Integriertes Protokoll zur Beurteilung der meningealen Lymphatik: Cisterna-Magna-Injektion, Lymphknotenbildgebung, meningeale Dissektion und Ganz-Mount-Färbung

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Methode der Funktions- und Morphologiebewertung der Lymphgefäßfunktion und der Morphologie der Maus. Dieses Protokoll unterstützt neurologische Krankheitsmodelle, Arzneimittelabgabe, molekulare Korrelation und translationale Studien. Um zu beginnen, sammeln Sie die chirurgischen Instrumente und benötigten Puffer.

Benutze eine stumpfe Pinzette, um die 30-Gauge-Nadel abzubrechen und die Spitze zu halten. Mit einem 30 Zentimeter langen Polyethylen-10- oder PE10-Rohr verbinden Sie die abgebrochene 30-Gauge-Nadel mit der Mikroinjektionsnadel mit einer 30-Gauge-Nadel. Montage der montierten Nadel und des Schlauchs an der Mikroinjektionspumpe.

Wiegen Sie die Maus. Nach der Betäubung der Maus durch eine intraperitoneale Injektion wird bestätigt, dass der Zehenknüpfreflex aufhört und die Atmung langsam und gleichmäßig wird. Tragen Sie Dipilatorische Creme auf den Gebärmutterhalsbereich auf, um Haare über den Lymphknoten zu entfernen.

Rasieren Sie die Rückenhalshaut. Stelle die Maus in einen stereotaxischen Rahmen auf ein Heizkissen. Neige den Kopf in einem 120-Grad-Winkel zum Stamm.

Reinigen Sie die Stelle nacheinander mit Povidon-Jod und 75 % Ethanol. Machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Haut des Halses. Mit zwei Paaren stumpfer Zange trennen Sie die Muskelschichten.

Mit einer feinen Zange schneiden Sie durch den Muskel, bis der durchscheinende Duramater über der Cisterna magna oder CM sichtbar wird. Ziehe die Muskeln zurück, um eine konstante Exposition aufrechtzuerhalten. Unter einem Stereomikroskop verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um die Nadel zu halten.

Führen Sie die Nadel in einem 45-Grad-Winkel zur Ebene des Duramaters in eine Tiefe von etwa ein bis zwei Millimetern ein. Positioniere die Nadelschräge parallel zum Duramat so, dass sie vollständig darunter liegt. Verwenden Sie absorbierendes Papier, um undichte Gehirnspinalflüssigkeit oder Liquorfaser zu trocknen.

Stellen Sie die Mikroinjektionspumpe so ein, dass sie mit einem Mikroliter pro Minute abliefert. Injizieren Sie fünf Mikroliter Ovalbumin, AlexaFluor 647 Konjugatlösung, in die CM und lassen Sie die Nadel zwei Minuten lang an Ort und Stelle, um Rückfluss zu verhindern. Trage einen Tropfen biologischen Kleber auf die Meningen auf und schließe den chirurgischen Schnitt.

Führen Sie eine In-vivo-Bildgebung der Maus durch, um die Farbstoffintensität in den zervikalen Lymphknoten (CLN) nach 30 und 60 Minuten zu überwachen. Im IVIS-Erfassungskontrollpanel wählen Sie Bildbearbeitungsassistent und klicken Sie im Pop-up-Fenster auf Nächste. Wählen Sie spektrales Entmischen/Filter-Scannen und klicken Sie auf Nächsten.

Rechtsklick auf den Namen der Sonde, wähle Farbstoffe, wähle AlexaFluor 647 und klicke auf Weiter. Wähle manuelle Einstellungen aus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 0,5 Sekunden ein.

Und verwenden Sie den Modus mit einem Anregungsfilter in 640 Nanometern und einem Emissionsfilter bei 680 Nanometern. Nach dem Enthaupten der eingeschläferten Maus machen Sie einen Schnitt entlang der Schädelmitte, um die Kopfhaut zu öffnen. Mit zwei gebogenen Hämostaten trennen Sie die Kopfhaut beidseitig durch sanfte Rückziehung.

Führen Sie die gebogenen Hämostaten in die Höhle orbitaler Höhle ein und entfernen Sie die verbleibende Kopfhaut von Nasen- und Mundregionen. Entfernen Sie den Unterkiefer, während der Schädel intakt bleibt. Entfernen Sie den Knochen an der Schädelbasis, um den ventralen Teil des Gehirns freizulegen.

Mit einer stumpfen Zange werden das Gehirn vorsichtig herausgezogen und dabei der Kontakt mit dem Duramater der Parietalknochen vermieden. Tauchen Sie den dorsalen Schädel vollständig in fünf Milliliter 4%-Paraformaldehyd. Legen Sie die Probe 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius auf.

Sobald der fixierte Schädel die Raumtemperatur erreicht hat, waschen Sie ihn mit fünf Millilitern 1XPBS und wiederholen Sie die Waschphase jeweils dreimal für 10 Minuten. Setze den Schädel mit der Rückseite nach unten in eine 10 Zentimeter große Schale mit 1 XPBS. Mit einer feinen Zange greifen oder drücken Sie die Trommelfellbulle und entfernen Sie sie aus dem Schädel.

Mit einer Schere schneiden Sie etwa zwei Millimeter entlang der Bauchseite des Schädels, um ihn zu glätten. Mit der Pinzette wird das restliche weiße Gewebe vom Zusammenfluss der Nebenhöhlen oder dem COS-Bereich der Meningen freigemacht. Mit einer feinen Mikrozangelei heben Sie vorsichtig eine Kante der Meningen vom Rand des Schädels an.

Hebe die gegenüberliegende Kante an. Greifen Sie den schalenförmigen Rand der Meningen und ziehen, um sie vom Schädel im COS-Bereich zu trennen. Entfernen Sie das Oberkieferknochen mit einer Schere.

Greifen Sie erneut den Rand der Meningen und ziehen Sie daran, dass sie am Frontalbein vom Schädel getrennt wird. Setzen Sie die intakten Meninge in eine 24-Well-Platte mit einem Milliliter 1XPBS. Nach dem Blockieren und Färben der Meningen mit primären und sekundären Antikörpern wird eine Bildgebung durchgeführt.

In vivo-Bildgebung zeigte nach der Injektion deutlich ovale fluoreszierende Signale, die beidseitig im Gebärmutterhalsbereich verteilt sind. Der Tracer war nach der Injektion in den CLNs deutlich sichtbar, wobei die Fluoreszenzintensität etwa bei 60 Minuten seinen Höchststand erreichte. Fluoreszierende Signale wurden in den isolierten oberflächlichen und tiefen zervikalen Lymphknoten beobachtet.

Fehlgeschlagene Injektionen führten zu keinem nachweisbaren fluoreszierenden Signal im Halsbereich. Die immunfluoreszierende Färbung für den lymphatischen Gefäßendothelialen Hyaluroninrezeptor Eins, oder LYVE1, zeigte die Morphologie der lymphatischen Gefäße eindeutig. Ein diskontinuierliches LYVE1-Signal aufgrund von meningealem Rissen wurde beobachtet, was die zuverlässige Quantifizierung beeinträchtigte.

Das Fehlen des transversalen Sinusbereichs war in beeinträchtigten Proben sichtbar. Mit diesem Ansatz können Forscher die vorübergehende Funktion und die dorsale ML-basierte nasale Arbeitsmorphologie bei Mäusen untersuchen. Die größte Herausforderung ist die Durchführung aktueller Intrasense-Tendinalinjektionen und der sorgfältigen Meningen-Dissektion unter Erhalt der Gefäßintegrität.

Nach diesem Verfahren können Forscher RNA und die Proteinextraktion durchführen. Intrakranielle Arzneimittelabgabe oder -analyse in Krankheitsmodellen.