Dreidimensionale Immunlokalisation bei Maismeiocyten

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung eines 3D-Ansatzes zur Untersuchung von männlichen Mais-Meiocyten und zur Visualisierung meiotischer Proteine in einzelnen Zellen. Neben Mais kann dieses Protokoll auch zur Untersuchung von Meiocyten in Reis, Roggen, Gerste und Weizen angewendet werden. Beginnen Sie damit, Maispflanzen im V13-Stadium zu beschaffen, bei denen sich die Infloreszenzen noch im Inneren des Stängels befinden.

Während der Woche der miotischen Antherenfixierung vorsichtig den vergrößerten Stängel an der Verdickung unter Handschuhbenutzung andrücken, um zu prüfen, ob er weich genug ist, um aufgeschnitten zu werden. Nach der Zubereitung der benötigten Puffer eine feuchte Kammer vorbereiten, indem fünf bis zehn angefeuchtete Papiertücher in eine Plastikbox gelegt werden. Überschüssiges Wasser aus der Kammer entfernen.

Öffnen Sie mit einer Rasierklinge den Stängel auf der Höhe der Blütenstands und legen Sie so die Rispenäste und Seitenzweige frei. Nach der Dissektion und Sammlung der Seitenzweige wickeln Sie diese in feuchte Tücher der Feuchtkammer ein und halten die Kammer bei Raumtemperatur. Sammeln Sie mithilfe eines Stereomikroskops frische Staubblätter aus den Blüten in eine 35 Millimeter große Petrischale, die zwei Milliliter eines 1× Puffer A oder BA enthält. Identifizieren Sie die meiotischen Stadien anhand von Größe und Farbe.

Nachdem die Antheren in eine neue 35-Millimeter-Petrischale überführt wurden, fügen Sie drei Milliliter Fixierungslösung zu den Antheren hinzu. Versiegeln Sie die Petrischale mit Parafilm, um die Verdunstung von Formaldehyd zu verhindern. Stellen Sie die 35-Millimeter-Petrischale auf die größere Petrischale, die auf einem Rüttelapparat positioniert ist, und stellen Sie diesen auf 40 bis 60 U/min bei Raumtemperatur für 45 Minuten ein.

Spülen Sie die Staubblätter mit drei Millilitern eines 1×BA. Nachdem Sie die Staubblätter in eine kleine Petrischale überführt haben, verschließen Sie die Petrischale und stellen sie 45 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Rüttelapparat mit einer Drehzahl von 40 bis 60 U/min. Überführen Sie die Staubblätter mithilfe sauberer Pinzette in eine kleine 35-Millimeter-Petrischale, die drei Milliliter eines 1×BA enthält.

Nachdem die Petrischale fest mit Parafilm verschlossen wurde, die kleine Petrischale in eine größere Petrischale stellen. Nach dem Abdecken mit Aluminiumfolie die Probe bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius lagern. Am ersten Tag zwei Milliliter Acrylamidlösung herstellen, indem gleiche Volumina von Acrylamid und zwei XBA gemischt werden.

Entgasen Sie die Acrylamidlösung unter Vakuum für fünf bis 10 Minuten, bevor Sie Natriumsulfit und Ammoniumpersulfat hinzufügen. Aliquotieren Sie 100 Mikroliter einer 1:1-Mischung aus Acrylamid und 2 XBA entsprechend der Anzahl der vorbereiteten Objektträger in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie zwei mal zwei Zentimeter große Parafilmstücke über eine Petrischale und positionieren Sie sie unter einem Auflicht-Stereomikroskop.

Nachdem die Pipettenspitze mit einer Schere abgeschnitten wurde, pipettieren Sie 50 Mikroliter BA-Lösung mit Antheren auf die Parafilmfolie. Pipettieren Sie 25 Mikroliter BA-Lösung auf einen anderen Bereich der Parafilmfolie. Halten Sie die Antheren mit einer Pinzette und schneiden Sie mit einem Skalpell deren Spitzen ab.

Wenn die Meiocyten ausgestrichen sind, überführen Sie sie mit einer Pipette in den 25-Mikroliter-Tropfen BA und mischen vorsichtig. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der Meiocyten-Mischung auf ein separates Deckglas. Geben Sie rasch fünf Mikroliter Natriumsulfit und fünf Mikroliter Ammoniumpersulfat in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das Acrylamid und zwei XBA enthält.

Pipettieren Sie fünf Mikroliter dieser Mischung auf die Deckglas und vermischen Sie sie mit den Meiocyten. Legen Sie ein mit Polylysin beschichtetes Deckglas in einem Winkel von 45 Grad darauf. Nach einer Polymerisationszeit von 30 bis 50 Minuten bei Raumtemperatur trennen Sie die Deckgläser vorsichtig mit einer Rasierklinge.

Danach legen Sie sie mit der gepolsterten Seite nach oben in eine Petrischale. Spülen Sie den Deckgläser mit einem Milliliter 1×PBS, der mit einem Millimolar Ethylendiamintetraessigsäure, oder EDTA, und 1 % Triton bei Raumtemperatur ergänzt wurde, zwei Stunden lang ab. Bereiten Sie primäre Antikörper aus verschiedenen Wirtsarten vor und kombinieren Sie sie, um unterschiedliche Signale während der Detektion sicherzustellen.

Geben Sie 50 Mikroliter des verdünnten primären Antikörpers in die Mitte der Deckglasabdeckung, die das Polster enthält. Anschließend stellen Sie die Petrischale über Nacht in eine feuchte Kammer. Am zweiten Tag bereiten Sie 500 Milliliter Waschpuffer mit 1× PBS, 0,1 % Tween 20 und 1 Millimolar EDTA vor.

Entfernen Sie mithilfe einer Pipette die Übernachtlösung. Waschen Sie den Deckglaser zwei Mal mit je einem Milliliter Waschpuffer. Nach dem Entfernen des Puffers geben Sie erneut einen Milliliter Waschpuffer hinzu und inkubieren eine Stunde bei Raumtemperatur.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch sieben Mal. Decken Sie die Petrischale nach dem letzten Waschgang ab und lassen Sie sie über Nacht in einer feuchten Kammer. Bereiten Sie die sekundären Antikörper vor, indem Sie diese im Verhältnis 1 zu 50 in Blockierpuffer verdünnen.

Nach dem Entfernen der Waschlösung 50 Mikroliter der verdünnten sekundären Antikörperlösung in die Mitte jedes Pads geben. Anschließend die Petrischale zwei Stunden bei Raumtemperatur in eine feuchte Kammer stellen. Nach dem Entfernen der Lösung aus der Mulde viermal je eine Stunde mit je einem Milliliter Waschpuffer bei Raumtemperatur waschen.

Waschen Sie die Vertiefung mit einem Milliliter PBS zehn Minuten lang und wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal. Geben Sie 500 Mikroliter DAPI, hergestellt in einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter, in die Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem Sie das ProLong Gold aus der Lagerung bei vier Grad Celsius entnommen haben, lassen Sie es auf Raumtemperatur auftauen.

Spülen Sie die Objektträger zweimal mit einem Milliliter PBS für jeweils 30 Minuten. Nach dem Entfernen der letzten Waschlösung geben Sie zwei Tropfen verlängertes Antifade-Mittel in die Mitte des Pads. Sobald die Deckglasabdeckung aus der Vertiefung angehoben wurde, bringen Sie sie auf die beschrifteten Objektträger auf.

Entfernen Sie mithilfe eines Vakuums überschüssiges Glycerin von den Rändern des Deckgläschens und versiegeln Sie es mit zwei Schichten Nagellack. Untersuchen Sie die Präparate unter dem Mikroskop mit geeigneten Anregungs-Wellenlängen und Filtern, um Bilder aufzunehmen. Die DAPI-Färbung zeigte einen deutlichen Zellkern und Chromatinfärbung sowie eine schwächere native cytoplasmatische Färbung der Plastiden- und mitochondriellen DNA.

Fehlen von Absence of first division one (AFD1), asynaptic one (ASY1) und Zipper1 (ZYP1) auf den Chromosomen und im Cytoplasma während der Präleptotänphase. In späteren Stadien konzentrierte sich das Signal auf die Chromosomen, während beträchtliche Mengen von ZYP1 vor der vollständigen Synapsis im Cytoplasma verblieben. Der meiotische Kohäsinkomplex AFD1 bildete eine lineare Struktur erst nach der Zygotänphase.

Gleichzeitig mit der Bildung linearer Filamente des synaptonemalen Komplexes. Das ASY1-Signal wurde vergleichsweise schwach, nachdem ZYP1 und AFD1 in lineare Strukturen eingebaut worden waren. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschenden, die Ko-Lokalisation und Dynamik von Proteinen, die native subzelluläre Lokalisation, die 3D-chromosomale Architektur sowie den Verlauf und die Stadieneinteilung der Meiose zu untersuchen.

Die Hauptannahme bei diesem Protokoll besteht darin, kompatible Kombinationen von primären und sekundären Antikörpern sorgfältig auszuwählen. Studien können auf dieser Arbeit aufbauen, indem sie männliche und weibliche Meiose vergleichen, um den molekularen Mechanismus zu untersuchen, der der Athelchasmi zugrunde liegt.