Eine integrierte Methode zur photothrombotischen Schlaganfallmodellierung und zur in-vivo-Optrodenerfassung neuronaler und astrozytischer Aktivität bei sich wirkenden Mäusen

Unsere Forschung entwickelt eine integrierte Methode, um während eines ischämischen Schlaganfalls bei wachen Mäusen Astrozyten und neuronale Aktivität gleichzeitig aufzuzeichnen. Frühere Methoden zeichneten entweder Neuronen oder Astrozyten getrennt auf. Unser Protokoll erfasst Signale von Astrozyten und Neuronen bereits ab den ersten Momenten des Schlaganfallbeginns simultan.

Überführen Sie zunächst eine tief anästhesierte C57BL/6J-Maus in den stereotaktischen Rahmen, der mit einer Anästhesiemaske ausgestattet ist. Überwachen Sie die Anästhesietiefe alle 10 Minuten, während Sie die Körpertemperatur der Maus mit einer rückgekoppelten Heizplatte zwischen 36 und 37,5 Grad Celsius halten. Sichern Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen mit Ohrstiften und einem Maulhalter, nachdem Sie Augensalbe auf die Augen aufgetragen haben.

Überprüfen Sie die Kopfimmobilisierung durch vorsichtiges Abtasten, sobald der Kopf symmetrisch fixiert ist. Nach der Enthaarung und einer septischen Hautdesinfektion verwenden Sie eine Schere, um einen medianen Schnitt anzulegen. Reinigen Sie das Periost mit Kochsalzlösung und Wattestäbchen, um Bregma und Lambda freizulegen.

Senken Sie die Glas-Mikropipette ab, um nacheinander Bregma und Lambda zu berühren. Notieren Sie die Z-Koordinate am digitalen Feinmessschieber und stellen Sie den Mundstückhalter so ein, dass die Differenz weniger als 0,04 Millimeter beträgt. Senken Sie die Glas-Mikropipette ab, um Bregma zu berühren, und stellen Sie den digitalen Feinmessschieber auf null zurück.

Bewegen Sie die Mikropipette nacheinander 2,3 Millimeter nach links und rechts von Bregma. Notieren Sie die Z-Koordinate und justieren Sie anschließend die Ohrstifte, bis die bilateralen Unterschiede weniger als 0,04 Millimeter betragen. Nachdem der digitale Feinmessschieber an Bregma auf Null zurückgesetzt wurde, markieren Sie den motorischen Kortexbereich der Vordergliedmaße bei anteroposterior +1,5 Millimetern und mediolateral +0,74 Millimetern.

Verwenden Sie einen Mikrobohrer und 0,5 Millimeter runde Bohrer, um ein kleines Loch mit einem Durchmesser von etwa 0,5 Millimetern an der markierten Stelle zu bohren. Vor dem Befüllen mischen Sie die beiden adeno-assoziierten viralen Vektoren in gleichen Volumina und zentrifugieren die Probe kurzzeitig. Senken Sie die mit der Mikroinfusionspumpe verbundene Glas-Mikropipette auf die Zielstelle in einer dorsoventralen Tiefe von minus 0,94 Millimetern von der Gehirnoberfläche ab.

Infundieren Sie 400 Nanoliter der Virusmischung, die jeweils 200 Nanoliter jedes Vektors enthält, mit einer Geschwindigkeit von 50 Nanolitern pro Minute. Ziehen Sie die Pipette 10 Minuten nach Abschluss der Infusion langsam zurück. Nähen Sie die Kopfhaut mit einer 4-0 20 Millimeter, 3/8 Kreis Naht und legen Sie die Maus auf eine Heizplatte, bis sie sich vollständig erholt hat.

Drei bis vier Wochen nach der Virusinjektion das zuvor beschriebene Verfahren bis zum Hautschnitt am Kopf durchführen. Während des Hautschnitts am Kopf 1,5 cm mal 1,5 cm Kopfhaut entfernen, wobei ausreichend Haut um die Augen herum erhalten bleibt. Den Schädel mit Wasserstoffperoxid und 0,9 %iger Salzlösung reinigen.

Nachdem Sie den Bregma identifiziert haben, setzen Sie den digitalen Feinmessschieber auf null zurück. Verwenden Sie einen runden Bohrer mit 0,8 Millimeter Durchmesser, um die Schädeloberfläche leicht aufzurauen. Markieren Sie den Bereich des motorischen Kortex für die Vordergliedmaße.

Bei anteroposterior 1,5 Millimetern und mediolateral 0,74 Millimetern. Verwenden Sie die Markierung als Mittelpunkt, um ein fünf Millimeter mal fünf Millimeter großes Quadrat zu zeichnen. Verwenden Sie einen Mikrobohrer mit etwa 10.000 Umdrehungen pro Minute, um das Quadrat nachzuzeichnen.

Wenden Sie kontinuierlich eiskalte Kochsalzlösung auf die Bohrstelle an und stoppen Sie sofort, wenn die Knochenplatte sich lockert. Bohren Sie drei kleine Löcher mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern über der kontralateralen Hemisphäre und dem Kleinhirn. Setzen Sie Kranioplastieschrauben in die Löcher ein.

Stellen Sie sicher, dass jeder Schraube bis zum Dura mater reicht, aber nicht weiter eindringt, um Schäden am Gehirngewebe zu vermeiden. Entfernen Sie die gelockerte Knochenplatte mit einer Pinzette. Verwenden Sie eine ultrafeine Pinzette mit einer Spitze, die kleiner als 0,03 Millimeter mal 0,01 Millimeter ist, um die Dura im Bereich des Schädel-Fensters zu entfernen, wobei ein direkter Kontakt mit dem Gehirngewebe vermieden werden sollte.

Befestigen Sie die Optrode am Mikromanipulatorarm des stereotaktischen Gestells und positionieren Sie sie über dem Schädel-Fenster. Verbinden Sie die silbernen Erdungs- und Referenzdrähte der Optrode sicher mit den drei Kranioplastieschrauben. Reinigen Sie die Oberfläche des Schädel-Fensters mit steriler Kochsalzlösung.

Senken Sie den Optroden langsam auf die gewünschte dorsoventrale Tiefe von minus 0,94 Millimetern mit einer Geschwindigkeit von einem Millimeter pro 10 Sekunden ab. Tragen Sie nach der Implantation eine Schicht Agarose über dem cranialen Fenster auf. Bringen Sie drei bis vier Schichten Zahnzement an.

Nachdem sich der Zement verfestigt hat, verabreichen Sie drei bis fünf Tage lang Analgetika und lassen Sie die Maus eine bis zwei Wochen lang auskurieren. Verwenden Sie ein System zur Faser-Photometrie mit zwei oder drei Wellenlängen, um GCaMP6s anzuregen. Stellen Sie den Signal-Kanal auf 470 Nanometer und den Kontroll-Kanal auf 410 Nanometer ein.

Stellen Sie die Abtastrate auf 60 Bilder pro Sekunde ein. Erden Sie nun alle Komponenten des Aufnahmesystems ordnungsgemäß. Verwenden Sie während der Aufnahme eine gemeinsame mediane Referenz.

Überprüfen Sie, ob breitbandige Signale und lokale Feldpotentiale in der Aufnahmesoftware ausgewählt sind, und überwachen Sie während der gesamten Aufnahmesitzung auf Störgeräusche. Nachdem die Maus kurz anästhesiert wurde, verbinden Sie das Optrodenkabel über einen Adapter mit der Aufnahmeeinheit. Platzieren Sie die Maus zur Aufnahme in einer umgebungsähnlichen Heimkäfiganordnung.

10 Minuten Akklimatisierung nach dem Aufwachen zulassen. Den Mausgriffkrafttest aufzeichnen, wobei eine Zugbewegung pro Minute über fünf Minuten erforderlich ist. Verhaltensprüfungen exakt zeitgestempelt sowohl in Mehrkanal- als auch in Fiber-Photometrie-Systemen erfassen.

Geben Sie eine 1,5 %ige Lösung des Rosen-Bengal-Farbstoffs intraperitoneal mit 10 bis 20 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht und warten Sie fünf Minuten. Schließen Sie die Optroden-Sonde an die Laserquelle an, sobald eine tiefe Anästhesie erreicht und aufrechterhalten ist. Leiten Sie einen Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 530 Nanometern und einer Leistung von 15 Milliwatt über die implantierte Optrode für fünf bis acht Minuten ein, um eine fokale Ischämie zu induzieren.

Um eine optogenetische Stimulation durchzuführen, verbinden Sie den Laserstimulator mit der Optrode. Schalten Sie den 488 Nanometer optogenetischen Laserstimulator ein und stellen Sie ihn für fünf Minuten auf 10 Milliwatt für Opto-vTrap ein. Platzieren Sie die Maus abschließend zur Erholung auf eine beheizte Unterlage.

Im Vergleich zur Ausgangsbasis nahm die zerebrale Durchblutung nach der Photothrombose ab und blieb am ersten und siebten Tag nach dem Schlaganfall vermindert. Die Vorderpfoten-Kraft zeigte einen hochsignifikanten Rückgang am ersten Tag und blieb am siebten Tag nach dem Schlaganfall vermindert. Die astrozytären Kalziumtransienten, aufgezeichnet mittels Faser-Photometrie, und die neuronalen Spikes aus der Elektrophysiologie wurden basierend auf Zeitstempeln synchronisiert.

Nach einem photothrombotischen Schlaganfall waren die Feuerraten sowohl bei Pyramidenneuronen als auch bei Interneuronen im Vergleich zu den Basisraten während der Vorderpfoten-Greifaufgabe signifikant unterdrückt. Im Grundzustand erreichten die kalziumabhängigen Transienten der Astrozyten innerhalb von vier bis sechs Sekunden nach Aufgabenbeginn ihren Höhepunkt. Die Amplitude war jedoch nach dem photothrombotischen Schlaganfall signifikant vermindert, was auf eine geschwächte Kalziumaktivität hinweist.

Rasterdiagramme und peri-stimulus Zeit-Histogramme zeigten Änderungen der neuronalen Aktivität während der optischen Stimulation. Sowohl die Feuerraten der Pyramidenneurone als auch der Interneurone wiesen nach der optischen Stimulation im Vergleich zur prästimulus Grundlinie eine signifikante Abnahme auf, was bestätigt, dass die Modulation durch Astrozyten einen messbaren downstream-Effekt auf die lokale Schaltkreis-Erregbarkeit hat. Dieses Protokoll ermöglicht eine unterbrechungsfreie Aufzeichnung von Bewegung und Neuroaktivität über den gesamten Zeitverlauf vor dem Schlaganfall, von der akuten Phase bis zum chronischen Stadium.

Der Erfolg dieses Protokolls hängt von einer präzisen oder koordinierten Ausrichtung ab. Monokulare Optrodenimplantation und ausreichende Virusexpression sind über die chirurgischen Eingriffe hinweg erforderlich. Zukünftige Studien könnten mehrere Implantate verwenden, um umfassendere Hirnregionen zu überwachen, oder unterschiedliche Zelltypen mit vielfältigen Verhaltensassays gezielt ansprechen.