Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskulatur und Knochenmark mittels Größenausschlusschromatographie
23. Juni 2026
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskeln und Knochenmark mittels enzymatischer Verdauung und Größenausschlusschromatographie, wodurch reproproduzierbare Rückgewinnung von vesikelangereicherten Fraktionen aus strukturell komplexen, leistungsarmen Geweben für die nachgelagerte molekulare Analyse ermöglicht wird.
Unsere Forschung konzentriert sich darauf, kleine extrazelluläre Vesikel aus Mausmuskeln und Knochenmark zu isolieren, um zu verstehen, wie Gewebe Signale austauscht. Dieses Protokoll kann auf Studien angewandt werden, die sich mit Altern, Muskelregeneration, Bewegungsphysiologie und Knochenmarkpathophysiologie in Mausmodellen befassen. Zu Beginn werden die Proben des Maus-Oberschenkelknochens und des Tibias in einen Biosicherheitsschrank gelegt.
Vorwiege und beschrifte 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhren. Als Nächstes wird der Boden eines 0,2-Milliliter-Rohrs mit einer sterilen 16-Gauge-Nadel durchstochen, die senkrecht zur Basis gehalten wird, wodurch eine einheitliche Öffnung entsteht. Stecken Sie das durchbohrte Rohr in das vorgewogene 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr mit enger Passform, um das Steckrohr-Setup vorzubereiten.
Legen Sie die Beinknochen in eine sterile Petrischale. Trennen Sie Oberschenkelknochen und Tibia, indem Sie durch den Gelenkraum schneiden. Schneide beide Enden des Oberschenkelknochens und des Schienbeins ab, um das rote Mark freizulegen.
Legen Sie die Knochen in das durchbohrte PCR-Rohr, das sich im 1,5-Milliliter-Rohr befindet, und versiegeln Sie die Baugruppe mit Parafilm. Zentrifugieren Sie die Probe für 10 Sekunden in einer Tisch-Mikrozentrifuge bei etwa 8.000 g bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie die erfolgreiche Knochenextraktion durch sichtbar weiße Knochen, die kein restliches rotes Mark im oberen Röhrchen besitzen, sowie das dunkelrote, kompakte Pellet am Boden des unteren Rohrs.
Wiegen Sie dann das 1,5-Milliliter-Rohr erneut, um die Masse des entnommenen Knochens zu bestimmen und sicherzustellen, dass es im erwarteten Bereich von etwa 15 bis 30 Milligramm pro Maus liegt. Gib jedem Rohr mit dem Knochenmark 250 Mikroliter RPMI 1640 hinzu und lege die Proben auf Eis. Das Mark wird durch vorsichtiges Pipettern 10 bis 15 Mal mit einer P1000-Pipette vorsichtig auf und ab aufgeschoben und runter, bis eine homogene Suspension ohne verbliebene Klumpen oder intakte Gewebefragmente entsteht.
Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um unverdautes Material, intakte Zellen und verbleibende Gewebefragmente zu pelletieren. Übertragen Sie den Supernatant vorsichtig in ein neues, steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, ohne das Pellet zu stören. Zentrifugieren Sie den übertragenen Überstandsstoff mit 2.000 g für 15 Minuten, um große Trümmer zu entfernen.
Sammeln Sie das Supernatant in ein neues Rohr und zentrifugieren Sie erneut bei 10.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Dann sammeln Sie mindestens 200 Mikroliter des endgültigen Supernatanten in einem frischen Tube. Gleiche die Spalte der Größenausschlusschromatographie aus, indem Sie sie mit sechs Millilitern gefiltertem PBS spülen und dabei die Säule und das PBS bei Raumtemperatur erhalten.
Lassen Sie das gesamte Volumen durch die Säule durch die Schwerkraft fließen. Dann laden Sie 150 Mikroliter des gefilterten Überschussmittels auf die Säule und lassen Sie die Probe vollständig in das Harz eindringen. Das Endpunkt erreicht wird, wenn der flüssige Meniskus die Oberfläche des Harzbetts erreicht und keine sichtbare Flüssigkeit über dem feuchten Harz verbleibt.
Fügen Sie sofort 550 Mikroliter PBS hinzu, um die Elution zu initiieren und das Leervolumen von 700 Mikrolitern zu sammeln. Entsorge das leere Volumen oder behalte es als nicht-zelluläre Vesikelfraktion. Beginnen Sie sofort mit der Sammlung der extrazellulären Vesikel-angereicherten Fraktion, nachdem das 700-Mikroliter-Hohlraum entkommen ist.
Stellen Sie sicher, dass 850 Mikroliter extrazelluläres, vesikelangereichertes Elut gesammelt werden. Um das extrazelluläre Vesikel zu konzentrieren, wird die Probe in einen vorgespülten Zentrifugalfilter mit einem Molekulargewichtsabgrenzungsabgrenzung von 100 Kilodalton eingeläutet. Zentrifugieren Sie die Probe bei 4.000 g bei vier Grad Celsius und prüfen Sie alle zwei bis drei Minuten, bis das gewünschte Endvolumen erreicht ist.
Dann erneuern Sie das Retenat durch sanftes Pipetteren. Bewahren Sie die extrazellulären Vesikel-angereicherten Fraktionen für sofortige Tests wie Transmissionselektronenmikroskopie auf Eis auf. Die Western-Blot-Analyse zeigte das Vorhandensein kleiner extrazellulärer Vesikel oder SEV-Marker in frühen Fraktionen.
Die Fraktionen eins bis fünf wurden für die anschließende Charakterisierung kleiner extrazellulärer Vesikel zusammengefasst. Das Fehlen von Calnexin- und bindenden Immunglobulin-Protein-Signalen in diesen Fraktionen schloss eine Kontamination durch intrazelluläre Membranen und endoplasmatische Retikulumskomponenten aus. Die Transmissionselektronenmikroskopie der SEV-angereicherten Fraktionen F1 bis F5 zeigte intakte runde Vesikel mit klar definierten Membrandoppelschichten und Durchmessern unter 200 Nanometern.
Die Nanopartikel-Tracking-Analyse der gesammelten Probe zeigte eine unimodale Größenverteilung unter 200 Nanometern mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 147,8 Nanometern. Die Teilchenkonzentration, die auf Gewebemasse normalisiert wurde, war am höchsten in den SEV-angereicherten Fraktionen F1 bis F5 mit 3,7 mal 10 in der Potenz von acht Partikeln pro Milliliter und Milligramm Gewebe und leicht reduziert in späteren Fraktionen F6 bis F8 bei 3,7 mal 10 mit der Potenz von acht Partikeln pro Milliliter pro Milligramm Gewebe. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, Größe, Konzentration und molekulare Ladung extrazellulärer Vesikel aus Muskel und Knochenmark zu messen.
Zukünftige Forschung kann dieses Protokoll auf Krankheitsmodelle ausweiten und die isolierten Vesikel nutzen, um Biomarker und therapeutische Ziele zu identifizieren.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs) aus murinem Skelettmuskel (SkM) und Knochenmark (BM). Der SkM wird einer enzymatischen Verdauung unterzogen, während das BM direkt verarbeitet wird; anschließend erfolgen Differenzialzentrifugation und Größenausschlusschromatographie (SEC), um EV-angereicherte Fraktionen zu erhalten. Die Methode ermöglicht die Isolierung von sEVs mit hoher Reinheit aus geringen Gewebemengen und unterstützt damit nachgeschaltete molekulare und funktionelle Analysen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biologie extrazellulärer Vesikel
- Gewebespezifische Isolierung von Vesikeln
- Charakterisierung von Nanopartikeln
Hintergrund
- sEVs vermitteln die interzelluläre Kommunikation durch den Transfer von Proteinen, Lipiden und RNAs.
- Die Isolierung von sEVs aus festen Geweben wie Skelettmuskel (SkM) und Knochenmark (BM) ist aufgrund geringer Ausbeute und Kontamination schwierig.
- Bestehende Methoden erfordern oft große Gewebemengen und weisen eine mangelnde Reproduzierbarkeit auf.
- Die Größenausschlusschromatographie (SEC) eignet sich effektiv zur Trennung von EVs von Kontaminanten basierend auf der Größe.
- Die Validierung der Reinheit von EVs erfordert mehrere orthogonale Techniken.
Zweck der Studie
- Entwickeln Sie eine zuverlässige Methode zur Isolierung von sEVs aus murinem Skelettmuskel (SkM) und Knochenmark (BM).
- Minimieren Sie den Gewebeeinsatz, während Ausbeute und Reinheit maximiert werden.
- Stellen Sie ein standardisiertes Protokoll unter Verwendung der Differenzialzentrifugation und Größenauschlusschromatographie (SEC) bereit.
- Ermöglichen Sie die nachgeschaltete molekulare und funktionelle Analyse von gewebeabgeleiteten sEVs.
- Unterstützen Sie die Forschung zur interzellulären Kommunikation in muskuloskeletalen und hämatopoetischen Systemen.
Verwendete Methoden
- Enzymatische Verdauung von Skelettmuskelgewebe.
- Direkte Aufarbeitung des Knochenmarks ohne enzymatische Behandlung.
- Differenzielle Zentrifugation zur Entfernung von Zellen und Zelltrümmern.
- Größenausschlusschromatographie (SEC) zur Anreicherung von extrazellulären Vesikeln (EVs).
- Verwerfen der Durchlaufvolumina (SkM: ~2,5 mL; BM: 700 µL), gefolgt von der Sammlung der EV-angereicherten Fraktionen.
- Aufteilung in aufeinanderfolgende Aliquote (SkM: F1–F4; BM: F1–F5).
- Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zur Beurteilung der Morphologie.
- Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) zur Bestimmung von Größe und Konzentration.
- Western-Blot-Analyse für kanonische EV-Marker (z. B. Tetraspanine).
- Einzel-Partikel-interferometrische Detektion (SPID) zur Quantifizierung tetraspanindefinierter Subpopulationen.
Hauptergebnisse
- sEVs isoliert aus ~500 µL Quadrizeps und ~150 µL gepooltem Knochenmark von Femur/Tibia.
- Ausbeute von ~10⁸ Partikel·mL⁻¹·mg⁻¹ Gewebe.
- Partikeldurchmesser vorwiegend <200 nm.
- EV-angereicherte Fraktionen durch TEM, NTA und Western Blotting validiert.
- SPID ermöglichte die Quantifizierung von tetraspaninpositiven sEV-Subpopulationen.
- Die Methode liefert hochreine sEVs, geeignet für nachgeschaltete Omics- und Funktionsanalysen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht die reproduzierbare Isolierung von sEVs mit hoher Reinheit aus strukturell komplexen Geweben.
- Kleine Gewebemengen sind ausreichend für eine robuste EV-Ausbeute.
- Die kombinierte Anwendung von Differenzialzentrifugation und Größenausschlusschromatographie (SEC) verringert Kontaminationen.
- Die orthogonale Validierung bestätigt Integrität und Reinheit der Vesikel.
- Dieser Ansatz unterstützt fortgeschrittene Untersuchungen der gewebespezifischen Funktionen von sEVs im gesunden und krankhaften Zustand.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs) aus festen Geweben wie Skelettmuskel und Knochenmark bleibt aufgrund geringer Ausbeute und Kontamination eine Engstelle bei der Biomarker-Entdeckung und mechanistischen Studien. Dieses Protokoll ermöglicht eine reproduzierbare, hochreine Isolierung von sEVs aus minimalem Gewebematerial und unterstützt die Zielvalidierung sowie phänotypische Screening-Verfahren in Modellen muskuloskelettaler und hämatopoetischer Erkrankungen. Durch die Verringerung biologischer Störgrößen und die Verbesserung der Vesikelreinheit erhöht die Methode das Vorhersagevertrauen in nachgeschaltete Omics- und Funktionsanalysen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung gewebespezifischer interzellulärer Kommunikationswege mittels sEV-vermittelter Übertragung von Proteinen, Lipiden und RNAs.
- Operativer Wert: Bietet einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Isolierung von sEVs aus murinem Skelettmuskel und Knochenmark unter Verwendung der Differenzialzentrifugation und Größenausschlusschromatographie.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Entlastung von Risiken, indem die Anreicherung von EVs durch orthogonale Methoden wie TEM, NTA, Western Blotting und interferometrische Einzelteilchendetektion validiert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt EV-angereicherte Fraktionen mit Partikeldurchmessern überwiegend <200 nm und Ausbeuten von ~10⁸ Partikel·mL⁻¹·mg⁻¹ Gewebe, wodurch eine konsistente Eingabe für Screening-Kampagnen ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Standardisiert die sEV-Isolierung durch definierte Entsorgung des Totvolumens und sequenzielle Fraktionierung (SkM: F1–F4; BM: F1–F5), wodurch die Reproduzierbarkeit von Assays zwischen verschiedenen Laboren verbessert wird.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Herstellung validierter biologischer Systeme für nachgeschaltete molekulare Analysen wie Proteomik und RNA-Profilierung von gewebeherkünftigen Vesikeln.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt krankheitsrelevante Systeme, indem es die Isolierung von sEVs aus Skelettmuskel und Knochenmark ermöglicht, Geweben, die für die Pathophysiologie des Bewegungsapparats und des hämatopoetischen Systems zentral sind.
- Operativer Wert: Verwendet minimale Ausgangsmengen (~500 µL Quadrizeps, ~150 µL gepooltes Knochenmark aus Femur/Tibia), wodurch eine skalierbare Aufarbeitung begrenzter präklinischer Proben ermöglicht wird.
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die translatationale Biomarker-Abstimmung, indem tetraspanindefinierte sEV-Subpopulationen isoliert werden, die mittels interferometrischer Einzelteilchendetektion quantifizierbar sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich nahtlos in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis hin zu präklinischen mechanistischen Studien ein und ermöglicht die zuverlässige Isolierung von aus Gewebe stammenden sEVs zur Hypothesenprüfung und Aufklärung von Signalwegen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch die Isolierung von sEVs, die die interzelluläre Kommunikation in den Mikroumgebungen von Skelettmuskel und Knochenmark vermitteln.
- Screening: Liefert assaysbereite, größenausgeschlossene EV-Fraktionen mit reduzierter Kontamination und verbessert somit die Zuverlässigkeit von Bewertungen zur Reaktion auf Wirkstoffe oder Stimuli.
- Analytik: Erzeugt quantitative Ergebnisse, einschließlich Partikelkonzentration, Größenverteilung (<200 nm) und Daten zu Tetraspanin-Teilpopulationen, um vergleichende Analysen unter verschiedenen Bedingungen zu ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Kontinuität, indem sie gereinigte sEVs bereitstellt, die für Funktionsanalysen zur Aufnahme und Signalübertragung in Krankheitsmodellen geeignet sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte, wiederverwendbare Isolationsplattform, die in verschiedenen Forschungsprogrammen zum muskuloskelettalen und hämatopoetischen System Anwendung finden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Mehrdeutigkeiten durch die Isolierung hochreiner sEVs reduziert werden, die mittels mehrerer orthogonaler Methoden validiert ist.
- Operativer Wert: Verbessert Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte SEC-Fraktionierungs- und Entsorgungsprotokolle für das Totvolumen.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem eine zuverlässige Beurteilung der gewebespezifischen Vesikelinhalte in der frühen Entdeckungsphase ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem konsistente sEV-Eingabematerialien für Biomarker- und Target-Validierungsstudien bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Gewebemanipulation, enzymatischen Verdauung (für Skelettmuskel) und Zentrifugationstechniken.
- Setzt Zugang zu Größenausschluss-Chromatographiesäulen, Nanopartikel-Tracking-Analyse und Infrastruktur für die Western-Blot-Analyse voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Sammlung und Zusammenführung von Fraktionen basierend auf der Anreicherung von EV-Markern.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung auf andere feste Gewebe aufgrund von Unterschieden in der Dichte der extrazellulären Matrix und der Zellzahl.
- Praktische Einschränkung: Die geringe absolute Ausbeute bei kleinen Gewebemengen erfordert empfindliche Nachweismethoden für Omics-Anwendungen.
