dunkelheit bei 25 Grad Celsius, um heterotrophes Wachstum einzuleiten.

Minimieren Sie die Bewegung des nicht-autoklavierten Mediums, um die native mikrobielle Gemeinschaftsstruktur und die Substratifizierung zu erhalten. Alle Kulturen einmal täglich mit sanftem manuellem Wirbel für 15 Sekunden mischen, um den Kontakt zwischen E.gracilis-Zellen und suspendiertem Maniokmaterial aufrechtzuerhalten. Mit einer sterilen Pipettenspitze entnehmen Sie alle 48 Stunden aseptisch eine Milliliterproben aus jeder Kultur.

Ziehen Sie die belüftete Kappe fest und bewegen Sie die Kulturflasche vorsichtig 15 Sekunden lang vor der Probenahme, um eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und suspendiertem Material sicherzustellen. Nachdem ein Aliquot der Kultur in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen wurde, wird die Probe bei Bedarf mit deionisiertem Wasser verdünnt, um die Visualisierung einzelner Zellen zu verbessern. Bereiten Sie einen Nassmontage-Objektträger vor, indem Sie 10 Mikroliter der verdünnten Probe auf einen sauberen Objektträger pipettieren und die Probe mit einem Deckmantel abdecken.

Mit einem zusammengesetzten Lichtmikroskop im Hellfeldmodus untersuchen Sie die Proben mit einer 100- bis 400-fachen Gesamtvergrößerung und bewerten Zellmotilität, Morphologie sowie die Häufigkeit des Beharrens als Indikatoren für den Anpassungsstatus. Alle sieben Tage wird aseptisch 20 % Volumen pro Volume jeder Kultur in frisch zubereitete Maniok-Medien mit denselben Garri-Konzentrations- und Sterilisationsbedingungen übertragen. Halten Sie das konstante Transfervolumen zwischen den Durchgängen aufrecht und wiederholen Sie die serielle Passierung, bis die Kulturen ein gleichmäßiges Wachstum, anhaltende Beweglichkeit und eine niedrige Insistenzhäufigkeit in 30 Gramm pro Liter Maniokmedium zeigen.

Nach der Anpassung an Maniok mit hoher Konzentration und vergleichender Wachstumsanalyse werden kolorimetrische Streifen verwendet, um Cyanidwerte zu beurteilen und die entwickelte Farbe zu beobachten. Nach der Zentrifugation wird Biomasse für die nachgelagerte Analyse erntet. Unter vollständig dunklen Kultivierungsbedingungen zeigten Kulturen mit 30 Gramm Garri pro Liter ein höheres integriertes Wachstum als niedrigere Konzentrationen.

Niedrigere Garri-Konzentrationen von 10 bis 20 Gramm pro Liter zeigten nachweisbares, aber reduziertes und variableres Wachstum. Höhere Konzentrationen von 40 bis 50 Gramm pro Liter erreichten erhöhte Zelldichtenspitzen, zeigten jedoch eine verzögerte Stabilisierung und größere Variabilität. Trypan-blaue Ausschlusstests zeigten, dass Kulturen, die bei 30 Gramm pro Liter Garri gehalten wurden, über die beprobten Zeitpunkte hinweg eine hohe Lebensfähigkeit behielten.

Höhere Garri-Konzentrationen zeigten vorübergehende Verringerungen der Lebensfähigkeit, gefolgt von teilweiser Erschütterung mit erhöhter Variabilität über die Zeit. Positive Ergebnisse umfassten abgerundete oder semi-insistierte Zellen mit verminderter Beweglichkeit, die über wiederholte Subkultivierung hinweg intakt blieben. Angepasste E.gracilis-Kulturen zeigten reproduzierbares Wachstum über mehrere Substrattypen hinweg und zeigten eine frühere Stabilisierung mit reduziertem Rückgang im späten Stadium im Vergleich zu Wildtypkulturen.

Die erfolgreiche Umsetzung des Protokolls ergab E. gracilis-Biomasse mit messbarem Rohproteingehalt, quantifiziert durch externe Laboranalysen mit der Verbrennungsmethode von Dumas. Die in adaptierten Kulturen beobachteten Proteinanteile waren vergleichbar mit denen in Wildtypkulturen gemessen, wobei eine höhere Gesamtproteinproduktion einer erhöhten Biomassakkumulation entsprach. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, Euglena-Wachstum, Cyanidreduktion, Biomasseproduktion und Ernährungspotenzial in verschiedenen maniokbasierten Umgebungen zu untersuchen.

Die entscheidende Herausforderung bei diesem Protokoll ist die Aufrechterhaltung einer stabilen Temperatur, konstanter Kulturbedingungen und einer ausgeglichenen mikrobiellen Gemeinschaft für das Euglena-Wachstum. Zukünftige Studien können dieses Protokoll optimieren und skalieren, den Proteinertrag verbessern und verschiedene industrielle Anwendungen mit unterschiedlichen Maniokabfallströmen in großem Maßstab testen.