Name: CRISPR/Cas9-vermittelte endogene fluoreszierende Markierung keimbahnspezifischer Gene in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-29T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Lernen Sie CRISPR/Cas9-basierte endogene Fluoreszenzmarkierung für Keimbahnproteine in Caenorhabditis elegans. Dieses Protokoll ermöglicht stabile Knock-in-Allele unter nativer Kontrolle für präzise Lokalisationsstudien.

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	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+a+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 1-16 (2013).</li><li>Ebbing, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+transcriptomics+of+C.+elegans+males+and+hermaphrodites+identifies+sex-specific+differences+in+gene+expression+patterns.">Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns.</a> Dev Cell. 47 (6), 801-813.e6 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+single-cell+architecture+of+gene+expression+in+Caenorhabditis+elegans+germ+cells.">Spatiotemporal single-cell architecture of gene expression in Caenorhabditis elegans germ cells.</a> Cell Discov. 11 (1), 26 (2025).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Fire, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+silencing+and+the+maintenance+of+a+functional+germline+in+Caenorhabditis+elegans.">Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 125 (13), 2451-2456 (1998).</li><li>Robert, V. J., Sijen, T., van Wolfswinkel, J., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+RNAi+factors+protect+the+C.+elegans+germline+against+repetitive+sequences.">Chromatin and RNAi factors protect the C. elegans germline against repetitive sequences.</a> Genes Dev. 19 (7), 782-787 (2005).</li><li>Merritt, C., Seydoux, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+solutions+for+the+germline.">Transgenic solutions for the germline.</a> WormBook. , 1-21 (2010).</li><li>Fr&#x00F8;kj&#x00E6;r-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans.">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).</li><li>Vallin, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+collection+of+Mos1+transposon+insertion+mutants+for+the+C.+elegans+research+community.">A genome-wide collection of Mos1 transposon insertion mutants for the C. elegans research community.</a> PLoS One. 7 (2), e30482 (2012).</li><li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination.">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Nance, J., Fr&#x00F8;kj&#x00E6;r-Jensen, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+transgenic+toolbox.">The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox.</a> Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+to+study+spermatogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Protocol for CRISPR-Cas9-mediated genome editing to study spermatogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102720 (2023).</li><li>Khan, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+ligation-independent+cloning+system+for+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+in+plants.">A highly efficient ligation-independent cloning system for CRISPR/Cas9-based genome editing in plants.</a> Plant Methods. 13, 86 (2017).</li><li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748 (2021).</li><li>Rieckher, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+microinjection.">Caenorhabditis elegans microinjection.</a> Bio Protoc. 7 (19), e2584 (2017).</li><li>Medley, J. C., Hebbar, S., Sydzyik, J. T., Zinovyeva, A. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+substitutions+effectively+block+Cas9+and+allow+for+scarless+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Single nucleotide substitutions effectively block Cas9 and allow for scarless genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 220 (1), iyab199 (2022).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833 (2008).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum.">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li><li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting.">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Sci Rep. 6, 20889 (2016).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NATF+(native+and+tissue-specific+fluorescence):+a+strategy+for+bright,+tissue-specific+GFP+labeling+of+native+proteins+in+Caenorhabditis+elegans.">NATF (native and tissue-specific fluorescence): a strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).</li><li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans.">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. 121-122, 86-93 (2017).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Beijing Lablead Biotech Co., Ltd.</td><td>QZ02</td><td>Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>NOVON</td><td>ZZ14011</td><td>Herstellung von 2% Agarose-Pflaster</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans Stamm N2&nbsp;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Injektions-Hintergrundstamm</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td>Klärung der Injektionsmischung</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Beijing Chemical Reagents Company</td><td>57-88-5</td><td>Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten</td></tr><tr><td>Co-Injektionsmarker-Plasmid rol-6 (su1006) (pRF4)</td><td>Guangshuo Ou Lab</td><td></td><td>Roller-Marker zur Anreicherung von Kandidaten</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>ZEISS</td><td>LSM880 + Airyscan</td><td>Validierung der GFP-Expression/-Lokalisierung</td></tr><tr><td>Di-Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7758-11-4</td><td>Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten</td></tr><tr><td>Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7558-79-4</td><td>Komponente zur Herstellung von M9-Puffer</td></tr><tr><td>DNA-Leiter</td><td>Mei5 Biotechnology, Co., Ltd.</td><td>MF288-01</td><td>Größenreferenz für Agarose-Gels</td></tr><tr><td>Donor-Plasmid-Backbone (pPD95.75)</td><td>Addgene</td><td>1494</td><td>Backbone für HDR-Donor-Konstruktion</td></tr><tr><td>Elektrophorese&nbsp; System</td><td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>112-0630</td><td>Trennung von PCR-Amplikomen auf Agarose-Gelen für die Überprüfung der Junction und die Genotypisierung der Zygosität</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50 Stamm</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Nahrungsquelle für Würmer</td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Co-Injektionsmarker-Plasmid (pPD122.11)</td><td>Fire Lab</td><td></td><td>GFP-Co-Marker zur Anreicherung von Kandidaten</td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Stereomikroskop</td><td>SOPTOP</td><td>SZX12-HT</td><td>Screening lebender Würmer auf fluoreszierende Co-Injektionsmarker</td></tr><tr><td>GelRed Nukleinsäure-Gel-Färbemittel</td><td>Mei5 Biotechnology, Co., Ltd.</td><td>MF079-plus-01</td><td>Visualisierung von DNA-Banden</td></tr><tr><td>Glaskarotten</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Verwendet mit Nadelzieher zum Herstellen von Injektionsnadeln</td></tr><tr><td>Halocarbonöl 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898-50ML</td><td>Verhinderung der Austrocknung während der Injektion</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Wuhan Ruihua Instrument &amp; Equipment Co., Ltd.</td><td>HP400S</td><td>Erhaltung der Würmer bei Standardtemperatur</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (MgSO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7487-88-9</td><td>Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten und M9-Puffer</td></tr><tr><td>Mikrokapillarpipetten</td><td>KIMBLE</td><td>71900-50</td><td>Erhitzt und gebrochen, um ein Beladewerkzeug herzustellen</td></tr><tr><td>Mikroinjektoreinheit</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet 4i</td><td>Übertragen von kontrollierten Druckimpulsen der Injektionsmischung in die distale Gonaden über eine Mikroinjektionsnadel (fußpedalgesteuert)</td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckgläser</td><td>Fisherbrand</td><td>12545A 22&times;30-1</td><td>Herstellung von 2% Agarose-Pflaster für das Montieren und Immobilisieren von Würmern während der Mikroinjektion; Offene Injektionsnadelspitzen gegen den Deckglasrand</td></tr><tr><td>Mikroskop für Mikroinjektion</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer.A1</td><td>Injektionsmikroskop</td></tr><tr><td>Nadelzieher</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Modell P97</td><td>Ziehen von Glaskarotetten in Injektionsnadeln</td></tr><tr><td>PCR-Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>PCR-Amplifikation</td></tr><tr><td>pDD162 (Peft-3::Cas9 + leeres sgRNA)</td><td>Addgene</td><td>47549</td><td>Cas9 + sgRNA-Expression</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Gibco</td><td>308723</td><td>Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten</td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)&nbsp;</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7778-77-0</td><td>Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten und M9-Puffer</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7647-14-5</td><td>Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten und M9-Puffer</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Motic</td><td>K400L</td><td>Aufheben und Montieren von Würmern auf Agarose-Pflastern und Durchführung der Nachbehandlungsschritte nach der Injektion</td></tr></tbody></table>

crispr/cas9-vermittelte endogene fluoreszierende markierung keimbahnspezifischer gene in caenorhabditis elegans

CRISPR/Cas9-mediated Endogenous Fluorescent Tagging of Germline-specific Genes in Caenorhabditis elegans

CRISPR/Cas9-vermittelte endogene fluoreszierende Markierung keimbahnspezifischer Gene in Caenorhabditis elegans

Protein localization in the Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is central to interpreting gene function during gametogenesis, yet conventional ...

crisprcas9-mediated-endogenous-fluorescent-tagging-germline-specific

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

Dieses Video beschreibt die Mikroinjektion, eine gängige Methode zur Herstellung transgener C. elegans-Stämme. Im Beispiel sehen wir, wie die Mikroinjektion verwendet wird, um einen Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex für die Genbearbeitung auf CRISPR-Basen einzuführen.

Gonaden-Mikroinjektion: Eine Methode zur direkten Verabreichung von Verbindungen in die Keimbahn von C. elegans

Hier präsentieren wir eine Methode, um das Genom von C. Elegans Ingenieur CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins und Homologie abhängigen Reparatur Vorlagen.

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie eine Protein nuklearen Translokation unter Hitzestress nachverfolgen mithilfe eine grüne Fluoreszenz-Protein (GFP)-Fusionsprotein als Marker und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Färbung. Das DAPI Färbeprotokoll rückt und bewahrt die GFP und Protein subzelluläre Lokalisation Signale.

Erkennung von Protein subzelluläre Lokalisation durch grüne Fluoreszenz Protein Tagging und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole Färbung in Caenorhabditis elegans

Hier beschrieben ist, dass ein Protokoll für die Markierung von endogen Proteine mit fluoreszierenden Tags in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9 ausgedrückt. Vermeintlich bearbeitete Zellen werden bereichert durch Fluoreszenz aktiviert Zellsortierung und klonale Zell-Linien entstehen.

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

Ziel dieses Protokolls ist es, eine nahtlose CRISPR/Cas9-Bearbeitung des C. elegans-Genoms unter Verwendung von zusammengesetzten Ribonukleoproteinkomplexen und dem dpy-10-Co-CRISPR-Marker für das Screening zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von genetischen Modifikationen in C. elegans vorzunehmen, einschließlich Insertionen, Deletionen, Genersatz und Codon-Substitutionen.

CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Hier stellen wir ein vereinfachtes endogenes Gen-Tagging-Protokoll für Drosophila vor, das eine PCR-basierte Technik zur markerfreien Identifizierung erfolgreicher genetischer Veränderungen verwendet und die Entwicklung stabiler Knock-in-Linien erleichtert.

Einstufige CRISPR-basierte Strategie zur endogenen Genmarkierung in Drosophila melanogaster

Dieses Protokoll beschreibt einen RNA-Interferenz- und ChIP-Assay zur Untersuchung der epigenetischen Vererbung von RNAi-induziertem Silencing und damit verbundenen Chromatinmodifikationen in C. elegans.

Analyse der transgenerationalen epigenetischen Vererbung in C. elegans mittels Fluoreszenzreporter und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

Die Arbeit beschreibt die Optimierung von Fluoreszenzmikroskopie-Erfassungsparametern, um den axonalen Transport von endogenen markierten Frachten mit Einzelneuronenauflösung in einem lebenden Fadenwurm sichtbar zu machen.

Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports endogener Fracht durch Fluoreszenzmikroskopie bei lebenden Caenorhabditis elegans

Die AviTag-spezifische standortbeschränkte Beleuchtungsverstärkte Biotinylierung (ALIBi) ist eine neuartige optogenetetisch aktivierte Methode, die zur Markierung und Affinitätsreinigung subzellulärer Populationen von Ribosomen für die nachgelagerte Sequenzierung und proteomische Analyse entwickelt wurde.

Isolierung subzellulärer Ribosom-Subpopulationen basierend auf rekombinanten, peptid-tag-spezifischer, ortsbeschränkter Beleuchtungsverstärkter Biotinylierung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Markierung von Proteinen mit einem Fluoreszenzprotein-Tag in Zebrafischlarven vor, ein neu entwickeltes und modifiziertes in vivo-System , das besonders nützlich für die Visualisierung von Proteinen mit geringer Abundanz im Zebrafisch ist.

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Lernen Sie CRISPR/Cas9-basierte endogene Fluoreszenzmarkierung für Keimbahnproteine in Caenorhabditis elegans. Dieses Protokoll ermöglicht stabile Knock-in-Allele unter nativer Kontrolle für präzise Lokalisationsstudien.

CRISPR/Cas9-vermittelte endogene fluoreszierende Markierung keimbahnspezifischer Gene in Caenorhabditis elegans

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