Name: Rekombinante Produktion und Reinigung von Hydrophobin SC16 aus Escherichia coli sowie Überwachung ihrer Selbstassemblierung mittels Fluoreszenztests (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Erfahren Sie die rekombinante Produktion und Reinigung von Hydrophobin SC16 aus Escherichia coli sowie die Überwachung der Selbstassemblierung mittels Thioflavin-T-Fluoreszenztests. Diese Methode liefert ≥5 mg gereinigtes Protein.

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<table><tbody><tr><td>2-(N-morpholino)ethansulfonsäure (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145224-94-8</td><td>Pufferkomponente für Selbstmontage-Assays</td></tr><tr><td>5 mL Rundboden-Polystyrol-Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td>Verwendet für Selbstmontage-Assays mit niedriger Durchsatzleistung</td></tr><tr><td>96-Well schwarze Polystyrol-Mikrotiterplatte</td><td>Grenier</td><td>655076</td><td>Verwendet für Fluoreszenzmessungen im Mikroplattenleser</td></tr><tr><td>Acryl/Bis-acrylamid (29:1) Lösung (40%)</td><td>BioShop</td><td>ACR004.500</td><td>Verwendet zur Herstellung von SDS-PAGE-Gelen</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR002.1</td><td>Agar zur Herstellung von Ampicillin-resistenten LB-Platten</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02040</td><td>Antibiotikum, das in LB-Agarplatten verwendet wird</td></tr><tr><td>Baffled 2,8 L Fernbach-Kolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>955239</td><td>Verwendet für den Wachstums von Bakterienkulturen in großen Volumina</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>TCI Chemicals</td><td>60-24-2</td><td>Reduktionsmittel, das bei der SDS-PAGE-Stichprobenvorbereitung verwendet wird</td></tr><tr><td>Säule (1,5 cm Durchmesser Schwerkraftsäule)</td><td>Bio-Rad</td><td>7371522</td><td>Verwendet für Nickel-Affinitätsreinigung</td></tr><tr><td>Dialyseschlauch (3500 kDa MWCO)</td><td>BioDesign</td><td>D302</td><td>Verwendet für Pufferaustausch während der Reinigung</td></tr><tr><td>Emissionsfilter</td><td>Edmund Optics</td><td>84080</td><td>Verwendet für ThT-Assays (494 nm, Bandbreite 20 nm)</td></tr><tr><td>Anregungsfilter</td><td>Edmund Optics</td><td>67012</td><td>Verwendet für ThT-Assays (438 nm, Bandbreite 24 nm)</td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite F200 Pro</td><td>Verwendet zur Messung der ThT-Fluoreszenzintensität</td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Lab Fish</td><td>HS5C</td><td>Verwendet für Wasserbad-Einrichtung mit Temperaturüberwachung</td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-212</td><td>Verwendet für pH-Wert-Anpassung von Puffern</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>TCI Chemicals</td><td>288-32-4</td><td>Verwendet in IMAC-Reinigung (Wasch- und Elutionspuffern)</td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367-93-1</td><td>Induziert Proteinexpression in E. coli</td></tr><tr><td>LB-Bouillon (Lennox)</td><td>BioShop</td><td>LBL405.5</td><td>Wachstumsmedium für Bakterienkultur</td></tr><tr><td>Niedrig-Geschwindigkeits-Kühlzentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>360291</td><td>Verwendet zum Pelletieren von Zellen vor der Lagerung</td></tr><tr><td>Nickel NTA Agarose-Perlen</td><td>GoldBio</td><td>H-350-50</td><td>Harz, das für die Affinitätsreinigung von His-markierten Proteinen verwendet wird</td></tr><tr><td>SC16 Plasmid</td><td>BioBasic</td><td>N/A</td><td>Benutzerdefinierter DNA-Konstrukt, der für H-GB1-SC16 Fusionsprotein kodiert</td></tr><tr><td>SHuffle T7 Express kompetentes E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C3029J</td><td>Gaststamm, der für rekombinante Proteinexpression verwendet wird</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>BioShop</td><td>SOD001.5</td><td>Pufferkomponente und Ionenstärkeregler</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Fisher Chemical</td><td>SS255-1</td><td>Verwendet für pH-Wert-Anpassung von Puffern</td></tr><tr><td>Natriumphosphat</td><td>BioShop</td><td>SPD579.1</td><td>Pufferkomponente zur pH-Wert-Aufrechterhaltung</td></tr><tr><td>Spektrophotometer</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>5096</td><td>Verwendet für die Quantifizierung von SC16</td></tr><tr><td>Thioflavin T (ThT)</td><td>Acros Organics</td><td>2390-54-7</td><td>Fluoreszierende Farbstoff, der zur Überwachung der Proteinselbstmontage verwendet wird</td></tr><tr><td>Thrombin-Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04-04-9002</td><td>Verwendet zum Schneiden des H-GB1-SC16 Fusionsproteins</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)</td><td>BioShop</td><td>TRS001.5</td><td>Puffer, der in Reinigungs- und Assay-Lösungen verwendet wird</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge</td><td>Sorvall</td><td>46915</td><td>Verwendet zur Klärung des Lysats nach Zelllyse</td></tr><tr><td>SDS-PAGE-Setup</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU</td><td>Verwendet zur Herstellung und Durchführung von SDS-PAGE-Gelen</td></tr></tbody></table>

rekombinante produktion und reinigung von hydrophobin sc16 aus escherichia coli sowie Überwachung ihrer selbstassemblierung mittels fluoreszenztests

Recombinant Production And Purification of Hydrophobin SC16 From Escherichia coli And Monitoring of Its Self-Assembly Using Fluorescence Assays

Rekombinante Produktion und Reinigung von Hydrophobin SC16 aus Escherichia coli sowie Überwachung ihrer Selbstassemblierung mittels Fluoreszenztests

Hydrophobins are small amphipathic proteins that self-assemble at hydrophobic&#8211;hydrophilic interfaces to form stable waterproof coatings over fungal ...

recombinant-production-purification-hydrophobin-sc16-from-escherichia

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In der Post-Genom-Ära menschlicher, ist die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen in nativer Konformation darauf an, strukturelle, funktionelle und therapeutische Forschung und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Test-und Proteomik-Expressionssystem in humanen embryonalen Nierenzellen 293T-Zellen, die verwendet werden, um eine Vielzahl von rekombinanten Proteinen hergestellt werden können.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Ein Protokoll für die quantitative, Expressionsscreening mit hohem Durchsatz und analytischen Reinigung von Fusionsproteinen aus kleinen Escherichia coli-Kulturen beschrieben und auf die Expression von Disulfid-reichen Tiergift-Protein-Targets aufgebracht.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Elastin-ähnliche Polypeptide sind stimuliresponsiven Biopolymeren mit Anwendungen von rekombinanten Proteinreinigung zu Drug Delivery. Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung und Charakterisierung von Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Peptid-oder Protein-Fusionen aus Escherichia coli unter Verwendung der unteren kritischen Lösungstemperatur Phasenübergangsverhalten, wie eine einfache Alternative zur Chromatographie.

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus<em&gt; Escherichia coli</em

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Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

Weg zur Rationalisierung der Screening für die Expression des rekombinanten Membranproteine ​​in Escherichia coli, basierend auf Fusions grün fluoreszierendes Protein dargestellt.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

Es wird ein zweistufiges chromatographisches Verfahren zur Aufreinigung von rekombinanten Shadoo-Proteinen beschrieben, die als Einschlusskörper in Escherichia coli exprimiert werden, sowie ein Protokoll zur Fibrillation von gereinigtem Shadoo in Amyloidstrukturen.

Reinigung und Rückfaltung an Amyloidfibrillen von (His)<sub&gt; 6</sub&gt; -markierte Recombinant Protein Shadoo als Einschlusskörper in Ausgedrückt<em&gt; E. coli</em

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die Kosten und die notwendige Ausrüstung für E. Colizu generieren-basierte Zellextrakte und in-vitro- Protein Synthesereaktionen innerhalb von 4 Tagen oder weniger zu implementieren. Um die flexiblen Charakter dieser Plattform für breite Anwendungen nutzen zu können, diskutieren wir Reaktionsbedingungen, die angepasst und optimiert werden können.

Escherichia coli-basierte zellfreie Proteinsynthese: Protokolle für eine robuste, flexible und zugängliche Plattform-Technologie

Dieser Artikel beschreibt ein FRET-basiertes Flow-Zytometrie-Protokoll zur Quantifizierung der Protein-Selbstmontage in s. cerevisiae- und HEK293T-Zellen.

Erkennung und Charakterisierung der Protein-Selbstmontage in Vivo durch Durchflusszytometrie

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An der Schnittstelle von organischen und wässrigen Lösungsmitteln fügen sich maßgeschneiderte amphiphile Elastin-ähnliche Proteine zu komplexen supramolekularen Strukturen wie Vesikeln, Fasern und Koacervaten zusammen, die durch Umweltparameter ausgelöst werden. Die beschriebenen Montageprotokolle ergeben Proteinmembran-basierte Fächer (PMBCs) mit abstimmbaren Eigenschaften, die die Verkapselung verschiedener Ladungen ermöglichen.

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Schnelle Produktion rekombinanter menschlicher SLFN14-Ribonuklease und stöchiometrische Analyse mittels Massenphotometrie

Erfahren Sie die rekombinante Produktion und Reinigung von Hydrophobin SC16 aus Escherichia coli sowie die Überwachung der Selbstassemblierung mittels Thioflavin-T-Fluoreszenztests. Diese Methode liefert ≥5 mg gereinigtes Protein.

Rekombinante Produktion und Reinigung von Hydrophobin SC16 aus Escherichia coli sowie Überwachung ihrer Selbstassemblierung mittels Fluoreszenztests (Video) | JoVE Journal

Rekombinante Produktion und Reinigung von Hydrophobin SC16 aus Escherichia coli sowie Überwachung ihrer Selbstassemblierung mittels Fluoreszenztests

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