Quantitative lebende Zellbildgebung der Kernform und der Chromatindynamik während der Entwicklung und Umweltstress in der Wurzel Arabidopsis thaliana
5. Juni 2026
Dieser Prozess verwendet die Konfokalmikroskopie in Verbindung mit einer fluoreszenzmarkierten Kern- und Chromatinmarkerlinie bei Arabidopsis thaliana, um gleichzeitig die Kern- und Chromatindynamik in Arabidopsis-Wurzeln aufzuzeichnen und Veränderungen in dieser Dynamik als Reaktion auf Entwicklungs- und Umweltsignale zu untersuchen.
Unsere Forschung untersucht Gene und Mechanismen, die eine langfristige Wurzelerholung durch osmotischen Stress ermöglichen, um Feldfrüchte gegen Dürre zu schützen. Obwohl es für Arabidopsis-Wurzeln entwickelt wurde, kann dieses Protokoll an Systeme mit fluoreszierenden Proteinmarkerlinien angepasst werden. Erhalten Sie die Wachstumsplatten mit Arabidopsis thaliana-Setzlingen, die für die Bildgebung vorbereitet sind.
Pipettieren Sie 60 Mikroliter reines Wasser auf einen Glasrutscher. Legen Sie drei sechs Tage alte A. thaliana-Setzlinge ins Wasser. Legen Sie einen 22x22 Millimeter großen Deckel mit der Nummer 1,5 über die Wurzeln, ohne die Blätter zu bedecken.
In konfokalen Mikroskopeinstellungen stellen Sie die Laserbelichtungszeit auf 1.000 Millisekunden ein. In den Laser-Kombinator-Einstellungen stellen Sie den 488-Nanometer-Laser für die grüne fluoreszierende Protein- oder GFP-Bildgebung auf 50 %. Stellen Sie den 561-Nanometer-Laser auf 50 % für die Bildgebung von rotem fluoreszierendem Protein, oder RFP. ein.
Fotografieren Sie das Sample mit einem 20-fachen Objektivobjektiv ohne optischen Zoom. Stellen Sie die Z-Schnitt-Schrittlänge auf 0,3 Mikrometer ein. Setzen Sie das Bildgebungsintervall auf eine Minute und die gesamte Bildgebungsdauer auf 10 Minuten.
Finde die Wurzeln und wähle bis zu 20 Z-Scheiben aus. 16-Bit-Bilder aufnehmen. Starte die Zeitrafferaufnahme und speichere die Zeitrafferdatei als TIFF-Datei mit verlustfreier Kompression.
Übertragen Sie die gesammelten Daten zur Analyse an einen Computer. Öffne die ImageJ- oder Fiji-Software. Klicken Sie auf und ziehen Sie die VSI-Datei in das Hauptfenster von ImageJ oder Fiji-Anwendung.
Im Prompt Bio Formats Importoptionen klicken Sie unten rechts auf OK. Dann stelle im Bio-Format-Serienoptionen-Prompt sicher, dass Serie 1 ausgewählt ist. Klicken Sie unten links auf OK.
Sobald das Bild geladen ist, teilen Sie die Signale auf, indem Sie Bild auswählen. Wähle Farbe und wähle Split Channels. Sehen Sie sich die separaten Fenster an, die für GFP-markierte Kerne und RFP-markierte Chromatin generiert werden.
Bestimmen Sie, welches der beiden Bildfenster dem Chromatin entspricht. Nachdem Sie auf das Chromatin-Bildfenster geklickt haben, wenden Sie die Z-Projekt-Operation an, indem Sie Bild auswählen, Stacks auswählen und dann im Hauptfenster ImageJ auf Z Project klicken. Ändere den Projektionstyp auf maximale Intensität.
Stellen Sie sicher, dass All Time Frames aktiv ist, und klicken Sie auf OK, um die Projektion zu erzeugen. Öffnen Sie das Kontrastmenü, indem Sie Control Shift C drücken, oder indem Sie Bild auswählen und Anpassen auswählen und dann im Hauptfenster ImageJ Helligkeit oder Kontrast klicken. Schiebe den Mindestbalken nach links, bis das Chromatin deutlich sichtbar ist.
Navigiere zu den Plugins. Klicken Sie auf den Pfeil nach unten im Menü Plugins, um zur Option Tracking zu scrollen. Wählen Sie Tracking und klicken Sie auf TrackMate.
Bestätigen Sie, dass die Kalibrierungseinstellungen korrekt sind, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie Schwellenverstimmungsdetektor und klicken Sie auf Weiter. Gehe zum letzten Bild des Zeitraffers im Bildfenster.
Klicke auf Auto neben der Intensitätsschwelle und auf Vorschau. Stellen Sie die Intensitätsschwelle ein und klicken Sie auf Vorschau. Wiederholen Sie den Anpassungs- und Vorschauvorgang, bis das gesamte Chromatin mit minimalem Rauschen enthalten ist, und klicken Sie auf Weiter.
Erlauben Sie die anfängliche Schwellenwerterkennung abzuschließen und klicken Sie auf Nächste. Stellen Sie die Schwelle manuell ein, bis nur noch Chromatin sichtbar ist, und klicken Sie auf Nächsten. Passen Sie die Fluoreszenzbildanzeige an und klicken Sie auf Weiter.
Wählen Sie Simple LAP Tracker aus und klicken Sie auf Weiter. Setzen Sie die maximale Verbindungsdistanz auf 5 Mikrometer, Gap Closet Maximum Distance auf 15 Mikrometer, Gap Closing Maximum Frame Gap auf 1 und klicken Sie auf Nächstes. Erlauben Sie das Tracking vollständig.
Beobachten Sie die im ursprünglichen Bildfenster angezeigten Spuren und klicken Sie auf Nächsten. Drücke die grüne Plus-Taste unten links, um einen Filter zu erstellen. Wählen Sie die Anzahl der Plätze im Streckenmodus aus.
Stellen Sie den Schwellenregler ein. Stelle sicher, dass der Filtermodus auf Above steht, und klicke dann auf Next. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Spuren" am unteren Rand der Seite Anzeigeoptionen.
Wählen Sie Export in CSV aus. Ignoriere die eingebaute Plot-Seite und klicke auf Nächsten. Überprüfen Sie die TrackMate-Analyseergebnisse.
Klicken Sie auf Capture Overlay und wählen Sie dann Ausführen. Speichern Sie das Video, indem Sie Datei auswählen und auf Speichern klicken und dann GIF auswählen. Salzbehandelte Wurzelzellen wirkten gestresst, und centromerische Brennpunkte wirkten größer als unter Kontrollbedingungen.
Die Chromatingeschwindigkeit war unter Kontrollbedingungen signifikant höher als bei 100-millimolaren Natriumchlorid-behandelten Bedingungen. Dieses Protokoll ermöglicht die Verfolgung und Quantifizierung der fluoreszenzmarkierten Proteinbewegung über die Zeit in Arabidopsis-Wurzeln. Die größte Herausforderung bei diesem Protokoll ist die Erfassung hochwertiger Bilder, da Fotobleichen und Probendrift das Tracking erschweren können.
Zukünftige Studien sollten die Mechanismen untersuchen, die in unserer Studie beobachteten reduzierten Chromatinbewegungen zugrunde liegen.
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Overview
The nucleus in eukaryotic cells exhibits dynamic shape changes, which are altered under stress conditions such as cancer in animals or abiotic stress in plants. This study developed a live-cell imaging pipeline in Arabidopsis thaliana roots using dual fluorescent markers for the nuclear envelope and chromatin to quantify nuclear and chromatin dynamics under control and salt-stressed conditions. Confocal microscopy combined with Fiji/ImageJ and TrackMate enabled quantitative analysis, revealing reduced chromatin movement under salt stress. The method provides a robust approach to study how abiotic stressors affect nuclear architecture and chromatin dynamics in plant cells.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Nuclear dynamics
- Chromatin mobility
- Abiotic stress response
Background
- Nuclear shape is dynamic in live cells, not static as traditionally depicted.
- Altered nuclear morphology is associated with cancer in animal cells and environmental stress in plants.
- The nuclear envelope interacts with chromatin to influence gene expression.
- Limited knowledge exists on how abiotic stress affects nuclear shape, movement, and chromatin dynamics in plants.
Purpose of Study
- To develop a pipeline for quantifying nuclear and chromatin dynamics in live plant cells.
- To apply this method to assess changes under abiotic stress, specifically salt stress.
- To validate the approach by measuring chromatin movement in control and stressed conditions.
- To enable future analysis of nuclear and chromatin responses to environmental stressors in Arabidopsis roots.
Methods Used
- Live-cell imaging of Arabidopsis thaliana roots using confocal microscopy.
- Use of a dual fluorescently tagged marker line (nuclear envelope protein and chromatin).
- Image acquisition under control and salt-stressed conditions.
- Analysis of nuclear and chromatin dynamics using Fiji/ImageJ with the TrackMate plugin.
- Particle tracking to quantify chromatin speed and movement.
Main Results
- Chromatin movement was significantly reduced in salt-stressed roots compared to control.
- The dual-tagging system allowed simultaneous visualization of nuclear envelope and chromatin.
- TrackMate enabled accurate particle tracking and quantification of dynamics.
- The method successfully captured live, quantitative changes in nuclear and chromatin behavior.
Conclusions
- The developed pipeline allows for quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in plant roots.
- Salt stress leads to decreased chromatin mobility, indicating altered nuclear dynamics under abiotic stress.
- This approach can be applied to study nuclear responses to various environmental stressors.
- The method provides a foundation for linking nuclear architecture to gene regulation and stress adaptation in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in Arabidopsis roots provides a robust platform for dissecting cellular responses to environmental stress at high resolution. This approach enables predictive confidence in linking nuclear architecture changes to gene regulation, supporting early discovery and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. The method's quantitative outputs facilitate risk-adjusted decisions for trait development and stress adaptation research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of nuclear and chromatin behavior under defined stress conditions.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying dynamic nuclear responses to abiotic stimuli.
- Facilitates functional validation of nuclear envelope and chromatin-associated targets.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, quantitative imaging assays for nuclear and chromatin dynamics.
- Enables reproducible measurement of stress-induced changes in live plant cells.
- Supports scalable screening of genetic or chemical modulators affecting nuclear architecture.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nuclear and chromatin dynamics with stress adaptation phenotypes in model systems.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of stress resilience traits.
- Supports predictive de-risking for translational research in crop improvement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis pipeline integrates from early discovery through screening and translational research in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Quantifies nuclear and chromatin dynamics to clarify stress response pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides particle tracking and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Links nuclear architecture changes to stress adaptation, supporting trait validation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable to diverse plant models and stressors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nuclear and chromatin target validation.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and quantitative analysis for reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for stress adaptation trait development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic or chemical interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and live-cell imaging.
- Needs access to dual fluorescent marker lines and image analysis software (Fiji/ImageJ, TrackMate).
- Demands cross-team standardization for imaging protocols and data analysis.
- Adaptable to other plant species with suitable marker development.
- Limited by availability of compatible fluorescent markers for target systems.
