Name: Identifikation modifizierter Histone als bindende Substrate des menschlichen Spindlin-Familienmitglieds 4 (SPIN4) mittels Peptidarrays und natives Nukleosomen-Pulldowns (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Erfahren Sie, wie Peptidarrays und native Nukleosomen-Pulldowns die Bindungssubstrate von SPIN4 identifizieren. Diese Methode ermöglicht die schnelle Validierung epigenetischer Reader-Proteine und deren Rolle bei Überwuchssyndromen.

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<ol><li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-function+variant+in+SPIN4+causes+an+X-linked+overgrowth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome.</a> JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).</li>
<li>Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+observation+of+a+rare+Binder+phenotype+with+fetal+overgrowth+due+to+a+SPIN4+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Matern+Fetal+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation.</a> Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).</li>
<li>Lu, R., Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tudor%3A+a+versatile+family+of+histone+methylation+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Tudor: a versatile family of histone methylation readers.</a> Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).</li>
<li>Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+engagement+of+chromatin+modifications+by+linked+binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 983-994 (2007).</li>
<li>Mauser, R., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+modified+histone+peptide+arrays+in+chromatin+research%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Application of modified histone peptide arrays in chromatin research.</a> Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).</li>
<li>Hsu, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraspeckle+protein+NONO+regulates+active+chromatin+by+allosterically+stimulating+NSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1.</a> Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).</li>
<li>Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+reconstituting+enzymatic+activities+for+ultra-large+histone+methyltransferases+NSD1+and+SETD2+using+a+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).</li>
<li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+shotgun+quantitative+mass+spectrometry+characterization+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones.</a> J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).</li>
<li>Fuhrmann, J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+and+citrullination+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation and citrullination in epigenetic regulation.</a> ACS Chem Biol. 11, 654(2015).</li>
<li>Zhao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+histone+H3+%E2%80%9CK4me3-K9me3%2F2%E2%80%9D+methylation+pattern+readout+by+Spindlin1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for histone H3 “K4me3-K9me3/2” methylation pattern readout by Spindlin1.</a> J Biol Chem. 295 (49), 16877(2021).</li>
<li>Padeken, J., Methot, S. P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+H3K9-methylated+heterochromatin+and+its+functions+in+tissue+differentiation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of H3K9-methylated heterochromatin and its functions in tissue differentiation and maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (9), 623-640 (2022).</li>
<li>Greschik, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+code+reader+Spin1+controls+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The histone code reader Spin1 controls skeletal muscle development.</a> Cell Death Dis. 8 (11), e3173(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhren</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td>Allgemeine Experimente</td></tr><tr><td>15 cm Gewebekulturschale</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903.300</td><td>Allgemeine Experimente</td></tr><tr><td>15-mL konische Zentrifugenröhren</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.101</td><td>Allgemeine Experimente</td></tr><tr><td>50 mL konische Zentrifugenröhren</td><td>Sarstedt</td><td>62.548.004</td><td>Allgemeine Experimente</td></tr><tr><td>500 mL Erlenmeyer-Kolben</td><td>Stellar Scientific</td><td>CT229809</td><td>Sf9-Zellkultur</td></tr><tr><td>Amersham ImageQuant 800 CCD Imager</td><td>Cytiva</td><td>IMQ800</td><td>CCD-Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinitätsgel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>Biochemischer Pulldown</td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Westlicher Blot</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P0017</td><td>Proteaseinhibitor</td></tr><tr><td>Array-Analyse Sofrware</td><td>Aktives Motiv</td><td>https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zip</td><td>MODified-Peptidarray-Datenanalyse</td></tr><tr><td>ASI Agarose LE</td><td>Alkali Scientific</td><td>A7700</td><td>DNA-Gel</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus-Expressionssystem</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>10359016</td><td>Baculoviraler Ausdruck</td></tr><tr><td>Benzamidinhydrochlorid</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-W018781</td><td>Proteaseinhibitor</td></tr><tr><td>Rinderserum-Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Proteinquantifizierungsstandard</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>A18469.08</td><td>Lammeli-Puffer</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>20278</td><td>Proteien-Gel-Färbung</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5545</td><td>Lysis-Puffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>RPI-Forschungsprodukte</td><td>E58100</td><td>Lysis-Puffer</td></tr><tr><td>Verbessertes Chemilumineszenz-(ECL)-Substrat</td><td>Cytiva</td><td>RPN2232</td><td>Westlicher Blot</td></tr><tr><td>ESF 921 Insektenzellkulturmedium</td><td>Expressionssysteme</td><td>96-001</td><td>Sf9-Zellkultur</td></tr><tr><td>Ethanol (200 Proof)</td><td>Spektrumchemisch</td><td>ET107</td><td>DNA-Präzipitation</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Bildgebungssystem</td><td>Invitrogen</td><td>M5000</td><td>Allgemeine Bildgebung</td></tr><tr><td>FLAG-Peptid</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P7006</td><td>Pulldown-Elution</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G77893</td><td>Speicherpuffer</td></tr><tr><td>H3K4me1 Antikörper&nbsp;</td><td>Aktives Motiv</td><td>39300</td><td>Westlicher Blot</td></tr><tr><td>H3K4ME2-Antikörper&nbsp;</td><td>Zellsignalübertragung</td><td>9725T</td><td>Westlicher Blot</td></tr><tr><td>H3K4me3-Antikörper&nbsp;</td><td>Zellsignalübertragung</td><td>9751T</td><td>Westlicher Blot</td></tr><tr><td>HEK293FT Zellen</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>R70007</td><td>Humane embryonale Nierenfibroblastzelllinie</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H3375</td><td>Lysis-Puffer</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Nationale Gesundheitsinstitute</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td>&nbsp; Java-basiertes Bildverarbeitungsprogramm</td></tr><tr><td>Leupeptin-Hemisulfat</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-18234A</td><td>Proteaseinhibitor</td></tr><tr><td>Mikrokokkalnuklease (MNase)</td><td>NEB&nbsp;</td><td>M0247S</td><td>Endonuklease für die Chromatinverdauung</td></tr><tr><td>Modell 120 Sonic Disembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>Sonikation</td></tr><tr><td>MODifiziertes Histonpeptid-Array</td><td>Aktives Motiv</td><td>13005</td><td>Proteinbindungstest</td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P0018</td><td>Proteaseinhibitor</td></tr><tr><td>Peroxidase-IgG-Fraktion monoklonaler Ziegen-Anti-Maus-IgG, leichtkettenspezifisch</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-174</td><td>Westlicher Blot</td></tr><tr><td>pFastBac1-Flag-SPIN4</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>10360014</td><td>Baculoviraler Expressionsvektor</td></tr><tr><td>pFastBac1-Flag-SPIN4-D82H</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>10360014</td><td>Baculoviraler Expressionsvektor</td></tr><tr><td>Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>DNA-Reinigung</td></tr><tr><td>Pierce Rapid Gold BCA Protein-Assay-Kit</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>PIA53226</td><td>Proteinquantifizierung</td></tr><tr><td>Pierce Silver Stain Kit</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>24612</td><td>Proteindetektion</td></tr><tr><td>PMSF-Proteasehemmer</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>36978</td><td>Proteaseinhibitor</td></tr><tr><td>Polyacrylamid-Gel</td><td>Intern hergestellt</td><td>N/A</td><td>Proteingel</td></tr><tr><td>Sf9-Insektenzellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td>Insektenzelllinie zur Baculovirus-Expression</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI-Dialysegerät, 10K MWCO</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>69572</td><td>Proteindialyse</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>DNA-Präzipitation</td></tr><tr><td>Natriumchlorid&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP358-1</td><td>Allgemeine Puffer</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L3771</td><td>Allgemeine Puffer</td></tr><tr><td>Trypanblaue Lösung (0,4 %)</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>15250061</td><td>Kernfärbung</td></tr></tbody></table>

identifikation modifizierter histone als bindende substrate des menschlichen spindlin-familienmitglieds 4 (spin4) mittels peptidarrays und natives nukleosomen-pulldowns

Identification of Modified Histones as Binding Substrates of Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) by Peptide Arrays and Native Nucleosome Pulldown

Identifikation modifizierter Histone als bindende Substrate des menschlichen Spindlin-Familienmitglieds 4 (SPIN4) mittels Peptidarrays und natives Nukleosomen-Pulldowns

Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) has just emerged as a novel regulator of bone growth. Loss-of-function variants in SPIN4 were identified in ...

identification-modified-histones-as-binding-substrates-human-spindlin

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Advances in Massenspektrometrie haben die Hochdurchsatz-Analyse der Proteinexpression und Modifikation in einer Vielzahl von Geweben erlaubt. Kombiniert mit subzelluläre Fraktionierung und Krankheitsmodelle, quantitative Massenspektrometrie und der Bioinformatik neue Eigenschaften in biologischen Systemen offenbaren kann. Das hierin beschriebene Verfahren analysiert Chromatin-assoziierten Proteinen in der Einstellung von Herzerkrankungen und ist ohne weiteres auch auf...

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

In diesem Protokoll beschreiben wir eine neuartige BrdU-ChIP-Slot-Western-Technik, um Proteine und Histonmodifikationen zu untersuchen, die mit neu synthetisierter oder entstehender DNA assoziiert sind.

Untersuchung von Proteinen, entstehende DNA in Säugerzellen Bound Mit BrdU-chip-Slot-westliche Technik

Dieses Protokoll beschreibt einen voll integrierten Workflow für die Charakterisierung von Histon-post-translationale Modifikationen mittels Massenspektrometrie (MS). Der Workflow umfasst Histon-Reinigung aus Zellkulturen oder Geweben, Histon-Derivatisierung und Verdauung, MS-Analyse unter Verwendung von Nano-Flow-Flüssigkeitschromatographie und Anweisungen für die Datenanalyse. 3 Tage - Das Protokoll wird innerhalb von 2 für die Fertigstellung konzipiert.

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Zur gleichen Zeit, asymmetrisch posttranslational modifiziert Nukleosomen kann nach der Verwendung eines Histon vormodifiziert Kopie erzeugt werden. Diese Präparate können leicht zu untersuchen Modifikationsübersprechmechanismen verwendet werden, gleichzeitig auf beiden Schwester Histone, durch hochauflösende NMR-Spektroskopie.

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur Anwendung der Peptid-Microarray-Technologie auf die Spezifitätsprofilierung von Antikörpern, die Histone und ihre posttranslationalen Modifikationen erkennen.

Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays

Hier beschreiben wir ein Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation der geänderten Histone aus der angehende Hefe Saccharomyces Cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wird anschließend für die quantitative PCR verwendet, um die Fülle und die Lokalisierung von Histon post-translationalen Modifikationen während des Genoms zu befragen.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, die eine analytische Größenausschlusschromatographie zur Untersuchung der Histon-Chaperon-Oligomerisierung und -stabilität, den Pull-Down-Assay zur Entschlüsselung von Histon-Chaperon-Histon-Interaktionen, die AUC zur Analyse der Stöchiometrie der Proteinkomplexe und den Histon-Chaperoning-Assay zur funktionellen Charakterisierung eines mutmaßlichen Histon-Chaperons in vitro umfassen.

In vitro Charakterisierung von Histon-Chaperonen mittels analytischer, Pull-Down- und Chaperoning-Assays

Ein analytischer Arbeitsablauf, der auf Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) basiert, für eine hochzuverlässige und hochgradig reproduzierbare "Bottom-up"-Analyse von Histonmodifikationen und -identifizierung basierend auf Hauptparametern (Retentionszeit [RT], Kollisionsquerschnitt [CCS] und genaues Masse-zu-Ladungs-Verhältnis [m/z]).

Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie

In diesem Artikel wird ein detailliertes experimentelles Verfahren zur Rekonstitution von nukleosomenhaltigen DNA-Fesseln für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Des Weiteren werden mehrere nachgelagerte Experimente beschrieben, die durchgeführt werden können, um das Bindungsverhalten von Chromatin-interagierenden Proteinen zu visualisieren und Veränderungen der physikalischen Eigenschaften von Nukleosomen zu analysieren.

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Die Anreicherung und Sequenzierung von proteinassoziierter junger DNA (eSPAN) wurde entwickelt, um die relative Häufigkeit eines chromatinassoziierten Proteins auf zwei replizierenden DNA-Strängen zu erkennen und so molekulare Einblicke in die Chromatinreplikation und ihre gekoppelten Prozesse zu gewinnen. Dieses Protokoll beschreibt eSPAN-Verfahren in Hefe- und Mausembryonalen Stammzellen (ES).

Strängspezifische Analyse von Proteinen bei der Replikation von DNA-Strängen durch Anreicherung und Sequenzierung der proteinassoziierten, entstehenden DNA-Methode

Erfahren Sie, wie Peptidarrays und native Nukleosomen-Pulldowns die Bindungssubstrate von SPIN4 identifizieren. Diese Methode ermöglicht die schnelle Validierung epigenetischer Reader-Proteine und deren Rolle bei Überwuchssyndromen.

Identifikation modifizierter Histone als bindende Substrate des menschlichen Spindlin-Familienmitglieds 4 (SPIN4) mittels Peptidarrays und natives Nukleosomen-Pulldowns (Video) | JoVE Journal

Identifikation modifizierter Histone als bindende Substrate des menschlichen Spindlin-Familienmitglieds 4 (SPIN4) mittels Peptidarrays und natives Nukleosomen-Pulldowns

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