CRISPR/Cas9-vermittelte endogene fluoreszierende Markierung keimbahnspezifischer Gene in Caenorhabditis elegans

Wir verwenden CRISPR-basierte endogene Markierung, um die Lokalisierung und Dynamik von Keimbahnproteinen in C. elegans zu untersuchen. Konventionelle Transgene können die Keimbahnexpression beeinflussen, aber dieses Protokoll markiert Proteine am endogenen Locus unter natürlicher Kontrolle. Zu Beginn identifizieren Sie die Kandidatengene mit vorherrschender Expression in der Gonade oder Keimzellen mithilfe öffentlicher Datenbanken und veröffentlichter Literatur.

Nachdem Sie den UniProt-Eintrag für das Zielprotein geöffnet haben, klicken Sie auf Struktur, um strukturelle Merkmale und Proteindomänen zu bewerten und eine geeignete fluoreszierende Markierungsstelle zu identifizieren. Scrollen Sie nach unten und öffnen Sie den AlphaFold-Datenbankeintrag, um die Modellkonfidenzwerte zu überprüfen. Klicken Sie auf Domains für spezifische strukturelle Klassifikationen.

Öffne als Nächstes die Zielgen-Seite in WormBase. Scrollen Sie nach unten und klicken Sie auf das Sequenzen-Widget sowie auf den Link zum primären Transkript, um die Transkriptseite zu öffnen. Scrollen Sie zum Abschnitt Sequenzen und klicken Sie auf die spezielle Option, um die zusammengeschnittene Sequenz des ausgewählten Transkripts anzuzeigen.

Auf der IDT CRISPA-Cas9 Guide RNA Design Tool-Webseite kopieren und fügen Sie die erste Exonsequenz des Zielgens von der WormBase-Seite ein und wählen Sie C, elegans im Dropdown-Menü Species für Guide-RNA oder gRNA-Design aus. Klicken Sie auf die DESIGN-Schaltfläche, um die oberste empfohlene gRNA-Sequenz und deren entsprechende PAM-Sequenz zu erhalten und zu überprüfen. Bei SnapGene wählen Sie Sequenz aus, um den Klonpunkt zwischen dem CeU6-Promotor und den gRNA-Gerüstregionen zu identifizieren.

Kopieren Sie die gRNA-Sequenz von der IDT-Tool-Seite, fügen Sie sie in das Einfüge-Dialogfeld ein und klicken Sie auf Einfügen, um den Abstandsleiter in das CRISPR-Expressionsplasmid zu integrieren. Um die Genauigkeit der gRNA-Einfügung zu bestätigen, wählen Sie die Sequenz aus und klicken Sie auf Anzeigen Ausrichtungen, um das Sanger-Sequenzierungsergebnis Basis für Basis mit der erwarteten Sequenz zu vergleichen. Um das Spenderplasmid zu konstruieren, kopieren Sie die genomischen Sequenzen des Homologiearms aus WormBase.

Füge in SnapGene die Sequenz ein und klicke auf Einfügen. Als Nächstes klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Einfügungsstelle, um das Fenster "Set DNA Color" zu öffnen und es auf Orange zu ändern, um die Verbindung zu markieren. Kopieren Sie die grüne fluoreszierende Protein- oder GFP-Insert-Sequenz und fügen Sie sie direkt an die markierte Position ein.

Dann klicke auf Funktion hinzufügen. Nennen Sie die Funktion GFP. Ändere die Anzeigefarbe auf grün und klicke OK, um die In-Silico-Donor-Plasmid-Assemblierung abzuschließen.

Um eine stille Substitution in die Donorplasmid-Vorlage einzuführen, um das Wiederschneiden von Cas9 nach der Integration zu verhindern, kopieren Sie den 19-Nukleotid-gRNA-Spacer vom Expressionsvektor. Im Tab Spenderplasmid fügen Sie die Sequenz in die Suchleiste "Find DNA-Sequenz" ein, um die Zielstelle zu finden und die spezifische Nukleotidposition auszuwählen, die mutiert werden soll. In Base ersetzen geben Sie neues Nukleotid ein und klicken Sie auf Einfügen.

Rechtsklicke auf die modifizierte Basis und verwende Set DNA Color, um die Farbe auf Rot zu ändern. Richten Sie die Sanger-Sequenzierungsergebnisse des Spenderplasmids mit der erwarteten Sequenz aus, um die Integrität zu bestätigen. Bereiten Sie die Injektionsmischung vor, indem Sie das CRISPR-Expressionsplasmid, das Donor-Plasmid und Co-Injektionsmarker in sterilem doppelt destilliertem Wasser zu einem Endvolumen von 10 Mikrolitern bei der angegebenen Konzentration kombinieren.

Anschließend wird die Mischung bei 10.000 g für 10 bis 20 Minuten zentrifugiert, um das Partikel herauszufiltern und eine Verstopfung der Mikroinjektionskapillare zu verhindern. Verwenden Sie einen Nadelzieher, um Mikroinjektionsnadeln aus Glaskapillaren mit langer Spitze und scharfer Spitze herzustellen, die für die Gonadeninjektion geeignet sind, während die Polarwerte empirisch optimiert werden. Erhitze eine Mikrokapillarpipette und knipse sie in zwei Teile, um ein Ladewerkzeug zu schaffen.

Befestigen Sie eine Gummi-Aspiratorbulbe am breiten Ende der verkürzten Mikrokapillarpipelette. Saugen Sie etwa einen Mikroliter Injektionsmischung in den Ladegerät. Stecken Sie den Ladegerät in das hintere Ende der Injektionsnadel und geben Sie die Injektionsmischung vorsichtig ab.

Legen Sie die geladene Nadel 10 Minuten waagerecht, um eine durchgehende Säule zu bilden, und lassen Sie die Lösung zur Spitze hin absinken. Stellen Sie die Nadel am Einspritzmikroskop fest und bringen Sie die Spitze mit Hellfeldoptik in den Fokus. Öffnen Sie die Nadelspitze durch sanften Kontakt mit dem Rand eines Deckungsschleppers in Halocarbonöl und überprüfen Sie den Durchfluss.

Um die Würmer für die Injektion zu kultivieren, halten Sie die N2-Wildtyp-Würmer auf OP50-Bakteriensamen-Medienplatten. Wählen Sie Hermaphroditen im L4-Stadium von einer gesunden Platte aus und inkubieren Sie bei 20 Grad Celsius für 10 Stunden, um junge Erwachsene mit gut entwickelten Keimlinien zu erhalten. Übertragen Sie die Würmer auf eine unbesaitete Platte, um den bakteriellen Überschuss zu reduzieren.

Bereite ein trockenes 2%-Agarose-Pad auf einem Glasdias vor. Und trage einen Tropfen Halokarbonöl auf. Verwenden Sie einen Wimpernpicker, um einen Wurm auf das Agarose-Pad zu übertragen und zu immobilisieren.

Verwenden Sie ein Objektiv mit niedriger Vergrößerung, um die Gonade für die Injektion auszurichten. Verwenden Sie Mikromanipulatoren, um die Nadel in einem Winkel von 20 bis 40 Grad relativ zum Wurm zu positionieren. Verwenden Sie eine hohe Vergrößerung, um auf die distale Keimlinie zu fokussieren.

Schieben Sie den Wurm auf die Nadel und positionieren Sie die Spitze innerhalb des gonadalen Syncytiums. Injizieren Sie die Lösung, bis die Gonade anschwillt. Ziehen Sie die Nadel heraus und positionieren Sie sie für weitere Injektionen.

Füge M9-Puffer hinzu, um das Agarose-Pad zu erweichen und teilweise zu zerbrechen, um Würmer freizusetzen. Übertragen Sie jeden Wurm auf eine individuelle Erholungsplatte. Dann wiederhole ich die Injektionen für 20 bis 25 Würmer.

Screenen Sie F1-Nachkommen auf Co-Injektionsmarker und wählen Sie markerpositive Tiere aus. Übertragen Sie jeden F1-Wurm auf einen einzelnen Teller und lassen Sie ein bis zwei Tage für die Eiablage ein. Lyse jeden F1-Wurm im Proteinase-K-Puffer, um PCR-Vorlagen vorzubereiten.

Führen Sie eine Junction-PCR mit einem genomischen Primer außerhalb des Homologiearms und einem internen Tag-Primer durch. Und die entsprechenden Platten von PCR-positiven F1-Tieren zu behalten. Isolieren Sie F2-Nachkommen von PCR-positiven F1-Linien auf einzelne Platten, um Nachkommen zu erzeugen.

Lyse Erwachsene zur Genotypisierung. Führen Sie PCR mit Primern an den Homologiearmen durch, um Wildtyp- und Knock-in-Allele nach Produktgröße zu unterscheiden. Verwenden Sie das SnapGene-Tool, um die korrekte Integration sowohl an der linken als auch an der rechten Einführungsstelle zu überprüfen und zu validieren, indem die Sanger-Sequenzierungsergebnisse mit der erwarteten bearbeiteten genomischen Sequenz abgestimmt werden.

Verwenden Sie Fluoreszenzmikroskopie, um die Keimbahnexpression und -lokalisierung zu überprüfen. Erweiterte bestätigte homozygot Linien. Bestände aufbewahren und validierte Leitungen für die Langzeitlagerung als Kryopreserven vorbereiten.

PCR-basierte Screening von F1-Nachkommen zeigte erfolgreiche Knock-ins, identifiziert durch 1.550-Basenpaar-Junction-PCR-Amplikon mit einem flankierenden genomischen und einem internen GFP-Primer. Das Fehlen des Bandes von 1.550 Basenpaaren bei den meisten F1-Tieren deutete auf keine nachweisbare Zielintegration hin, was mit einer nicht-integrativen DNA-Übertragung statt einer homologiegesteuerten Reparatur übereinstimmt. Die Bestimmung der Zygotiosität bei F2-Nachkommen, die aus PCR-positiven Linien der Junction abgeleitet sind, unterscheidet Allele nach Bandgröße: 1.345 Basenpaare als Wildtyp-Allel und 2.344 Basenpaare als Knock-in-Allel.

Heterozygoten zeigen beide Bands. Homozygot Knock-in-Samples fehlt das Wildtyp-große Band, und die Proben mit fehlgeschlagener Integration zeigen nur das Wildtyp-große Produkt. Eine weitere Validierung der homozygoten GFP-Knock-in-Linie erfolgte mittels konfokaler mikroskopischer Bildgebung, bei der GFP-Fluoreszenz in den Keimbahnzellen mit im spermatogenes Bereich angereicherten Signalen beobachtet wurde.

Dieses Protokoll ermöglicht eine in-vivo-Analyse der Proteinlokalisierung und -dynamik in der Keimbahn von C. elegans. Ein sorgfältiges Tag-Design und eine gründliche Validierung sind unerlässlich, um die Proteinfunktion zu erhalten und falsch-positive Kandidaten zu minimieren. Zukünftige Studien können diesen Workflow nutzen, um die Proteinlokalisierung zu verfolgen und potenzielle Wechselwirkungen während der Keimbahnentwicklung zu untersuchen.