Amikacin-Schutztest zur Quantifizierung und Visualisierung der Escherichia-coli-Zellinvasion

Wir konzentrieren uns darauf, zu charakterisieren, wie adhärente invasive E.coli in intestinale Epithelzellen eindringen und bakterielle Faktoren zu identifizieren, die zu diesem Prozess beitragen. Gentamycinresistente Isolate begrenzen traditionelle Invasionstests. Dieses amikacinbasierte Protokoll ermöglicht eine genaue Quantifizierung intrazellulärer Bakterien.

Um zu beginnen, sammeln Sie alle Reagenzien und Medien, die für den Invasionstest benötigt werden. Als Nächstes entnehmen Sie den gefrorenen Glycerolbestand des adhärent-invasiven Escharicia colli, oder AIEC, aus dem 80-Grad-Gefrierschrank. Mit einer sterilen Holzstab- oder Pipettenspitze kratzen Sie vorsichtig Bakterien vom Stängel ab und streichen Sie sie auf eine Luria-Bertani- oder LB-Schneckenscheite, um einzelne Kolonien zu erhalten.

Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag wählt man mit einer sterilen Holzstäbchen- oder Pipettenspitze eine einzelne Kolonie von der Schneckenplatte ab. Impfe die Kolonie in 3 Milliliter LB-Brühe und brüte die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius bei 200 Umdrehungen pro Minute aus.

Dann führen Sie eine 1 bis 10 Verdünnung der Übernachtkultur in 1 Milliliter LB-Brühe durch. Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern der verdünnten Kultur mit einem Spektrophotometer. Übertragen Sie 100 Mikroliter der Übernachtkultur in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und zentrifugieren Sie bei 6.000 G für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius.

Aspirieren Sie das Supernatant vorsichtig, ohne das Zellpellet zu stören, und suspendieren Sie das Pellet erneut in 1 Milliliter Serum und antibiotika-antimykotikafreiem Medien. Berechnen Sie das erforderliche Volumen bakterieller Suspension, um eine Multiplizität der Infektion oder MOI von 10 mit der bereitgestellten Formel zu erreichen. Zur Vorbereitung des Infektionsmediums wird das berechnete Volumen der bakteriellen Suspension in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen und das Volumen auf 1 Milliliter mit Serum und antibiotika-antimykotisch-freiem Medium hergestellt.

Mischen Sie vorsichtig, indem Sie mehrmals auf und ab pipetten. Bereiten Sie eine 96-Well-Platte vor, um die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter der verdünnten nächtlichen Bakterienkultur durch zehnfache Serienverdünnungen in sterilem 1X PBS zu bestimmen. Übertragen Sie 200 Mikroliter der verdünnten Übernachtkultur in den ersten Brunnen der Platte.

Pipettieren Sie 20 Mikroliter der Kultur in die nächste Reihe, die 180 Mikroliter 1x PBS enthält. Rühren Sie durch Pipetteren 10 Mal auf und ab und wiederholen Sie den Verdünnungsvorgang, bis Sie 10 in der Potenz 6 erreichen, wobei Sie jedes Mal eine frische Pipettenspitze verwenden. Jetzt werden 10 Mikroliter Punktverdünnungen in dreifachem Satz von 10 in der Potenz von 2 bis 10 bis zur Potenz von 6 auf LB-Schneckenplatten verdünnt.

Lassen Sie die Stellen in der Nähe einer Flamme in die Schnecke einziehen. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 27 bis 30 Grad Celsius, um Überwucherung der Kolonie zu verhindern und klare einzelne Kolonien zu erhalten. Entfernen Sie die gesunden, konfluenten Caco-2-Epithelzellmonolagen, die in einer kollagenbeschichteten 24-Wellen-Kulturplatte aus dem Inkubator kultiviert wurden, und aspirieren Sie das vollständige Medium aus jedem Brunnen.

Pipettieren Sie jeweils einen Milliliter Serum und antibiotika-antimykotikafreies Medium in jede Mulde. Aspirieren Sie das Medium, um Spuren zu entfernen, und wiederholen Sie das Wash noch einmal für insgesamt zwei Waschen. Geben Sie nun 1 Milliliter des zuvor vorbereiteten Infektionsmediums mit AIEC in jede Welle der 24-Well-Platte mit den Caco-2-Zellen.

Zentrifugieren Sie die 24-Wellen-Platte bei 500 G für 15 Minuten bei Raumtemperatur, um den Kontakt der Bakterien mit der Epithelmonoschicht zu synchronisieren, und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für drei Stunden, um eine bakterielle Invasion zu ermöglichen. Bereiten Sie antibiotikahaltige Medien vor, indem Sie 240 Mikrogramm Amikacin pro Milliliter zu vorerwärmtem Serum und antibiotika-antimykotikafreiem Medium hinzufügen. Nach der Infektionsphase wird das Medium aus den Caco-2-Zellmonoschichten aspiriert und jede Welle mit 1 Milliliter Serum und antibiotika-antimykotisch-freiem Medium gewaschen.

Aspirieren Sie das Medium und wiederholen Sie die Waschphase noch einmal für insgesamt zwei Waschen. Dann pipettieren Sie einen Milliliter mit 240 Mikrogramm pro Milliliter Amikacin-haltiges Medium in jede Mulde. Parallel dazu wird eine weitere Zellgruppe mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin behandelt und die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für eine Stunde inkubiert, um extrazelluläre Bakterien zu eliminieren.

Nach der Inkubation wird das Medium aus jedem Brunnen aspiriert. Gib 1 Milliliter PBS hinzu, um haftende Bakterien abzuwaschen. Aspirieren Sie das PBS und wiederholen Sie das Waschen noch einmal für insgesamt zwei Waschen.

Fügen Sie nun 200 Mikroliter von 1 % Triton X100, verdünnt in PBS, in jedes Bohrloch hinzu und inkubieren Sie auf einem Orbitalshaker mit 90 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten, um die Epithelzellen zu lysieren. Pipette etwa 30 Mal pro Bohrloch, um die Zellen von der Platte abzutrennen. Anschließend führen Sie zehnfache serielle Verdünnungen der Zelllysate in einer 96-Well-Platte mit PBS durch.

Blase 10 Mikroliter Punktverdünnungen in dreifachem Teil, von unverdünnten auf 10 Potenz von 3 Verdünnungen auf LB-Schneckenplatten. Nachdem die Flecken getrocknet sind, brüten Sie die Platten über Nacht bei 27 bis 30 Grad Celsius aus, um klare einzelne Kolonien zu erhalten. Nach der Brutzeit werden die Platten entfernt und gut isolierte Kolonien aus den entsprechenden Fleckenverdünnungen gezählt, die mehr als sieben Kolonien pro Fleck über die Trilikate umfassen.

Schließlich berechnen Sie das Inokulum und die gewonnenen koloniebildenden Einheiten pro Milliliter und prozentualer Invasion mit den Gleichungen. Die Behandlung mit entweder Gentamicin oder Amikacin nach einer Infektion von Caco-2-Zellmonolayern mit dem invasiven AIEC-Stamm NRG857c oder dem nicht-invasiven Escherichia coli DH5-Alpha-Kontrollstamm führte zu ähnlichen Invasionsprofilen. Diese Ergebnisse zeigten, dass Amikacin ebenso wirksam wie Gentamicin bei der Beseitigung extrazellulärer Bakterien war und die intrazelluläre Bakterienbelastung genau widerspiegelte.

Die Behandlung von gentamicinresistenten klinischen Escherichia-coli-Isolaten, die von Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen mit Gentamicin gewonnen wurden, führte zu sehr variablen bakteriellen Erholungswerten von etwa 21.788 %. Im Gegensatz dazu reduzierte die Amikacin-Behandlung die bakterielle Erholung in allen Isolaten dramatisch, was ihre Wirksamkeit demonstrierte und zuverlässigere Invasionsmessungen ermöglichte. Dieses Protokoll ermöglicht eine genaue Quantifizierung intrazellulärer Bakterien und die Bewertung der bakteriellen Invasion in Epithelzellen. Weitere Methoden wie die Immunfluoreszenzmikroskopie können verwendet werden, um die bakterielle Invasion weiter zu validieren und die intrazelluläre Lokalisierung zu validieren.

Zukünftige Studien können neuartige Virulenzfaktoren identifizieren und Wirtswege untersuchen, die während einer adhärenten invasiven E.coli-Infektion gezielt sind.