Name: Ein In-vitro-Test für den LpxC-Abbau durch den membrangebundenen Protese FtsH und den Adaptor LapB aus Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Lernen Sie einen quantitativen In-vitro-Abbau-Assay für LpxC durch die AAA+-Protease FtsH und den Adaptor LapB in Proteoliposomen. Diese fluoreszenzbasierte Methode ermöglicht die kinetische Analyse membrangebundener Proteolyse.

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<ol><li>Sauer, R. T., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aaa%2B+proteases%3A+ATP-fueled+machines+of+protein+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Aaa+ proteases: ATP-fueled machines of protein destruction.</a> Annu Rev Biochem. 80 (1), 587-612 (2011).</li>
<li>Neuwald, A. F., Aravind, L., Spouge, J. L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA%3A+A+class+of+chaperone-like+ATPases+associated+with+the+assembly%2C+operation%2C+and+disassembly+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">AAA: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes.</a> Genome Res. 9 (1), 27-43 (1999).</li>
<li>Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+substrate+denaturation+and+translocation+by+the+ClpxP+degradation+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpxP degradation machine.</a> Mol Cell. 5 (4), 639-648 (2000).</li>
<li>Gur, E., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+misfolded+proteins+by+Lon%2C+a+AAA%2B+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Recognition of misfolded proteins by Lon, a AAA+ protease.</a> Genes Dev. 22 (16), 2267-2277 (2008).</li>
<li>Ogura, T., Wilkinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aaa%2B+superfamily+ATPases%3A+Common+structure-diverse+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Aaa+ superfamily ATPases: Common structure-diverse function.</a> Genes Cells. 6 (7), 575-597 (2001).</li>
<li>Tomoyasu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+FtsH+protein+is+a+prokaryotic+member+of+a+protein+family+of+putative+ATPases+involved+in+membrane+functions%2C+cell-cycle+control%2C+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli FtsH protein is a prokaryotic member of a protein family of putative ATPases involved in membrane functions, cell-cycle control, and gene expression.</a> J Bacteriol. 175 (5), 1344-1351 (1993).</li>
<li>Tomoyasu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+and+subcellular+localization+of+FtsH+protein+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 175 (5), 1352-1357 (1993).</li>
<li>Ito, K., Akiyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+functions%2C+mechanism+of+action%2C+and+regulation+of+FtsH+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cellular functions, mechanism of action, and regulation of FtsH protease.</a> Annu Rev Microbiol. 59 (1), 211-231 (2005).</li>
<li>Chai-Danino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-embedded+polar+residues+target+membrane+proteins+for+degradation+by+the+quality+control+protease+FtsH%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Membrane-embedded polar residues target membrane proteins for degradation by the quality control protease FtsH.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Arends, J., Thomanek, N., Kuhlmann, K., Marcus, K., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+trapping+of+ftsh+substrates+by+label-free+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">In vivo trapping of ftsh substrates by label-free quantitative proteomics.</a> Proteomics. 16 (24), 3161-3172 (2016).</li>
<li>Westphal, K., Langklotz, S., Thomanek, N., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trapping+approach+reveals+novel+substrates+and+physiological+functions+of+the+essential+protease+ftsh+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A trapping approach reveals novel substrates and physiological functions of the essential protease ftsh in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 287 (51), 42962-42971 (2012).</li>
<li>Young, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+envA+permeability+cell+division+gene+of+Escherichia+coli+encodes+the+second+enzyme+of+lipid+a+biosynthesis%3A+UDP-3-o-%28r-3-hydroxymyristoyl%29-n-acetylglucosamine+deacetylase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The envA permeability cell division gene of Escherichia coli encodes the second enzyme of lipid a biosynthesis: UDP-3-o-(r-3-hydroxymyristoyl)-n-acetylglucosamine deacetylase.</a> J Biol Chem. 270 (51), 30384-30391 (1995).</li>
<li>Ogura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balanced+biosynthesis+of+major+membrane+components+through+regulated+degradation+of+the+committed+enzyme+of+lipid+a+biosynthesis+by+the+AAA+protease+FtsH+%28HflB%29+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Balanced biosynthesis of major membrane components through regulated degradation of the committed enzyme of lipid a biosynthesis by the AAA protease FtsH (HflB) in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 31 (3), 833-844 (1999).</li>
<li>Klein, G., Kobylak, N., Lindner, B., Stupak, A., Raina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+requires+the+essential+LapB+heat+shock+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly of lipopolysaccharide in Escherichia coli requires the essential LapB heat shock protein.</a> J Biol Chem. 289 (21), 14829-14853 (2014).</li>
<li>Mahalakshmi, S., Sunayana, M. R., Saisree, L., Reddy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YciM+is+an+essential+gene+required+for+regulation+of+lipopolysaccharide+synthesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">YciM is an essential gene required for regulation of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 91 (1), 145-157 (2014).</li>
<li>Nicolaes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+function+of+YciM%2C+a+heat+shock+membrane+protein+required+to+maintain+envelope+integrity+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Insights into the function of YciM, a heat shock membrane protein required to maintain envelope integrity in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 196 (2), 300-309 (2014).</li>
<li>Shu, S., Tsutsui, Y., Nathawat, R., Mi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+LapB+%28yciM%29+in+regulating+Escherichia+coli+lipopolysaccharide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dual function of LapB (yciM) in regulating Escherichia coli lipopolysaccharide synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (17), e2321510121(2024).</li>
<li>Shu, S., Mi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+of+lipopolysaccharide+synthesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli.</a> Nat Commun. 13 (1), 4576(2022).</li>
<li>Tomoyasu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+FtsH+is+a+membrane-bound%2C+ATP-dependent+protease+that+degrades+the+heat-shock+transcription+factor+sigma%2832%29%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli FtsH is a membrane-bound, ATP-dependent protease that degrades the heat-shock transcription factor sigma(32).</a> EMBO J. 14 (11), 2551-2560 (1995).</li>
<li>Yang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-degradation+relationship+of+a+membrane+protein+mediated+by+the+universally+conserved+ATP-dependent+protease+FtsH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Folding-degradation relationship of a membrane protein mediated by the universally conserved ATP-dependent protease FtsH.</a> J Am Chem Soc. 140 (13), 4656-4665 (2018).</li>
<li>Geertsma, E. R., Mahmood, N. A. B. N., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).</li>
<li>Asahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsH+recognizes+proteins+with+unfolded+structure+and+hydrolyzes+the+carboxyl+side+of+hydrophobic+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">FtsH recognizes proteins with unfolded structure and hydrolyzes the carboxyl side of hydrophobic residues.</a> J Biochem. 127 (5), 931-937 (2000).</li>
<li>Kihara, A., Akiyama, Y., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+regulation+of+lysogenic+decision+in+bacteriophage+lambda%3A+Transmembrane+modulation+of+FtsH+%28HflB%29%2C+the+cII+degrading+protease%2C+by+HflKC+%28HflA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Host regulation of lysogenic decision in bacteriophage lambda: Transmembrane modulation of FtsH (HflB), the cII degrading protease, by HflKC (HflA).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (11), 5544-5549 (1997).</li>
</ol>

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<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>USA scientific</td><td>1415-2500</td><td></td></tr><tr><td>200 nm Polycarbonatmembran</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>4-20% SDS-PAGE</td><td></td><td></td><td>Selbstgemacht</td></tr><tr><td>Adenosin 5'-triphosphat Dinatriumsalz-Hydrat</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Atto 488 Protein-Markierungs-Kit</td><td>Sigma</td><td>38371</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>152-8920</td><td>Nichtpolares Polystyrol-Adsorbens</td></tr><tr><td>Schwarze 96-Well-Platte</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenolblau</td><td>Sigma</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliantblau R250</td><td>Sigma</td><td>1.12553</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Filterunterstützung</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>Glasspritze</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610017</td><td></td></tr><tr><td>Glasteströhrchen</td><td>KIMBLE</td><td>45066-16150</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Avantor</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetat-Tetrahydrat</td><td>Sigma</td><td>228648</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75-002-436</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extrudierer</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>MLA-80 Rotor</td><td>Beckman</td><td>367096</td><td>Festwinkelrotor</td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000 PRO</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002559</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>American Bio</td><td>AB01920-00500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat</td><td>Sigma</td><td>38400100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat dibasisch</td><td>Sigma</td><td>567547</td><td></td></tr><tr><td>Sonigator</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-11201</td><td></td></tr><tr><td>Spektrophotometer</td><td>SCILOGEX</td><td>SCI-V1000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td>Hochauflösende Gelfiltrationssäule</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima MAX-XP</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>Trichloressigsäure</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafiltrationssäule</td><td>Millipore</td><td>UFC8030</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 Mischer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Zinkacetat-Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>379786</td><td></td></tr><tr><td>β-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>
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ein in-vitro-test für den lpxc-abbau durch den membrangebundenen protese ftsh und den adaptor lapb aus escherichia coli

An In Vitro Assay For LpxC Degradation By The Membrane-Bound Protease FtsH And Adaptor LapB From Escherichia coli

Ein In-vitro-Test für den LpxC-Abbau durch den membrangebundenen Protese FtsH und den Adaptor LapB aus Escherichia coli

This protocol presents a sensitive, quantitative in vitro degradation assay of LpxC using reconstituted AAA+ (ATPase associated with diverse cellular ...

E. coli regulieren die Lipopolysaccharid-Synthese, indem sie den LPS-Abbau kontrollieren. Diese Studie konzentriert sich auf die Etablierung eines in-vitro-Abbauassays für LPS. Dieses Protokoll kann zur quantitativen Messung der FtsH-vermittelten Proteolyse wasserlöslicher Substrate angewendet werden.Beginnen Sie damit, das LpxC-Protein zu gewinnen. Verdünnen Sie 0,5 Milligramm des Proteins in 50 Millimolar Phosphatpuffer bei pH 7,6 auf ein Endvolumen von 225 Mikrolitern. Geben Sie 25 Mikroliter 1 Molarem Natriumbicarbonat hinzu, um den pH-Wert auf etwa 8,3 einzustellen. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von Atto488 vor, indem Sie 2 Mikroliter der zuvor hergestellten Stammlösung mit 18 Mikrolitern 0,1 Molarem Natriumbicarbonatpuffer verdünnen, um eine Endkonzentration von 0,0012 Milligramm pro Mikroliter zu erhalten. Geben Sie unmittelbar 4 Mikroliter der Atto488-Arbeitslösung zur Proteiniösung hinzu. Nachdem Sie das Röhrchen in Aluminiumfolie eingewickelt haben, stellen Sie es bei 4 Grad Celsius unter leichtem Rühren für zwei Stunden. Waschen Sie die PD-10-Desalting-Säule mit 10 Milliliter ultrareinem Wasser und equilibrieren Sie die Säule anschließend mit 15 Milliliter Phosphatpuff

an-vitro-assay-for-lpxc-degradation-membrane-bound-protease-ftsh

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die Aktivität der induzierbaren Lysin-Decarboxylase wird durch Umsetzung des Substrates L-Lysin und das Produkt Cadaverin mit 2,4,6-trinitrobenzensulfonic Säure-Addukte, die unterschiedliche Löslichkeit in Toluol Form überwacht.

Ein Assay zur Messung der Aktivität von Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Um die Wechselwirkung eines Proteins mit seiner Ziel-Lipid verwendeten wir MACS und Annexin V-konjugierten magnetischen Kügelchen und Lipid-Vesikel, die aus der Ziel-Lipid-und Annexin V-Bindung Phosphatidylserin synthetisiert testen. Gebundene Proteine ​​zum Ziel Lipid sind co-gereinigt und analysiert nach der Elution von den Beads.

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

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Wir stellen ein Protokoll für die in vitro Untersuchung der Effluxpumpen von Pseudomonas aeruginosa. Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung eines robusten, reversibel und abstimmbare Protonengradienten in der Liposomenmembran und daher sollte anpassungsfähig an jede Membranprotein vom protomotive Kraft erregt werden.

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Diese Arbeit stellt eine Methode des Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung eines universellen genetischen Enzym-Screening-Systems vor, das theoretisch auf über 200 Enzyme angewendet werden kann. Dabei identifiziert das Single-Screening-System drei verschiedene Enzyme (Lipase, Cellulase und alkalische Phosphatase) durch einfaches Wechseln des verwendeten Substrats (p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid und Phenylphosphat).

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

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