Charakterisierung von Riboglow-Sonden in vitro als Grundlage für fluoreszenzlebenslange Bildgebung in lebenden Säugetierzellen und dreidimensionalen zellulären Modellen

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Visualisierung von RNA in lebenden Zellen, um die räumlich-zeitlichen Dynamiken von RNA zu untersuchen. Die Riboglow-Plattform verwendet quantitative Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie in mehrzelligen Systemen, die auf biologische Systeme in Gesundheit und Krankheit anwendbar ist. Um zu beginnen, beschaffen Sie die RNA-Proben oder Zellen mit perlenbeladenen Riboglow-Sonden.

Schalten Sie das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop-System ein, gefolgt von der Mikroskop-Steuereinheit. Schalten Sie das auf zeitkorreliertem Einzelphotonenzählen basierende Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie- oder FLIM-System ein, einschließlich der Laser-Kombinationseinheit, des Photomultiplier-Detektors und des Ereignistimers. Nach dem Öffnen der NIS-Bildaufnahme- und Analysesoftware wählen Sie unter dem Setup- und Konfigurationsfenster AX mit PicoQuant.

Sobald die Software hochgefahren ist, wählen Sie AX FLIM und FCS. Um das Mikroskop für die Fluoreszenzlebensdauer-Datenerfassung einzurichten, bestätigen Sie, dass Galvano im AX-Pad-Bereich ausgewählt ist. Setzen Sie den Mittelwert auf eins und die Verweildauer auf zwei.

Im Laserleistungsbereich senken Sie die einzelnen Laser-Schieberegler auf 3 bis 4%. Setzen Sie den Schieberegler für alle Laser auf eins. Wählen Sie nach Auswahl des 20x-Objektivs in den Scanbereich-Einstellungen 512 mal 512 und aktivieren Sie die Detektoren. Um den Pfad der Datendatei zu definieren, gehen Sie zum unteren Teil des Controller-Bereichs und wählen Sie Konfigurieren.

Nachdem Sie auf die Registerkarte PicoQuant oder FLIM FCS geklickt haben, wählen Sie unter Arbeitsspeicherpfad das Ordnersymbol auf der rechten Seite. Erstellen Sie am Speicherort einen neuen Ordner für die Experimente des Tages und schließen Sie das Konfigurationsfenster. Sobald Live ausgewählt ist und das Bilderfassungsfenster erscheint, wählen Sie erneut Live, um die Photonenerfassung zu pausieren.

Um die Fenster für die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie oder FLIM-Datenerfassung einzurichten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Live-Bildfenster und wählen Sie das PicoQuant-Plugin. Aktivieren Sie die Anzeige der Zerfallskurve, der Zeitspur und der FLIM-Statistik. Um die Laseranordnung für das Zellexperiment einzurichten, gehen Sie zu den Experimenteinstellungen oben rechts auf der Seite neben den Lasern.

Klicken Sie nach dem Klicken auf Hinzufügen neben dem Mehrkanal-Farbstoffkasten auf die gewünschten Farbstoffe. Wählen Sie den Expertenmodus. Passen Sie die Detektorzuweisungen für jedes Emissionsspektrum an.

Routen Sie überlappende Anregungs- und Emissionsspektren zu verschiedenen Detektoren. Passen Sie auf der linken Seite die Durchlaufreihenfolge an, um die Übersprechen zwischen Farbstoffen mit überlappenden Anregungs- und Emissionsspektren zu minimieren. Nach dem Speichern und Benennen der neuen Laserkonfiguration wählen Sie die gespeicherte Konfiguration für das Experiment.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Live-Erwerbungsfenster. Wählen Sie Erfassungssteuerungen und dann XYZ-Übersicht. Bevor Sie die Bildgebungs-Zellkulturschale für FLIM laden, fügen Sie den lebenden Zellkernfarbstoff hinzu und mischen Sie ihn gründlich, indem Sie ihn sanft auf der Bank drehen, und lassen Sie ihn 30 Sekunden lang ruhen.

Legen Sie die Bildgebungsschale auf die Mikroskopbühne. Schieben Sie die Schale in die linke untere Ecke der Mikroskopbühne. Kleben Sie die Probe auf die Bühne, wenn Sie keine Luftobjektive verwenden, um XY-Drift zu verhindern.

Wechseln Sie zum 4'6-Diamidino-2-phenylindol oder DAPI-Kanal. Verwenden Sie den Steuerknopf, bis die Zellkerne in den Fokus kommen. Passen Sie bei Bedarf die Empfindlichkeit des Z-Höhenknopfes an, und wenn Zellen nicht sichtbar sind, passen Sie die XY-Koordinaten an.

Um das perfekte Fokussystem oder PFS-Autofokus zu aktivieren, wählen Sie auf der rechten Seite des AX-Bedienfelds die Lupe neben der PFS-Schaltfläche. Sobald das Mikroskop die Z-Höhe automatisch normalisiert hat, bestätigen Sie, dass die PFS-Schaltfläche leuchtet und im Fokus angezeigt wird. Mithilfe des AX-Detektors finden Sie die gewünschten Zellen mithilfe des DAPI-Kanals.

Wechseln Sie dann zum ATO 590-Kanal, um perlenbeladene Zellen effektiv zu identifizieren. Sobald eine Zelle identifiziert und durch Doppelklick zentriert wurde, wechseln Sie zu AX FLIM und FCS. Stellen Sie sicher, dass 512 mal 512 ausgewählt ist, und passen Sie die Rahmengröße an, indem Sie die Ecken anklicken und ziehen, um sie an die Zelle anzupassen.

Lassen Sie den neu gestalteten Rahmen rot werden. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den Rahmen oder wählen Sie Live, bis der Rahmen grün wird, um die Anpassung zu bestätigen. Nachdem Sie die Anzahl der Aufnahmen auf den gewünschten Wert eingestellt haben, wählen Sie Erfassung.

Beobachten Sie das neue Erfassungsfenster und das Erfassungsfortschrittsfeld auf der rechten Seite des Bildschirms. Sobald die FLIM-Analysesoftware geöffnet ist, navigieren Sie zum richtigen Dateipfad. Beobachten Sie, wie die Aufnahmen automatisch das Analysesoftwarefenster auffüllen.

Benennen Sie die Aufnahmen um, während sie gesammelt werden. Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, wechseln Sie zurück zum AX-Detektor. Wählen Sie Live, um nach einer neuen Zelle zu suchen.

Passen Sie die Größe des AX FLIM- und Fluoreszenzkorrrelationsspektroskopie- oder FCS-Fensters nach Bedarf für größere oder kleinere Zellen an. Exportieren Sie nach dem Erwerb neuer Zellen während des dreistündigen Bildgebungszeitraums die erstellte sptw-Datei. Fahren Sie mit der FLIM-Datenverarbeitung und -analyse fort, um Fluoreszenzlebensdauer-Messungen aus den gesammelten Proben zu extrahieren.

Repräsentative Zerfallskurven zeigten, dass das Vorhandensein des RNA A-Tags die extrahierte Fluoreszenzlebensdauer in vitro erhöhte, während Proben ohne den RNA A-Tag linksverschobene Zerfallskurven zeigten, was auf kürzere durchschnittliche Lebensdauern hinweist. Die zellulären Fluoreszenzlebensdauern von Zellen, die mit 3xGly perlenbeladen waren, waren signifikant niedriger als die von Zellen, die mit 5xGly perlenbeladen waren. Repräsentative Zerfallskurven zeigten, dass Zellen, die mit 3xGly perlenbeladen waren, linksverschobene Zerfallskurven im Vergleich zu Zellen aufwiesen, die mit 5xGly perlenbeladen waren, was auf niedrigere durchschnittliche Fluoreszenzlebensdauern hinweist.

Der Zellkern von mit Riboglow-Sonde perlenbeladenen Zellen zeigte konsistent höhere Fluoreszenzlebensdauern als das Zytosol derselben Zelle. Das falsche Farbskalen-Erfassungsfenster, die Zerfallskurven und die extrahierten tau-Mittelwertamplitudenwerte zeigten alle den gleichen Fluoreszenzlebensdauertrend. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die Fluoreszenzlebensdauer von fluoreszierenden Molekülen in verschiedenen biologischen Kontexten zu bestimmen.

Forscher können quantitative Datenanalysen durchführen und interessierende Variablen gemäß diesem Verfahren bewerten, einschließlich der Zugabe von RNA-Liganden. Zukünftige Studien können Riboglow FLIM auf Krankheitsmodelle anwenden, die Multiplexing-Fähigkeiten erweitern und RNA-Dynamiken in lebenden Tiersystemen verfolgen.