Bewertung der Wirkung von beschichteten Filtern und Vorfiltern auf die Infektivität und Konzentration des aerosolisierten Phi6-Virus

Wir untersuchen die Wirkung von Vorfiltern und antiviralen Beschichtungen bei der Verringerung der Infektionsfähigkeit und Konzentrationen von luftübertragenen Virusen in Innenräumen. Stromannäherungen verpassen realistische Luftstromdynamik. Unser Protokoll stellt Aerosolbedingungen nach und misst sowohl infektiöse Viren als auch die gesamte Viruslast.

Zu Beginn verdünnen Sie die gereinigte Phi6-Bakteriophagen-Suspension in einem 20-millimolaren Kaliumphosphatpuffer, der ein millimolares Magnesiumchlorid auf pH 7,2 enthält. Assembleren Sie alle Filter-, Vorfilter- und antiviralen Beschichtungsmaterialien im Biosicherheitsschrank, um die Oberflächentests durchzuführen. Bewertung der antiviralen Aktivität aller Beschichtungsmaterialien, die auf Kupfer- oder Kupfer- und Silber-aktiven Komponenten basieren, die in proprietären Matrizen eingebettet sind, nämlich A6, B4, VS und VS B, auf flachen Teststücken.

Anschließend pipettiert man 20 Mikroliter verdünnte Phi6-Bakteriophagen-Lagerlösung auf beschichtete Teststücke, um den Oberflächenviabilitätstest durchzuführen. Verteilen Sie die Probe gleichmäßig auf eine Fläche von zwei mal zwei Zentimetern mit einem sterilen Glasdreieck. Inkubieren Sie die Proben bei 22 Grad Celsius bis zu vier Zeitpunkten, darunter eine Minute, fünf Minuten, eine Stunde oder drei Stunden.

Gib 180 Mikroliter frische LB-Brühe auf die Oberfläche, um die Viren nach jedem Zeitpunkt wiederherzustellen. Waschen Sie die Oberfläche durch wiederholtes Pipettern 10 bis 20 Mal, um die Probe zu entnehmen. Benutze eine Plastik-Petrischale als Kontrollfläche.

Quantifizierung der antiviralen Wirksamkeit der Oberflächenbeschichtungen mittels Plaque-Assay zur Messung der Anzahl der infektiösen Viruspartikel und der quantitativen Polymerase-Polymerase-Kettenreaktion qRT-PCR zur Bestimmung der Kopienzahlen des viralen Genoms. Verdünnen Sie die zuvor gezeigte gereinigte und konzentrierte Phi6-Bakteriophagensuspension, um eine virale Konzentration im Bereich von 2,5 mal 10 potenzweise 10 bis 4,08 mal 10 potenzial von 11 plaquebildenden Einheiten pro Milliliter zu erhalten. Als Nächstes bauen Sie die experimentelle Aerosolkammer mit einem zylindrischen Glaskörper mit entsprechendem Deckel zusammen.

Setzen Sie das innere Metallgerüst in die Kammer ein und sichern Sie die Isolierdichtungen, um eine luftdichte Abdichtung zu gewährleisten. Verwenden Sie einen Vernebler in Kombination mit einer Luftpumpe, um einen stabilen und reproduzierbaren Eingang viraler Aerosole zu erzeugen. Titrieren Sie die im Vernebler verwendete Viruslösung vor und nach jedem Experiment, um die Stabilität zu überwachen.

Stellen Sie den Aerosoldurchfluss innerhalb der Kammer auf acht Liter pro Minute ein. Um die Luftfeuchtigkeit bei längeren Messungen zu reduzieren, richten Sie etwa drei Viertel des Aerosolflusses über einen hocheffizienten Partikelluftfilter (HEPA) zum Abgas. Lassen Sie das verbleibende Viertel des Durchflusses, also zwei Liter pro Minute, in die Kammer eintreten.

Verwenden Sie einen Trichter, um den Aerosolstrom zur Filter- oder Vorfilteroberfläche innerhalb der Kammer zu lenken. Entfeuchten Sie den ausgehenden Luftstrom mit einem Desikator, um den HEPA-Filter und den Durchflussmesser vor übermäßiger Feuchtigkeit zu schützen. Mit der externen Pumpe erzeugt man einen Unterdruck im System und unterstützt zusätzlich den Luftstrom, um einen effizienten Ablass durch den Auslass zu gewährleisten.

Bewerten Sie die antiviralen Eigenschaften von unbeschichteten oder VS-B-beschichteten Polyester- und Bulprenen-Vorfiltern zusammen mit doppelschichtigen Glasfasermaterialien innerhalb der Aerosolkammer. Um den antiviralen Effekt durch Impaktionsprobennahme zu bewerten, positionieren Sie eine Petrischale mit einem 20-millimolaren HEPES-Puffer bei pH 7,2 direkt unter dem Testvorfilter, um die Partikelabscheidung zu maximieren. Alternativ, um die antivirale Wirkung von GF2-Filtern zu testen, richten Sie einen dreifach-Düsen-Allglas-Wirbelimpinger auf, der mit einer externen Pumpe zur Aerosolabnahme verbunden ist.

Halten Sie den Luftstrom durch den Testvorfilter oder -filter mit zwei Litern pro Minute aufrecht. Erhöhen Sie den gesamten Lufteinfluss auf 10 Liter pro Minute mit einem zusätzlichen Ventil nach dem Kammerausgang. Aerosole werden in fünf Millilitern eines 20-millimolaren HEPES-Puffers erfasst.

Und fülle alle 30 Minuten den verdampften Puffer auf. Für die dreifache Probenahme führen Sie Kontrollläufe ohne Vorfilter oder Filter 15 Minuten vor und nach jedem Experiment durch. Nach dem Vor-Experiment-Kontrolllauf wird der Filter oder Vorfilter in die Kammer eingefügt und das System drei Stunden lang betrieben.

Sammeln Sie virale Aerosole, indem Sie alle 30 Minuten einen Milliliter Suspension aus Petrischalen mit 20 Millilitern Puffer gewinnen. Entfernen Sie den Filter und führen Sie einen Kontrolllauf nach dem Experiment durch. Entnehmen Sie während des Experiments alle 30 Minuten Proben, um jeweils acht qRT-PCR- und Titrationsproben pro Experiment zu erhalten.

Bei Impinger-Experimenten wird die Titrationsproben nur einmal am Ende der dreistündigen Laufzeit gesammelt. Verwenden Sie 800 Mikroliter der gesammelten Probe für die qRT-PCR-Analyse und die restlichen 200 Mikroliter für die Virustitration. Quick-freeze qRT-PCR-Proben in flüssigem Stickstoff und lagere sie bei 80 Grad Celsius.

Behandle sofort Virus-Titrationsproben mittels Plaque-Assay. Die Oberflächenviabilitätstests zeigten, dass alle getesteten Beschichtungen das Virus erfolgreich inaktivierten, wobei signifikante Reduktionen innerhalb der ersten fünf Minuten beobachtet wurden. Die kupferbasierte Oberflächenbeschichtung B4 erreichte die schnellste Reduktion, senkte die Infektionszählungen innerhalb von fünf Minuten um drei Größenordnungen und erreichte eine vollständige Inaktivierung mit einer Nachweisgrenze von unter 100 plaquebildenden Einheiten pro Milliliter um 15 Minuten.

Die A6-Beschichtung erreichte die vollständige Virusinaktivierung innerhalb von 25 Minuten und VS B innerhalb von 60 Minuten. Die VS-Beschichtung zeigte unter den getesteten Materialien die langsamste Inaktivierungsrate. Die untersuchten Pre-Filter BP6, S11 und FMR5 waren gleichermaßen wirksam darin, die Anzahl der infektiösen Viren zu senken und passierten sie um 1,5 bis 2 Größenordnungen im Vergleich zur Kontrolle ohne Filter.

Die GF2-Filter zeigten eine überlegene Leistung, senkten die Viruslast um mindestens sechs Größenordnungen, und es wurden keine infektiösen phi6-Virus-Plaques innerhalb des Nachweislimits nachgewiesen. Die VS-B-Beschichtung hatte im Vergleich zu unbeschichteten Vorfiltern keinen signifikanten Einfluss auf die Wirksamkeit der Filtration infektiöser Viren. Die qRT-PCR-Ergebnisse zeigten, dass Pre-Filter die Anzahl der Kopien des viralen Genoms um bis zu zwei Größenordnungen senkten.

Der GF2-Filter zeigte eine Verringerung von bis zu vier Größenordnungen im Vergleich zur Kontrolle ohne Filter. Während die Unterschiede zwischen Vorfiltern und Steuerung in den ersten 30 Minuten unbedeutend blieben, stieg die mechanische Filtereffizienz ab dem 60-Minuten-Punkt. Außerdem hatte die Anwendung der VS-B-Beschichtung keinen messbaren Einfluss auf die Anzahl der viralen Genome, die durch das Filtrationsmedium fließen.

Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die virale Inaktivierung, die Filtrationseffizienz und Unterschiede zwischen infektiösen Partikeln und der Gesamtvirallast zu quantifizieren. Eine zentrale Herausforderung ist die sehr kurze Kontaktzeit an der Virusoberfläche während des Luftstroms, was die Wirksamkeit antiviraler Beschichtungen einschränkt. Zukünftige Studien können die Kombination von Beschichtungen mit UV oder die Prüfung der Leistung in realen Belüftungssystemen und mit verschiedenen Viren erforschen.