Eine optimierte Methode zur Isolierung des weiblichen Harnröhrenepithels für Einzelzell- und Immunfluoreszenzanalyse

Unsere Gruppe interessiert sich für die Untersuchung der epithelialen Musterbildung im Genitaltrakt. Dieses Protokoll stellt eine optimierte Methode dar, um die epithelliale Auskleidung der weiblichen Maus-Harnröhre für eine nachgeschaltete molekulare und zelluläre Analyse zu isolieren. Die in diesem Artikel beschriebenen Methoden unterstützen die Forschung zur weiblichen Harnröhrenschleimhaut und ihrer Rolle in der Immunabwehr.

Zunächst legen Sie die euthanasierte weibliche CD1-Maus im Alter von 6 bis 12 Wochen in Rückenlage auf den Dissektionstisch. Sprühe 70 % Ethanol auf den Bauch, um das Haar zu benetzen. Heben Sie mit einer Pinzette die Haut am Bauch.

Dann machst du mit einer kleinen Schere einen vertikalen Schnitt zum Unterkörper, der an der äußeren Harnröhrenöffnung endet. Identifizieren Sie die Blase und heben Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette an, wobei Sie sicherstellen, dass sie leer und urinfrei ist. Mit einer Schere wird das Fett und das Bindegewebe um die Blase herum abgeschnitten, um die schmetterlingsförmige Struktur freizulegen, wo sich die beiden Schambeinen an der Symphyse des Schambeins treffen.

Beobachten Sie die Harnröhre, die unter der Symphyse des Schams verläuft. Dann heben Sie die Symphyse der Schamhaut mit einer Pinzette an und schneiden sie mit einer Schere auf. Entfernen Sie die Schambeinfragmente, um die dünne Harnröhre freizulegen, die an der ventralen Oberfläche der Scheidenwand liegt.

Mit einer feinen Pinzette zieht man die Blase vorsichtig von der Körperhöhle nach oben. Führen Sie eine Schere zwischen Harnröhre und Vaginalwand, um Harn- und Fortpflanzungstrakte zu trennen. Halten Sie eine leichte Spannung auf der Blase, während Sie entlang der Rückseite der Harnröhre schneiden, um sie von der Scheidenwand zu trennen.

Schneiden Sie weiter bis zur distalen Harnröhrenöffnung, um die vollständige Maus-Harnröhre mit einer Länge von 1,2 bis 1,5 Zentimetern zu erhalten. Als Nächstes trennen Sie die Harnröhre von der Blase, indem Sie einen einzelnen Schnitt am Blasenhals machen. Sammeln Sie vier bis fünf Harnstoffe in einer sterilen Petrischale mit frischem HBSS ohne Kalzium und Magnesium.

Unter einem Seziermikroskop schneiden Sie das Fett und Bindegewebe rund um die Harnröhre mit einer feinen Zange und Schere. Schneiden Sie dann mit der Schere jede Harnröhre quer in zwei gleich große Stücke. Legen Sie die Gewebestücke auf ein 100-Mikron-Nylon-Sieb.

Waschen Sie die Gewebestücke mit einem Milliliter HBSS und übertragen Sie sie dann in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, das einen Milliliter 1%-Trypsin enthält, das in HBSS mit Antibiotika und Antimikotika zubereitet wird. Als Nächstes inkubieren Sie die Probe auf einem Rotator mit 30 Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten. Nach der Verdauung gib ich 10 millimolare Magnesiumchlorid, das in HBSS zubereitet wurde, in den Tuben, gefolgt von 10 Mikrogramm pro Milliliter DNAse, das ich in PBS vorbereitet habe.

Inkubieren Sie das Rohr 15 bis 30 Minuten auf einem Rotator, der in einem 37-Grad-Hybridisationsofen platziert ist. Um das Trypsin abzuschrecken, werden die Harnröhrengewebe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit 10 % Schafserum in HBSS bei Raumtemperatur übertragen. Nach fünf Minuten werden die Harnröhrengewebe in ein neues Rohr mit eiskaltem HBSS übertragen und dann in eine sterile Petrischale mit eiskaltem HBSS.

Während Sie die Probe unter dem Mikroskop betrachten, halten Sie ein Ende des Harnröhrenstücks mit einer Zange fest. Mit einer weiteren Zange führen Sie die gesamte Länge des Harnröhrenstücks entlang, um das transparente Epithelblatt zu extrudieren. Einige der isolierten urethralen Epithelplatten werden direkt für eine Immunfärbung des gesamten Mounts verarbeitet, um Epithelzellen und epithelassoziierte Makrophagen vor Ort sichtbar zu machen.

Verwenden Sie eine kleine Plastikpipette, um die Epithelstücke in einem Tropfen HBSS, isoliert aus vier bis fünf gepoolten Maus-Harnstoffen, in eine sterile Petrischale zu übertragen. Verwenden Sie eine Schere, um das Epithel in kleine Fragmente zu zerkleinern. Übertragen Sie die zerkleinerten Epithelfragmente in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit 1,5 Millilitern vorgewärmter Accutase-Verdauungslösung bei 37 Grad Celsius.

Inkubieren Sie die Probe auf einem Rotator bei 37 Grad für eine Stunde. Nach der Inkubation wird der gesamte Inhalt in ein fünf-Milliliter-Zentrifugenrohr mit zwei Millilitern Waschpuffer aus calcium- und magnesiumfreiem 1X PBS und 1%BSA übertragen. Zentrifugieren Sie die Federung mit 600 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius mit einem schwingbaren Eimerrotor.

Anschließend aspirieren Sie das Supernatant mit einem sanften Vakuum. Dann verwenden Sie eine Millimeter-Filterspitze-Pipette, um das Pellet in einem Milliliter Waschpuffer wieder aufzuhängen. Zerlegen Sie die Kugel, indem Sie sie auf und ab pipetten, bis die Klumpen kleiner werden.

Führen Sie die Federung durch 23,5- und 26,5-Gauge-Nadeln, die jeweils an eine Ein-Milliliter-Spritze mit vier Zügen pro Nadel befestigt sind. Als Nächstes geben Sie einen Milliliter Waschpuffer, um die Oberfläche eines 30-Mikron-Vortrennfilters zu benetzen, der über einem Fünf-Milliliter-Rohr angebracht ist. Mit der Spritze, die mit der 26,5-Gauge-Nadel verbunden ist, wird ein Milliliter der Zellsuspension durch den Filter übertragen.

Wasche dann die Tube mit einem Milliliter Waschpuffer und führe sie durch den Filter. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 600 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius mit einem Schwing-Bucket-Rotor gepelletiert. Aspiriere das Supernatant.

Das Pellet in 100 Mikrolitern Waschpuffer neu suspendieren und 100 Mikroliter roten Blutkörperchen-Lysepuffer hinzufügen. Nach genau drei Minuten vier Milliliter Waschpuffer hinzufügen und vermischen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 600 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius mit einem schwingenden Eimerrotor.

Entfernen Sie das Überdachungsmittel, bevor Sie das Pellet in 50 bis 200 Mikroliter Waschpuffer aufhängen, abhängig von der Größe des Pellets. Mischen Sie einen Fünf-Mikroliter-Aliquot von Zellen mit fünf Mikrolitern Trypanblau und laden Sie die Mischung auf ein Hämozytometer, um Zellausbeute und Lebensfähigkeit zu bewerten. Bewertung der Zelllebensfähigkeit und Quantifizierung unterschiedlicher Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie.

Kultivieren Sie Harnröhrenepithelzellen in einer Basalmembranmatrix und organoiden Expansionsmedien, um dreidimensionale urethrale epitheliale Organoide zu erzeugen. Führen Sie eine Hämatoxylin-Eosinfärbung und fluoreszierende Immunfärbung an eingebetteten organoiden Schnitten durch, um die organoide Struktur und zelluläre Zusammensetzung zu visualisieren. Die isolierten Harnröhrenepithelscheiden hatten nach der Trennung eine höhere Transparenz als das stromale Gewebe.

Die vollständige Immunfärbung der Epithelhüllen zeigte eine starke Markierung mit dem E-Cadherin-CDH1-Antikörper. Die Beschriftung der Blätter mit dem Antikörper gegen F480 zeigte, dass die Makrophagen verzweigte dendritische Strukturen zwischen den Epithelzellen der Harnröhre bildeten. Einzelzellen, die aus dem Harnröhrenepithel isoliert wurden, zeigten eine durchgehend hohe Lebensfähigkeit durch Trypan-Blau-Ausschluss auf einem Hämozytometer und Durchflusszytometrie mit dem aminreaktiven Ghost Dye V 450.

Die isolierten Zellen enthielten eine angereicherte Epithelzellpopulation nach dem Gating auf den lebenden Zellen. Etwa 1,3 % der CD45-positiven Immunzellen und 1,18 % Makrophagen wurden in den Einzelzellsuspensionen beobachtet. Einzelepithelzellen, die aus der Harnröhre isoliert wurden, blieben lebensfähig und bildeten Organoide in einer dreidimensionalen Matrix, wobei das Organoidwachstum bis zum sechsten Tag in der Kultur beobachtet wurde.

Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigte zwei unterschiedliche Morphologien der urethralen Epithelorganoide, darunter große hohle Organoide und kleinere feste Organoide. Sowohl die hohlen als auch die soliden urethralen Epithelorganoide wurden geschichtet und exprimierten KRT5 und P63 in der Basalschicht. Sie exprimierten KRT-13 in der suprabasalen und intermediären Zellschicht.

Die aus der proximalen Harnröhre erzeugten Organoide zeigten einen höheren Anteil hohler Organoide, während die Organoide aus der distalen Harnröhre festere Kugeln bildeten. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, Harnröhrenzelltypen und die selbsterneuerbare Kapazität von Epithelzellen aus der proximalen und distalen Harnröhre zu untersuchen. Eine der wichtigsten Überlegungen dieses Protokolls ist die sorgfältige Zerlegung der vollständigen Harnröhre und die optimale enzymatische Verdauung, um lebensfähige Harnröhrenepithelzellen für die nachgelagerte Analyse zu erhalten.

Die durch dieses Protokoll produzierten Epithelzellen können für verschiedene Anwendungen verwendet werden, darunter Einzelzell-RNA-Sequenzierung, Massen-RNA-Sequenzierung, Durchflusszytometrie, Immunfärbung und Organoidkultur.