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<ol><li>Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+Particles+in+Living+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA Particles in Living Yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Johansson, H. E., Liljas, L., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Recognition+by+the+MS2+Phage+Coat+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Virology%22%5BJournal%5D)">RNA Recognition by the MS2 Phage Coat Protein.</a> Seminars in Virology. 8 (3), 176-185 (1997).</li>
<li>Braselmann, E., Rathbun, C., Richards, E. M., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+RNA+Biology%3A+Tools+for+Imaging+RNA+in+Live+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Illuminating RNA Biology: Tools for Imaging RNA in Live Mammalian Cells.</a> Cell Chemical Biology. 27 (8), 891-903 (2020).</li>
<li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Mimics+of+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Mimics of Green Fluorescent Protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li>
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<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+RNA+polymerase+III+transcription+using+a+photostable+RNA%E2%80%93fluorophore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging RNA polymerase III transcription using a photostable RNA–fluorophore complex.</a> Nature Chemical Biology. 13 (11), 1187-1194 (2017).</li>
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<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+RNA+dynamics+in+live+cells+with+bright+and+stable+fluorescent+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).</li>
<li>Sunbul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+RNA+imaging+using+a+rhodamine-binding+aptamer+with+fast+exchange+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution RNA imaging using a rhodamine-binding aptamer with fast exchange kinetics.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 686-690 (2021).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550(2017).</li>
<li>Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Bratu, D. P., Cha, B. -J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li>
<li>Zuo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+dynamics+of+messenger+RNA+with+a+bright+and+stable+green+fluorescent+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the dynamics of messenger RNA with a bright and stable green fluorescent RNA.</a> Nature Chemical Biology. 20 (10), 1272-1281 (2024).</li>
<li>Grün, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolved+Protein+Imaging+Using+Bifunctional+Light-Up+Aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Super-Resolved Protein Imaging Using Bifunctional Light-Up Aptamers.</a> Angewandte Chemie International Edition. 63 (51), e202412810(2024).</li>
<li>Braselmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+riboswitch-based+platform+for+imaging+of+RNA+in+live+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A multicolor riboswitch-based platform for imaging of RNA in live mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 964-971 (2018).</li>
<li>Sarfraz, N., Moscoso, E., Oertel, T., Lee, H. J., Ranjit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+orthogonal+RNAs+simultaneously+in+live+mammalian+cells+by+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28FLIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Visualizing orthogonal RNAs simultaneously in live mammalian cells by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Nature Communications. 14 (1), 867(2023).</li>
<li>Sarfraz, N., Shafik, L. K., Stickelman, Z. R., Shankar, U., Moscoso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Riboglow-FLIM+probes+for+RNA+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluating Riboglow-FLIM probes for RNA sensing.</a> RSC Chemical Biology. 5 (2), 109-116 (2024).</li>
<li>Sarfraz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Riboglow-FLIM+to+visualize+noncoding+RNAs+inside+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishing Riboglow-FLIM to visualize noncoding RNAs inside live zebrafish embryos.</a> Biophysical Reports. 3 (4), 100132(2023).</li>
<li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%3A+fundamentals+and+advances+in+instrumentation%2C+analysis%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1(2020).</li>
<li>Stickelman, Z., Sarfraz, N., Rice, M. K., Lambeck, B. J., Milkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Riboglow-FLIM+Toolbox+with+Different+Fluorescence+Lifetime-Producing+RNA+Tags%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expanding the Riboglow-FLIM Toolbox with Different Fluorescence Lifetime-Producing RNA Tags.</a> Biochemistry. 64 (11), 2429-2438 (2025).</li>
<li>Shafik, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Linker+Architecture+in+RNA-Detecting+Riboglow+Probes+and+Effects+on+Fluorescence+Turn-On%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluating Linker Architecture in RNA-Detecting Riboglow Probes and Effects on Fluorescence Turn-On.</a> ACS Chemical Biology. 21 (2), 371-379 (2026).</li>
<li>Cialek, C. A., Galindo, G., Koch, A. L., Saxton, M. N., Stasevich, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bead+Loading+Proteins+and+Nucleic+Acids+into+Adherent+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62559(2021).</li>
<li>Sarfraz, N., Braselmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guide+to+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Practical guide to fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 36 (6), tp1(2025).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 mL Zentrifugenrohr</td><td>Abdos</td><td>P10402</td><td>Verwendet für Zellkultur und zum Aufbau des Bead Loaders</td></tr><tr><td>Cbl-3xGly-ATTO590</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Verwendet zur Erkennung von RNA im Riboglow-System, Syntheseinformationen verfügbar hier: https://doi.org/10.1021/acschembio.5c00917</td></tr><tr><td>Cbl-5xGly-ATTO590</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Verwendet zur Erkennung von RNA im Riboglow-System, Syntheseinformationen verfügbar hier: https://doi.org/10.1021/acschembio.5c00918</td></tr><tr><td>Zelltrennmedium</td><td>Gibco</td><td>12605-28</td><td>Verwendet für Zelltrennung und -transfer</td></tr><tr><td>Zell-Imaging-Schalen</td><td>Ibidi</td><td>81218-200</td><td>Verwendet für Live-Zell-Imaging</td></tr><tr><td>Zell-Mikroskopie DMEM</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td>Verwendet für Live-Zell-Imaging</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop-System</td><td>Nikon</td><td>&nbsp;AX</td><td>Verwendet für konfokale Zell-Imaging</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>1195-092</td><td>Verwendet für Säugerzellkultur</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cytiva</td><td>SH30910.03</td><td>Verwendet zur Serum-Ergänzung von DMEM</td></tr><tr><td>Fluoreszenzlebensdauer-Imaging (FLIM) Analysesoftware</td><td>PicoQuant</td><td>SymPhoTime 64, Version 2.9, Build 5818</td><td>Verwendet für FLIM-Analyse</td></tr><tr><td>Glasperlen</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4649</td><td>Verwendet, um Riboglow-Sonden in lebenden Zellen zu laden</td></tr><tr><td>Glaskover</td><td>VWR</td><td>48368 062</td><td>Verwendet für In-vitro-Imaging.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Verwendet zur Herstellung des RNA-Puffers.</td></tr><tr><td>High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0441</td><td>RNA-Transkriptions-Kit</td></tr><tr><td>Hybrid Photomultiplier Detektor</td><td>PicoQuant</td><td>PMA Hybrid Series</td><td>verwendet für Zeiten Photonen-Erkennung für Fluoreszenzlebensdauermessung.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td>Verwendet zur Herstellung des RNA-Puffers.</td></tr><tr><td>Live Cell Nuclei Stain</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>Verwendet zum Anfärben zellulärer Kerne während Live-Zell-Imaging</td></tr><tr><td>Mammalian Cell Cryo Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-567-501</td><td>Verwendet für die Lagerung von Säugerzellen</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>Verwendet zur Herstellung des RNA-Puffers.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugen-Röhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>90410</td><td>Allgemein verwendet in vitro und Zellkulturarbeiten</td></tr><tr><td>Mikroskopbasis</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Ti2 Eclipse</td><td>Verwendet für in vitro und zelluläres Imaging.</td></tr><tr><td>Mikroskopobjektiv</td><td>Nikon</td><td>N Plan Apochromat</td><td>Verwendet für in vitro und zelluläres Imaging.</td></tr><tr><td>Mikroskopbetriebssoftware/Bilderfassungs- und Analysesoftware</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements, Version 6.20.02.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikrovolumen-Spektrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Verwendet für DNA- und RNA-Konzentrations- und Reinheitsbestimmung</td></tr><tr><td>Multikanal-Ereignistimer</td><td>PicoQuant</td><td>MultiHarp 150</td><td>Verwendet für TCSPC zur Extraktion der Fluoreszenzlebensdauer aus in vitro und zellulären Proben.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td>Verwendet zur Herstellung des RNA-Puffers.</td></tr><tr><td>PBS, 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Verwendet für Zellwäschen und Perlenentfernung</td></tr><tr><td>Gepulster Diodenlaser und Laserkombinationseinheit</td><td>PicoQuant</td><td>Sepia PDL 828, PicoQuant LCU</td><td>Verwendet für Laser-Anregung von in vitro und zellulären Proben.</td></tr><tr><td>RNA-Aufreinigungs-Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>T2050L</td><td>RNA-Aufreinigungs-Kit</td></tr><tr><td>RNAse-Denaturierungsmittel</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>Verwendet zur Herstellung einer RNAse-freien Umgebung</td></tr><tr><td>Gewebekultur-Schalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012923</td><td>Verwendet für allgemeine Zellkultur und -pflege</td></tr></tbody></table>

charakterisierung von riboglow-sonden in vitro als grundlage für fluoreszenzlebenslange bildgebung in lebenden säugetierzellen und dreidimensionalen zellulären modellen

Characterizing Riboglow Probes In Vitro as the Basis for Fluorescence Lifetime Imaging In Live Mammalian Cells and Three-Dimensional Cellular Models

Charakterisierung von Riboglow-Sonden in vitro als Grundlage für fluoreszenzlebenslange Bildgebung in lebenden Säugetierzellen und dreidimensionalen zellulären Modellen

Nearly 80% of the human genome is transcribed into RNA, while less than 2% encode for proteins, indicating that the majority of mammalian transcripts are ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Visualisierung von RNA in lebenden Zellen, um die räumlich-zeitlichen Dynamiken von RNA zu untersuchen. Die Riboglow-Plattform verwendet quantitative Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie in mehrzelligen Systemen, die auf biologische Systeme in Gesundheit und Krankheit anwendbar ist. Um zu beginnen, beschaffen Sie die RNA-Proben oder Zellen mit perlenbeladenen Riboglow-Sonden.Schalten Sie das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop-System ein, gefolgt von der Mikroskop-Steuereinheit. Schalten Sie das auf zeitkorreliertem Einzelphotonenzählen basierende Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie- oder FLIM-System ein, einschließlich der Laser-Kombinationseinheit, des Photomultiplier-Detektors und des Ereignistimers. Nach dem Öffnen der NIS-Bildaufnahme- und Analysesoftware wählen Sie unter dem Setup- und Konfigurationsfenster AX mit PicoQuant.Sobald die Software hochgefahren ist, wählen Sie AX FLIM und FCS. Um das Mikroskop für die Fluoreszenzlebensdauer-Datenerfassung einzurichten, bestätigen Sie, dass Galvano im AX-Pad-Bereich ausgewählt ist. Setzen Sie den Mittelwert auf eins und die Verweildauer auf zwei.Im Laserleistungsbereich senken Sie die einzelnen Laser-Schieberegler auf 3 bis 4%. Setzen Sie den Schieberegler für alle Laser auf eins. Wählen Sie nach Auswahl des 20x-Objektivs in den Scanbereich-Einstellungen 512 mal 512 und aktivieren Sie die Detektoren. Um den Pfad der Datendatei zu definieren, gehen Sie zum unteren Teil des Controller-Bereichs und wählen Sie Konfigurieren.Nachdem Sie auf die Registerkarte PicoQuant oder FLIM FCS geklickt haben, wählen Sie unter Arbeitsspeicherpfad das Ordnersymbol auf der rechten Seite. Erstellen Sie am Speicherort einen neuen Ordner für die Experimente des Tages und schließen Sie das Konfigurationsfenster. Sobald Live ausgewählt ist und das Bilderfassungsfenster erscheint, wählen Sie erneut Live, um die Photonenerfassung zu pausieren.Um die Fenster für die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie oder FLIM-Datenerfassung einzurichten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Live-Bildfenster und wählen Sie das PicoQuant-Plugin. Aktivieren Sie die Anzeige der Zerfallskurve, der Zeitspur und der FLIM-Statistik. Um die Laseranordnung für das Zellexperiment einzurichten, gehen Sie zu den Experimenteinstellungen oben rechts auf der Seite neben den Lasern.Klicken Sie nach dem Klicken auf Hinzufügen neben dem Mehrkanal-Farbstoffkasten auf die gewünschten Farbstoffe. Wählen Sie den Expertenmodus. Passen Sie die Detektorzuweisungen für jedes Emissionsspektrum an.Routen Sie überlappende Anregungs- und Emissionsspektren zu verschiedenen Detektoren. Passen Sie auf der linken Seite die Durchlaufreihenfolge an, um die Übersprechen zwischen Farbstoffen mit überlappenden Anregungs- und Emissionsspektren zu minimieren. Nach dem Speichern und Benennen der neuen Laserkonfiguration wählen Sie die gespeicherte Konfiguration für das Experiment.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Live-Erwerbungsfenster. Wählen Sie Erfassungssteuerungen und dann XYZ-Übersicht. Bevor Sie die Bildgebungs-Zellkulturschale für FLIM laden, fügen Sie den lebenden Zellkernfarbstoff hinzu und mischen Sie ihn gründlich, indem Sie ihn sanft auf der Bank drehen, und lassen Sie ihn 30 Sekunden lang ruhen.Legen Sie die Bildgebungsschale auf die Mikroskopbühne. Schieben Sie die Schale in die linke untere Ecke der Mikroskopbühne. Kleben Sie die Probe auf die Bühne, wenn Sie keine Luftobjektive verwenden, um XY-Drift zu verhindern.Wechseln Sie zum 4'6-Diamidino-2-phenylindol oder DAPI-Kanal. Verwenden Sie den Steuerknopf, bis die Zellkerne in den Fokus kommen. Passen Sie bei Bedarf die Empfindlichkeit des Z-Höhenknopfes an, und wenn Zellen nicht sichtbar sind, passen Sie die XY-Koordinaten an.Um das perfekte Fokussystem oder PFS-Autofokus zu aktivieren, wählen Sie auf der rechten Seite des AX-Bedienfelds die Lupe neben der PFS-Schaltfläche. Sobald das Mikroskop die Z-Höhe automatisch normalisiert hat, bestätigen Sie, dass die PFS-Schaltfläche leuchtet und im Fokus angezeigt wird. Mithilfe des AX-Detektors finden Sie die gewünschten Zellen mithilfe des DAPI-Kanals.Wechseln Sie dann zum ATO 590-Kanal, um perlenbeladene Zellen effektiv zu identifizieren. Sobald eine Zelle identifiziert und durch Doppelklick zentriert wurde, wechseln Sie zu AX FLIM und FCS. Stellen Sie sicher, dass 512 mal 512 ausgewählt ist, und passen Sie die Rahmengröße an, indem Sie die Ecken anklicken und ziehen, um sie an die Zelle anzupassen.Lassen Sie den neu gestalteten Rahmen rot werden. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den Rahmen oder wählen Sie Live, bis der Rahmen grün wird, um die Anpassung zu bestätigen. Nachdem Sie die Anzahl der Aufnahmen auf den gewünschten Wert eingestellt haben, wählen Sie Erfassung.Beobachten Sie das neue Erfassungsfenster und das Erfassungsfortschrittsfeld auf der rechten Seite des Bildschirms. Sobald die FLIM-Analysesoftware geöffnet ist, navigieren Sie zum richtigen Dateipfad. Beobachten Sie, wie die Aufnahmen automatisch das Analysesoftwarefenster auffüllen.Benennen Sie die Aufnahmen um, während sie gesammelt werden. Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, wechseln Sie zurück zum AX-Detektor. Wählen Sie Live, um nach einer neuen Zelle zu suchen.Passen Sie die Größe des AX FLIM- und Fluoreszenzkorrrelationsspektroskopie- oder FCS-Fensters nach Bedarf für größere oder kleinere Zellen an. Exportieren Sie nach dem Erwerb neuer Zellen während des dreistündigen Bildgebungszeitraums die erstellte sptw-Datei. Fahren Sie mit der FLIM-Datenverarbeitung und -analyse fort, um Fluoreszenzlebensdauer-Messungen aus den gesammelten Proben zu extrahieren.Repräsentative Zerfallskurven zeigten, dass das Vorhandensein des RNA A-Tags die extrahierte Fluoreszenzlebensdauer in vitro erhöhte, während Proben ohne den RNA A-Tag linksverschobene Zerfallskurven zeigten, was auf kürzere durchschnittliche Lebensdauern hinweist. Die zellulären Fluoreszenzlebensdauern von Zellen, die mit 3xGly perlenbeladen waren, waren signifikant niedriger als die von Zellen, die mit 5xGly perlenbeladen waren. Repräsentative Zerfallskurven zeigten, dass Zellen, die mit 3xGly perlenbeladen waren, linksverschobene Zerfallskurven im Vergleich zu Zellen aufwiesen, die mit 5xGly perlenbeladen waren, was auf niedrigere durchschnittliche Fluoreszenzlebensdauern hinweist.Der Zellkern von mit Riboglow-Sonde perlenbeladenen Zellen zeigte konsistent höhere Fluoreszenzlebensdauern als das Zytosol derselben Zelle. Das falsche Farbskalen-Erfassungsfenster, die Zerfallskurven und die extrahierten tau-Mittelwertamplitudenwerte zeigten alle den gleichen Fluoreszenzlebensdauertrend. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die Fluoreszenzlebensdauer von fluoreszierenden Molekülen in verschiedenen biologischen Kontexten zu bestimmen.Forscher können quantitative Datenanalysen durchführen und interessierende Variablen gemäß diesem Verfahren bewerten, einschließlich der Zugabe von RNA-Liganden. Zukünftige Studien können Riboglow FLIM auf Krankheitsmodelle anwenden, die Multiplexing-Fähigkeiten erweitern und RNA-Dynamiken in lebenden Tiersystemen verfolgen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier zeigen wir die Protokolle für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Bakterienzellen, damit funktionale molekulare Komplexe detektiert werden, verfolgt und quantifiziert.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Durch den Einsatz einer spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie-System sind auf Pixel-Ebene Karten von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Wirkungsgrade für Zellen, die Membran-Rezeptoren angenommen, dass sie homo-oligomeren Komplexen Form erhalten. Von der Effizienz Karten FRET, sind wir in der Lage, stöchiometrische Informationen über die Oligomer-Komplex unter-Studie zu schätzen.

In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) wurden als wesentliche Technik, um Bild die Umwelt und die Interaktion bestimmter Proteine ​​und Farbstoffe, die in lebenden Zellen entstanden. FLIM fluoreszierender molekularer Rotoren ermöglicht die Zuordnung der Viskosität in lebenden Zellen.

Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

Zeitraffer-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Autophagie Marker erlaubt die Überwachung der dynamischen Autophagie Reaktion mit hoher zeitlicher Auflösung. Mit spezifischen Autophagie und Organellen Marker in einer Kombination aus 3 verschiedenen Farben, können wir folgen den Beitrag eines Proteins an Autophagosom Bildung in einem robusten räumlichen und zeitlichen Kontext.

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Ratiometrische bimolekularen Beacons (RBMBs), um die Bild einzigen entwickelt RNA-Transkripte in lebenden Zellen verwendet werden. Hier beschreiben wir die Herstellung und Reinigung von RBMBs, Lieferung RBMBs in Zellen von Mikroporation und fluoreszierende Abbildung einzelner RNA-Transkripte in Echtzeit.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

Studien von Biomolekülen in vivo sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Funktion in einem biologischen Kontext. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die es ermöglicht, fluoreszierende Biomoleküle, wie DNA oder Proteine, in lebende Mikroorganismen zu internalisieren. Die Analyse von in vivo-Daten, die durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, wird ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines neuen, schnellen optischen Bildgebungsgeräts für die makroskopische Photolumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von Proben mit langem Zerfall. Die Integrations-, Bildaufnahme- und Analyseverfahren werden ebenso beschrieben wie die Präparation und Charakterisierung der Sensormaterialien für die Bildgebung und die Anwendung des Imagers bei der Untersuchung biologischer Proben.

Fluoreszenzlebensdauer-Makro-Imager für biomedizinische Anwendungen

In diesem Artikel beschreiben wir verschiedene Methoden zur Bildung von multizellulären Sphäroiden, um eine anschließende Multiparameter-Lebendzellmikroskopie durchzuführen. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM), zellulärer Autofluoreszenz, Färbefarbstoffen und Nanopartikeln wird der Ansatz zur Analyse des Zellstoffwechsels, der Hypoxie und des Zelltods bei lebenden dreidimensionalen (3D) Krebs- und Stammzell-abgeleiteten Sphäroiden demonstriert.

Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden

Hier beschreiben wir Protokolle Säugerzellen durch Solid-State-Fräsen bei einer kryogenen Temperatur zu stören, um einen Zellextrakt aus der resultierenden Zelle Pulver produzieren, und Proteinkomplexe von Interesse durch Affinitätseinfangen auf Antikörper-gekoppelten Mikrometer-Maßstab paramagnetischen Perlen zu isolieren.

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

751 Aufrufe.  Georgetown University. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Visualisierung von RNA in lebenden Zellen, um die räumlich-zeitlichen Dynamiken von RNA zu untersuchen. Die Riboglow-Plattform verwendet quantitative Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie in mehrzelligen Systemen, die auf biologische Systeme in Gesundheit und Krankheit anwendbar ist. Um zu beginnen, beschaffen Sie die RNA-Proben oder Zellen mit perlenbeladenen Riboglow-Sonden.Schalten Sie das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop-System ...

Serie: Charakterisierung von Riboglow-Sonden in vitro als Grundlage für fluoreszenzlebenslange Bildgebung in lebenden Säugetierzellen und dreidimensionalen zellulären Modellen

Charakterisierung von Riboglow-Sonden in vitro als Grundlage für fluoreszenzlebenslange Bildgebung in lebenden Säugetierzellen und dreidimensionalen zellulären Modellen

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