Ein stromlinienförmiges Protokoll für Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie in Arabidopsis-Kernen

Meine Forschung konzentriert sich auf die Epigenom-Editierung und die Visualisierung der Chromatinorganisation in Arabidopsis-Kernen mittels Superauflösungsmikroskopie. Bestehende Methoden sind nicht an die STORM-Bildgebung angepasst. Dieses Protokoll verbessert die Reinheit der Kerne, die Konsistenz der Markierung, die Probenmontage und die Bildgebungsstabilität.

Er gilt für Arabidopsis thaliana und andere Pflanzensysteme zur Untersuchung der Kernorganisation, der Chromatinstruktur und der Epigenetik in hoher Auflösung. Zu Beginn stellen Sie eine Kulturplatte mit sechs Brunnen unter die Abzugshaube auf Eis. Mischen Sie die Fixationslösung mit 4 % Volumen, methanolstabilisiertem Formaldehyd 0,1 % Triton X100 und PBS.

Geben Sie etwa vier Milliliter Eiskalte Fixierungslösung zu jedem Brunnen unter der Abzugshaube. Entfernen Sie mit sauberer Pinzette die Arabidopsis-Setzlinge, die zwischen acht und fünfzehn Tage nach der Keimung geboren sind, aus massivem halbstarkem Murashige und Skoog, oder MS Medium. Tauchen Sie die Setzlinge sofort in die Fixierungslösung und setzen Sie etwa 20 Setzlinge pro Bohrloch.

Verwenden Sie drei Brunnen, um ausreichend Material pro Probe zu erhalten. Stelle die Platte in die mit Eis gefüllte Vakuumkammer und schließe sie. Tragen Sie 15 Minuten lang einen Vakuumzyklus zwischen minus 0,6 bar und minus 0,8 bar auf, um die eingeschlossene Luft zu entfernen und das Fixierungsmittel tief in das Pflanzengewebe einzudringen.

Dann lässt du das Vakuum langsam los. Rühren Sie die Probe zusammen und wenden Sie das Vakuum weitere 15 Minuten an. Unter der Damphaube entferne du die Fixierungslösung mit einer Pipette.

Waschen Sie jeden Brunnen jeweils dreimal für 10 Minuten unter sanftem Rühren mit fünf Millilitern eiskaltem PBS. Nach dem Waschen entferne ich das PBS. Mit einer Zange wird das fixierte Gewebe in eine 120 mal 120 Millimeter große Petrischale übertragen und 50 Mikroliter Kernisolierungspuffer zu den fixierten Setzlingen gegeben.

Mit einer Klinge schneiden Sie das feste Gewebe ab. Mit derselben Klinge kratzen Sie das gehackte Taschentuch an einer Kante der Petrischale. Gib 600 Mikroliter Kern-Isolationspuffer hinzu und wasche etwaches Gewebe ab, das an der Klinge haften bleibt.

Den Gewebeschlamm in ein zwei-Milliliter-Dounce-Homogenisierrohr übertragen und mit dem kleineren Stößel fünf- bis zehnmal abstreichen. Dann streichelt man mit dem größeren Stößel, bis er sich im Rohr sanft bewegt, was typischerweise fünf bis zehn Schläge erfordert. Filtern Sie die homogenisierte Probe durch einen 30-Mikrometer-Gitterfilter in ein 50-Milliliter-Rohr.

Übertragen Sie das Filtrat in ein frisches 1,5-Milliliter-Rohr. Zentrifugieren Sie die Aufhängung für 10 Minuten bei 800 G, wobei die niedrigste Rampe sowohl für Beschleunigung als auch für Abbremsung verwendet wird. Nach der Zentrifugation ist ein kleiner weißer Pellet zwischen den grünen Geweberesten sichtbar.

Entsorge den Überstandsstoff und suspendiere das Pellet wieder in 600 Mikrolitern Kern-Isolationspuffer. Zentrifugiere erneut für 10 Minuten bei 800 G und entferne das Supernatantum. Nach vollständigem Abwaschen des grünen Abfalls wird die isolierte Kernsuspension maximal eine Woche bei vier Grad Celsius gelagert und die Kerne mit den gewünschten Antikörpern immunfärbt.

Erhitze die 1,5%-Gewichts-Volumen-niedrigschmelzende Agaroselösung bei 90 Grad Celsius für eine Minute, um das Pulver aufzulösen und eine klare Lösung zu erhalten. Vortex kurz, um eine vollständige Mischung sicherzustellen. Kühlen Sie die Lösung ab und halten Sie sie bei 37 Grad Celsius, bevor Sie fortfahren, um eine Wärmedenaturierung des Glukoseoxidasepuffers zu vermeiden.

Nachdem die niedrigschmelzende Agaroselösung 37 Grad Celsius erreicht hat, bereiten Sie den STORM-Puffer vor, indem Sie 100 millimolare Mercaptatothylamin- und Glukoseoxidasepuffer zur niedrigschmelzenden Agarose hinzufügen, um eine Endkonzentration von 1-fach zu erreichen, und die Lösung vorsichtig mischen. Geben Sie 10 Mikroliter des Kerngemisch auf eine ozonbehandelte 1,5-Hour-Deckschicht, die 20 Minuten lang in einem ultravioletten Ozonreinigungssystem behandelt wurde. Warten Sie drei Minuten, damit sich die Kerne auf dem Deckungsbezug ablagern können.

Entferne dann die überschüssige Flüssigkeit und warte zwei Minuten. Geben Sie 10 Mikroliter der zubereiteten, niedrigschmelzenden Agarose auf den Deckel und decken Sie sofort mit einem Objektträger ab. Versiegeln Sie den Deckel mit Silikondichtmittel.

Mische gleiche Mengen von Lösung A und Lösung B in einer kleinen Petrischale mit einer Mikropipettenspitze. Tragen Sie die Mischung über die Ränder des Deckels auf, um die Probe abzudichten. Lass das Silikon-Dichtmittel fünf Minuten lang aushärten.

Stellen Sie das Objektprobe am Mikroskop fest und finden Sie den Fokus. Lokalisieren und konzentrieren Sie sich auf einen Kern. Aktivieren Sie ein fokussierendes Modul, wenn verfügbar, um Stabilität bei langen Akquisitionen zu gewährleisten.

Wählen Sie eine Region, in der ein oder mehrere Nanodiamanten in der Nähe des Kerns positioniert sind, um die Driftkorrektur während der Rekonstruktion zu verbessern. Für die Zweifarbabbildung beginnen Sie mit der Aufnahme mit dem längeren Wellenlängenkanal und wechseln Sie dann zum kürzeren Wellenlängenkanal, um die Bildgebung abzuschließen. Verarbeiten Sie die rohen Bildstapel in ThunderSTORM mit Gaußscher Anpassung und gewichteter Kleinste-Quadrat-Schätzung und generieren Sie rekonstruierte Bilder.

Filterung basierend auf Sigma und Unsicherheit unter 30 Nanometern anwenden, um genaue Lokalisierungen zu erhalten und Rauschen zu entfernen. Führen Sie schließlich eine Sample-Drift-Korrektur mit ThunderSTORM-Kreuzkorrelation oder dem COMET-Algorithmus durch und bestätigen Sie minimale Drift in den rekonstruierten Bildern. Die Kerne wurden aus 15 Tage alten Wildtyp-Setzlingen isoliert, die mit AF647-konjugierten sekundären Antikörpern immunmarkiert und mit Hoechst H33258 gegenfärbt wurden.

Konfokale Bildgebung zeigte mehrere isolierte und gut erhaltene Kerne mit minimalen Ablagerungen, wobei Chromozentren und der Nukleolus klar erkennbar waren. Das RNA-Polymerase-II-Signal fehlte aus den Chromozentren und dem Nukleol. Diffractionsbegrenzte Maximalintensitätsprojektionen und entsprechende SMLM-Rekonstruktionen zeigten strukturelle Details der RNA-Polymerase II und der DNA-Markierung, einschließlich vergrößerter Interessenbereiche mit feineren Strukturen.

Lokalisationsfilterung basierend auf Sigma und Unsicherheit verbesserte die Definition sowohl der RNA-Polymerase II- als auch der DNA-Signale im Vergleich zu den detektierten Lokalisationen. Und weitere Verfeinerungen nach der Driftkorrektur hielten diese verbesserte Struktur erhalten. Das Filtern basierend auf Sigma-Werten entfernte Lokalisierungen mit übermäßig kleinen oder großen angepassten Breiten.

Die Fourier-Ringkorrelationsanalyse zeigte, dass sich die Auflösung im AF647-Kanal nach dem Filtern von 90,1 auf 47,7 Nanometer verbesserte, während der JF549-Kanal von 56,6 auf 27,9 Nanometer verbessert wurde. Die Aufrechterhaltung der Kernintegrität bei gleichzeitiger Minimierung von Ablagerungen und Hintergrundfluoreszenz ist entscheidend für die Erreichung hochwertiger Einzelmolekülbildgebung. Zukünftige Studien können die Kernarchitektur mit der Genregulation unter Umwelt- oder Entwicklungsbedingungen verknüpfen.