Name: Zellfreie in-vitro mRNA-Translation in Drosophila-Lysaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Lernen Sie zellfreie in-vitro mRNA-Translation in Drosophila-Lysaten zur Untersuchung von Proteinsynthese und translationskontrolle. Diese Methode ermöglicht robuste Studien zur Genexpression in verschiedenen Drosophila-Arten.

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<table><tbody><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td>Standard Haushaltsaluminiumfolie; jede gleichwertige kommerzielle Marke akzeptabel.</td></tr><tr><td>Aminosäurenmischung</td><td>Promega</td><td>L4461</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Apfelessig</td><td>Heinz</td><td>N/A</td><td>Kommerzieller Apfelessig (5% Säure); jede gleichwertige Marke akzeptabel.</td></tr><tr><td>Apfel- oder Traubensaft</td><td>Jumex</td><td>N/A</td><td>Kommerzieller Traubensaft; oder jede gleichwertige kommerzielle Marke.</td></tr><tr><td>Bakteriologischer Agar&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9002-18-0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Borsäure (H3BO3)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>BioReagent, Molecular Biology Grade, &ge;99.5%, Pulver; zur Herstellung von TBE-Puffer verwendet.</td></tr><tr><td>Kappe: Anti-Reverse-Cap (ARCA): 3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)ppp(5&acute;)G RNA-Kappenstruktur</td><td>BioLabs</td><td>S1411S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Kappe: m7G(5')ppp(5')G RNA-Kappenstrukturanalog</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Kappe: Nicht-funktionelles Kappenanalogon G(5&acute;)ppp(5&acute;)A</td><td>New England Biolabs</td><td>S1406</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (15 ml)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430053</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Vollständiger, EDTA-freier Proteasehemmercocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Creatinphosphokinase aus Kaninchenmuskel</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>C-3755</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Creatinphosphorsäure, Dinatriumsalz</td><td>Merck</td><td>1120A47950</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Dehydrierte Bäckergärhefe</td><td>Fleischmann's</td><td>N/A</td><td>Kommerzielle aktive Trockenhefe; jede gleichwertige Marke akzeptabel.</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonat&nbsp;</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>97%(NNR)</td></tr><tr><td>DNA Clean &amp; Konzentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster Wildtypstamm Oregon-R</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USA</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu/index.html ; Mutantenstämme von Drosophila melanogaster sowie Wildtyp-Referenzstämme anderer Drosophila-Arten, wie virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, usw. werden ebenfalls von diesem Stock Center bereitgestellt.</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>ACS-Reagenz, 99,4-100,6%, Pulver; zur Herstellung von TBE-Puffer verwendet.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>SLBH4583V</td><td>99,5%(Titration)</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (H2O2)</td><td>Equate</td><td>N/A</td><td>Kommerziell (~2,5-3,5% Wasserstoffperoxidlösung; jede gleichwertige Marke akzeptabel.</td></tr><tr><td>In-vitro-Transkriptions-mMessage-mMachine-T7-, T3- oder SP6-Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1344 und AM1348</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KOAc, auch als KCH3COO bezeichnet</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Mehrere</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Lb-Bouillon (lennox)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Luzernase-Assay-System</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E1501</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MAXIscript T7, T3 oder SP6 in-vitro-Transkriptions-Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1316 und AM1312</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mg(OAc)2, auch als Mg(CH3COO)2 bezeichnet</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Mehrere</td><td>N/A</td></tr><tr><td>NaCl (Natriumchlorid)</td><td>J.T Baker&nbsp;</td><td>B17W53</td><td>ACS-Reagenz</td></tr><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Jede Firma</td><td>N/A</td><td>Sequenzspezifisch.</td></tr><tr><td>Pasive Lysis 5X-Puffer</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td>200 Mikroliter gelbe Spitzen.</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td>1ml blaue Spitzen.</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>T-300</td><td>0,5-10 Mikroliter klare Spitzen.</td></tr><tr><td>Propionsäure</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>79-09-04</td><td>ACS-Reagenzgrad, &ge;99,5%, flüssig.</td></tr><tr><td>PYREX&reg; 5 mL Glass Pestle Tissue Grinder</td><td>&nbsp; PYREX&reg;&nbsp;&nbsp;</td><td>7724-5</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QIAquick Gelextraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Kaninchenretikuozytenlysat (RRL)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>L4960</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Renilla-Lucerase (RLuc)-Assay-System</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2820</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNasin-Ribonuclease-Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2111A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNeasy Minielute RNA Clean up Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer-Dialysekassetten</td><td>Thermo Scientific</td><td>87735 (Es hängt jedoch von der molekularen Größenabtrennung ab).</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Natriumhypochlorit (Bleach)</td><td>Clorox</td><td>N/A</td><td>Kommerzielle Bleiche (~5-6% NaOCl); jede gleichwertige kommerzielle Marke mit ähnlicher Konzentration akzeptabel.</td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Merck</td><td>85558</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Edelstahlsieb</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Jeder kommerzielle Lieferant.</td></tr><tr><td>Taq plus Precision DNA-Polymerase</td><td>Stratagene</td><td>600211-51</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Transfer-Ribonucleinsäure (tRNA) aus Rinderleber Typ XI</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9014-25-9 oder R4752</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris (Tris-Base)</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70145</td><td>Molecular Biology Grade Pulver; zur Herstellung von TBE-Puffer verwendet.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SLBX9437</td><td>Labor

zellfreie in-vitro mrna-translation in drosophila-lysaten

Cell-Free In Vitro mRNA Translation In Drosophila Lysates

Zellfreie in-vitro mRNA-Translation in Drosophila-Lysaten

Cell-free mRNA in vitro translation has played a crucial role in the understanding of the protein synthesis process during gene expression across ...

Unsere Forschung verwendet ein zellfreies Translationssystem aus Drosophila, um die Proteinsynthese und die translationale Aufklärung in verschiedenen Entwicklungsstadien von Insekten zu untersuchen. Dieses Protokoll bildet im Gegensatz zu Lysaten entfernt verwandter Metazoen die in-vivo-Translationsereignisse, die spezifisch für die Insektenentwicklung sind, genau nach. Öffnen Sie zunächst die Benchling-Klonierungssoftware.Wählen Sie ein geeignetes Plasmid aus, um das Konstrukt, das einen fünf-Prime-unübersetzten Bereich, ein Firefly-Luciferase- oder Fluc-Reporter-Cistron, einen drei-Prime-unübersetzten Bereich und einen Polyadenylat- oder Poly(A)-Schwanz stromabwärts eines T7-Promotors enthält, einzufügen. Verwenden Sie die einzigartige Restriktionsstelle von KPN1 unmittelbar stromabwärts des Poly(A)-Schwanzes, um jedes Plasmidkonstrukt vor der Transkription zu linearisieren. Überprüfen Sie die sauberen, gut aufgelösten Spitzen der durch Sequenzierung erhaltenen Konstrukte, bevor Sie diese als Vorlage für die Transkription in vitro verwenden.Trennen Sie die linearisierte DNA durch 1 %ige Agarose-Gelelektrophorese bei 100 Volt für eine Stunde. Extrahieren Sie die linearisierte DNA

cell-free-in-vitro-mrna-translation-in-drosophila-lysates

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Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Wir beschreiben hier die Verfahren für die Extraktion und Reinigung von mRNA und Metaboliten...

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

Das Ziel dieser Publikation ist es, sichtbar zu machen und zu diskutieren, die operativen Schritte einer Enhanced Northern Blot-Protokoll auf RNA aus Drosophila melanogaster Embryonen entnommen, Zellen und Geweben. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für eine effiziente Erkennung von kleinen RNA-Spezies.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in Drosophila melanogaster

Die Kontrolle der Proteinsynthese erfolgt hauptsächlich im Initiationsschritt der Translation, dessen Mängel mit verschiedenen Störungen verbunden sind. Um ihre Ätiologie besser zu verstehen, haben wir hier ein Protokoll mit Xenopus laevis Eizellen beschrieben, das die Translation des mos-Transkripts in Gegenwart einer Mutante des Translationsinitiationsfaktors eIF4G1 bewertet.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) ist in der Lage, die zelltypspezifische Translation von mRNA zu erfassen. Hier berichten wir über das erste TRAP-Protokoll, das sich der Isolierung von mRNA in seltenen Zellpopulationen von Drosophila-Embryonen widmet.

TRAP-rc, Translating Ribosom Affinitätsreinigung von Rare Zellpopulationen<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Ziel dieses Protokolls ist es, einen direkten und kostengünstigen Ansatz für die Sammlung von Drosophila- Embryonen im mittleren Maßstab (0,5-1 g) und die Herstellung von Proteinextrakten, die in nachgeschalteten proteomischen Anwendungen verwendet werden können, wie Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS ).

Mittelmaßnahme Vorbereitung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoextrakte für Proteomversuche

Ein Tandem RNA Isolierung (Reise) für die Verwertung von endogen gebildeten mRNA-Protein-komplexe Vorgehensweise wird. Speziell, RNA-Protein-komplexe sind vernetzt in VivoPolyadenylated RNAs sind isoliert aus Extrakten mit oligo(dT) Perlen und besonderen mRNAs werden mit modifizierten RNA antisense Oligonukleotide erfasst. Proteine gebunden, mRNAs werden vom Immunoblot Analyse erkannt.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung, Detektion, Analyse und Verfolgung des endogenen mRNA-Handels in der lebenden Drosophila melanogaster Eikammer mit molekularen Baken, Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie und Open-Source-Analyse vor. software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für die Verwendung des RNA-Targeting-Enzyms Cas13D (RfxCas13D) in Fliegen.

Ubiquitäres und gewebespezifisches RNA-Targeting in Drosophila Melanogaster mittels CRISPR/CasRx

Dieser Artikel nimmt die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellt ein optimiertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen vor, ein entscheidender Schritt für die Entstehung transgener Fliegen.

Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese bei Drosophila

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