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<ol><li>Chen, S., Zhu, H., Jounaidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+snapshots+of+natural+killer+cells+functions%2C+signaling%2C+molecular+mechanisms+and+clinical+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Comprehensive snapshots of natural killer cells functions, signaling, molecular mechanisms and clinical utilization.</a> Signal Transduct Target Ther. , (2024).</li>
<li>Liesche, C., Sauer, P., Prager, I., Urlaub, D., Claus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-fluorescent+protein+reporters+allow+parallel+quantification+of+natural+killer+cell-mediated+granzyme+and+caspase+activities+in+single+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-fluorescent protein reporters allow parallel quantification of natural killer cell-mediated granzyme and caspase activities in single target cells.</a> Front Immunol. , (2018).</li>
<li>Hartmann, J. A., Cardoso, M. R., Talarico, M. C. R., Kenney, D. J., Leone, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evasion+of+NKG2D-mediated+cytotoxic+immunity+by+sarbecoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evasion of NKG2D-mediated cytotoxic immunity by sarbecoviruses.</a> Cell. , (2024).</li>
<li>Garcia-Beltran, W. F., Hölzemer, A., Martrus, G., Chung, A. W., Pacheco, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+conformers+of+HLA-F+are+high-affinity+ligands+of+the+activating+NK-cell+receptor+KIR3DS1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Open conformers of HLA-F are high-affinity ligands of the activating NK-cell receptor KIR3DS1.</a> Nat Immunol. , (2016).</li>
<li>Rezvani, K., Rouce, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+natural+killer+cell+immunotherapy+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The application of natural killer cell immunotherapy for the treatment of cancer.</a> Front Immunol. , (2015).</li>
<li>Coënon, L., Villalba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+CD16a+biology+to+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">From CD16a biology to antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity improvement.</a> Front Immunol. , (2022).</li>
<li>Ruggeri, L., Mancusi, A., Capanni, M., Martelli, M. F., Velardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+alloreactive+NK+cells+in+adoptive+immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploitation of alloreactive NK cells in adoptive immunotherapy of cancer.</a> Curr Opin Immunol. , (2005).</li>
<li>Liu, E., Marin, D., Banerjee, P., Macapinlac, H. A., Thompson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+CAR-transduced+natural+killer+cells+in+CD19-positive+lymphoid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors.</a> N Engl J Med. , (2020).</li>
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<li>Marin, D., Li, Y., Basar, R., Rafei, H., Daher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety%2C+efficacy+and+determinants+of+response+of+allogeneic+CD19-specific+CAR-NK+cells+in+CD19%2B+B+cell+tumors%3A+a+phase+1%2F2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial.</a> Nat Med. , (2024).</li>
<li>Chava, S., Bugide, S., Gupta, R., Wajapeyee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+and+migration+in+the+context+of+hepatic+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells.</a> J Vis Exp. (156), e60714(2020).</li>
<li>Liu, E., Tong, Y., Dotti, G., Shaim, H., Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+NK+cells+engineered+to+express+IL-15+and+a+CD19-targeted+CAR+show+long-term+persistence+and+potent+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Cord blood NK cells engineered to express IL-15 and a CD19-targeted CAR show long-term persistence and potent antitumor activity.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Mensali, N., Dillard, P., Hebeisen, M., Lorenz, S., Theodossiou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+specifically+TCR-dressed+to+kill+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">NK cells specifically TCR-dressed to kill cancer cells.</a> EBioMedicine. , (2019).</li>
<li>Nowak, J., Bentele, M., Kutle, I., Zimmermann, K., Lühmann, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-NK+cells+targeting+HER1+%28EGFR%29+show+efficient+anti-tumor+activity+against+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">CAR-NK cells targeting HER1 (EGFR) show efficient anti-tumor activity against head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC).</a> Cancers (Basel). , (2023).</li>
<li>Granger, J. E., Appledorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+measurement+of+apoptosis+and+immune+cell+killing+using+live-cell+imaging+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic measurement of apoptosis and immune cell killing using live-cell imaging and analysis.</a> Methods Mol Biol. , (2021).</li>
<li>Duffy, J., Rider, A., Loneman, D., Thakkar, D., Mullen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALK%2B+LBCL+and+PBL+share+a+similar+plasmablastic+transcriptional+identity+but+show+divergent+signaling+dependencies+and+therapeutic+vulnerabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ALK+ LBCL and PBL share a similar plasmablastic transcriptional identity but show divergent signaling dependencies and therapeutic vulnerabilities.</a> Blood. , (2025).</li>
<li>Kandarian, F., Sunga, G. M., Arango-Saenz, D., Rossetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+for+the+assessment+of+human+NK+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human NK cell activity.</a> J Vis Exp. (126), e56191(2017).</li>
<li>Klingemann, H., Boissel, L., Toneguzzo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+for+immunotherapy+-+advantages+of+the+NK-92+cell+line+over+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells for immunotherapy - advantages of the NK-92 cell line over blood NK cells.</a> Front Immunol. , (2016).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. , (2004).</li>
<li>Valiante, N. M., Uhrberg, M., Shilling, H. G., Lienert-Weidenbach, K., Arnett, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+and+structurally+distinct+NK+cell+receptor+repertoires+in+the+peripheral+blood+of+two+human+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functionally and structurally distinct NK cell receptor repertoires in the peripheral blood of two human donors.</a> Immunity. , (1997).</li>
<li>Wang, Y., Zhang, Y., Hughes, T., Zhang, J., Caligiuri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fratricide+of+NK+cells+in+daratumumab+therapy+for+multiple+myeloma+overcome+by+ex+vivo-expanded+autologous+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fratricide of NK cells in daratumumab therapy for multiple myeloma overcome by ex vivo-expanded autologous NK cells.</a> Clin Cancer Res. , (2018).</li>
<li>Cichocki, F., Bjordahl, R., Gaidarova, S., Mahmood, S., Abujarour, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+NK+cells+maintain+high+cytotoxicity+and+enhance+in+vivo+tumor+control+in+concert+with+T+cells+and+anti-PD-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived NK cells maintain high cytotoxicity and enhance in vivo tumor control in concert with T cells and anti-PD-1 therapy.</a> Sci Transl Med. , (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Advanced RPMI-1640 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633020</td><td>Basalmedium für NK-92 und primäre menschliche NK-Zell-Kulturmedien (siehe Protokoll für vollständige Formulierung)</td></tr><tr><td>Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)</td><td>BioLegend</td><td>328618</td><td>Degranulationsmarker für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)</td><td>BioLegend</td><td>302046</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)</td><td>BioLegend</td><td>318328</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge mit Schwenkgehäuse-Rotor kompatibel mit 15-ml-Röhrchen und 96-Well-Platten (Eppendorf Centrifuge 5810R)</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td>Zum Zellpelletieren und Plattenzentrifugieren (100&ndash;300 × g)</td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Zellproliferationsfarbstoff zur Markierung von Zielzellen</td></tr><tr><td>Cytek Aurora spektrale Durchflusszytometer (oder gleichwertig)</td><td>Cytek Biosciences</td><td>N7-00003</td><td>Zur Durchflusszytometrie-Erfassung und -Analyse verwendet</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindol)</td><td>BioLegend</td><td>422801</td><td>Kernfärbung für Live/Dead-Unterscheidung</td></tr><tr><td>96-Well-Tiefplatten</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2110</td><td>Zur Antikörperzubereitung verwendet</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Kryokonservierungsreagenz</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Avantor</td><td>76419-584</td><td>Basalmedium-Supplementierung; verwendet in FACS-Puffer (2% FBS)</td></tr><tr><td>Allzweck-Wasserbad, 10 L (37 °C)</td><td>PolyScience</td><td>WBE10</td><td>Zum Auftauen von Zellen</td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-Alanyl-L-Glutamin-Ergänzung)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Stabile Glutaminquelle</td></tr><tr><td>Humanes AB-Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td>Ergänzung für primäre menschliche NK-Zell-Kulturmedien</td></tr><tr><td>IncuCyte SX5 Live-Zell-Imaging-System</td><td>Sartorius</td><td>4816</td><td>Live-Zell-Imaging in Echtzeit und Zell-für-Zell-Analyse</td></tr><tr><td>LUNA-FL Dual-Fluoreszenz-Zellzähler (oder gleichwertig)</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Automatisierte Zellzählung</td></tr><tr><td>Parafilm M (4 Zoll × 250 ft Rolle)</td><td>Genesee</td><td>16-101</td><td>Plattenversiegelung und -lagerung</td></tr><tr><td>Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), steril (pH 7,2&ndash;7,4)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td>Verwendet für Waschungen und FACS-Puffer-Zubereitung</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin (0,1 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3890401</td><td>Plattenbeschichtungsreagenz</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes Interleukin-2 (IL-2)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>202-IL-500</td><td>Zytokin</td></tr><tr><td>RosetteSep Human NK-Zell-Anreicherungskit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15065</td><td>Humanes NK-Zell-Anreicherungscocktail</td></tr><tr><td>SYTOX Orange Totzellfärbung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S34861</td><td>Lebensfähigkeitsfarbstoff für Live-Zell-Imaging</td></tr><tr><td>Trypanblau 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Lebensfähigkeitsfarbstoff für die Zellzählung</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym (1X), ohne Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604039</td><td>Zur Ablösung von adhärenten Zellen</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Verwendet zur FACS-Puffer-Zubereitung</td></tr><tr><td>15-ml-Konuszentrifugenröhrchen mit konischem Boden</td><td>Corning</td><td>352097</td><td>Steril</td></tr><tr><td>24-Well-Gewebekulturplatte (gewebekulturbehandelt)</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>Verwendet für NK-Zell-Wiederherstellung</td></tr><tr><td>96-Well-Clear-Rundbodenplatte (gewebekulturbehandelt)</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Verwendet für Co-Kultur- und Durchflusszytometrie-Assays</td></tr><tr><td>96-Well-Flachboden-schwarze Polystyrolplatte mit klaren Rändern (gewebekulturbehandelt)</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Kompatibel mit Live-Zell-Imaging-Systemen</td></tr></tbody></table>

quantifizierung der nk-zell-zytotoxizität, verstärkt durch chimerische antigenrezeptoren und therapeutische antikörper mittels lebender zellbildgebung und durchflusszytometrie

Quantifying NK-Cell Cytotoxicity Potentiated by Chimeric Antigen Receptors and Therapeutic Antibodies Using Live-Cell Imaging and Flow Cytometry

Quantifizierung der NK-Zell-Zytotoxizität, verstärkt durch chimerische Antigenrezeptoren und therapeutische Antikörper mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie

Natural killer (NK) cells are innate lymphocytes that play a critical role in protective immunity against diverse intracellular pathogens and cancers. ...

Unser Labor untersucht die Rolle natürlicher Killerzellen in Gesundheit und Krankheit, mit dem Ziel, ihr Potenzial zur Verbesserung von Therapien bei soliden Tumoren und Blutkrebserkrankungen zu nutzen. Bestehende NK-Zell-Zytotoxizitätsassays weisen across Plattformen und Versuchsaufbauten einen Mangel an Standardisierung auf. Dieses Protokoll stellt reproduzierbare Methoden zur Live-Cell-Imaging- und Durchflusszytometrie bereit, um eine genaue Beurteilung der Zytotoxizität zu ermöglichen.Bereiten Sie zunächst 10 Milliliter 2x SYTOX Orange vor, indem Sie die SYTOX Orange-Stammlösung in NK-92-Kulturmedium in einem 15-Milliliter-Kegelrohr pipettieren. Zählen Sie die Zielzellen mithilfe eines Luna Counters nach Zugabe von Trypanblau oder mit einer anderen validierten Zellzählmethode basierend auf Farbausschluss. Überführen Sie die benötigte Menge an Zielzellen in ein 15-Milliliter-Kegelrohr.Zentrifugieren Sie das Gefäß bei 300 × g fünf Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand. Suspendieren Sie die Zielzellen anschließend erneut in 2X SYTOX Orange-Medium, um eine Endkonzentration von 250.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen. Zur Vorbereitung der Effektorzellen bewerten Sie die Vitalität und Konzentration der NK-92-Zellen und fahren Sie nur fort, wenn die Vitalität über 80 % liegt, da eine geringere Vitalität die Leistung des Assays beeinträchtigen könnte.Zählen und übertragen Sie die erforderliche Anzahl NK-92-Zellen in einzelne kegelförmige Zentrifugenröhrchen mit einem Volumen von 15 Milliliter. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in einem Endvolumen von 500.000 Zellen pro Milliliter. Bereiten Sie Verdünnungen der Effektorzellen vor, indem Sie 240 Mikroliter Effektorzellen in die Vertiefungen einer 96-Loch-Rundbodenplatte für ein Verhältnis von zwei Effektorzellen zu einer Zielzelle geben und 120 Mikroliter Medium zu den verbleibenden Vertiefungen hinzufügen.Führen Sie Verdünnungsreihen mit Verdünnungsfaktor zwei von zwei zu eins bis 0,25 zu eins an Effektor- zu Zielzellen-Verhältnissen durch, wobei gründlich durch mindestens fünfmaliges Pipettieren gemischt wird und zwischen den Übertragungen die Spitzen gewechselt werden. Danach bereiten Sie die Ko-Kultur vor, indem Sie eine mit Polylysin beschichtete 96-Loch-Platte mit flachem Boden bereitstellen. Unmittelbar vor der Übertragung suspendieren Sie die Ziel- und Effektorzellen gründlich, ohne Blasen zu bilden, und geben anschließend jeweils 100 µL der Zellsuspension in die entsprechenden Löcher. Anschießend 200 Mikroliter PBS in die umliegenden unbenutzten Vertiefungen geben. Die Platte zwei Minuten bei Raumtemperatur mit 100 × g zentrifugieren. Die Platte in das Live-Cell-Imaging-System stellen.Nehmen Sie alle eine Stunde über einen Zeitraum von 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid Bilder auf. Überprüfen Sie nach dem ersten Scan die Bildqualität und passen Sie gegebenenfalls die Aufnahmeeinstellungen an. Passen Sie die spektrale Entmischung an, um die Übersprechen von SYTOX Orange in den grünen Kanal zu korrigieren.Überprüfen Sie, dass orange positive tote Zellen nicht fälschlicherweise als grün positive Zellen identifiziert werden. Um die Analyse einzelner nicht-ankernder Zellen einzurichten, stellen Sie den erwarteten Objektdurchmesser auf 15 Mikrometer ein, um dem ungefähren Zelldurchmesser zu entsprechen. Stellen Sie die Schwellwertempfindlichkeit und Texturempfindlichkeit auf fünf und die Kantenempfindlichkeit auf 10 ein, um die Trennung von Zellclustern zu erleichtern.Stellen Sie den Bereichsfilter für akzeptierte Objekte auf 50 bis 2.000 Quadratmikrometer ein, um Schmutzpartikel und große Objekte auszuschließen. Legen Sie die maximale Exzentrizität auf 0,95 fest, um nicht-zelluläre Objekte auszuschließen. Beschaffen Sie primäre humane NK-Zellen, die 16 bis 24 Stunden lang kultiviert wurden.Überführen Sie 500.000 Zielzellen in ein kegelförmiges Zentrifugenröhrchen mit 15 Milliliter Fassungsvermögen. Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 300G.Entfernen Sie dann den Überstand. Bereiten Sie eine 0,5 Mikromolare Arbeitslösung von Carboxyfluorescein-Succinimidylester oder CFSC in PBS zu, indem Sie ein Mikroliter der fünf Millimolaren CFSE-Stammlösung in 10 Milliliter PBS verdünnen. Resuspendieren Sie das erhaltene Pellet in der CFSE-Lösung bei etwa einer Million Zellen pro Milliliter.Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, in Aluminiumfolie gewickelt, um sie vor Licht zu schützen. Danach stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von fünf bis zehn Volumina Kulturmedium und inkubieren fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation der Zellen resuspendieren Sie das Zellpellet bei 250.000 Zellen pro Milliliter, sodass 100 Mikroliter 25.000 Zellen enthalten.Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette je 100 Mikroliter Zielzellen pro Vertiefung in die vorgesehenen Vertiefungen einer runden 96-Loch-Platte. Pflanzen Sie jede Bedingung im Dreifachansatz aus. Bereiten Sie anschließend für jeden Testantikörper und den dazugehörigen Isotyp-Kontrollantikörper jeweils 200 Mikroliter einer 4fach konzentrierten Antikörperlösung in NK-Zellkulturmedium vor.Überführen Sie die Antikörperlösungen in eine Tieflochplatte. Geben Sie 50 Mikroliter Antikörperlösung in jedes Loch, das die Zielzellen enthält, und mischen Sie gründlich durch mindestens fünfmaliges Auf- und Abpipettieren. Geben Sie 50 Mikroliter NK-Zellkulturmedium pro Loch zu den Kontrolllöchern ohne Antikörper hinzu und mischen Sie gründlich durch Pipettieren.Die Platte 25 bis 30 Minuten unter standardmäßigen Inkubationsbedingungen inkubieren. NK-Zellen zählen und 200.000 Zellen gewinnen, und nur fortfahren, wenn die Vitalität größer oder gleich 75 % ist. Die Zellen in 800 Mikrolitern primärem humanen NK-Zellkulturmedium auf eine Dichte von 250.000 Zellen pro Milliliter resuspendieren. Jeweils 50 Mikroliter der NK-Zellsuspension pro Vertiefung in die entsprechenden Vertiefungen geben und mindestens fünfmal auf- und abpipettieren, um gründlich zu mischen.Pipettieren Sie anschließend 50 Mikroliter Kulturmedium pro Vertiefung in die Kontrollvertiefungen und mischen Sie gründlich. Überprüfen Sie sorgfältig die Rundboden-96-Well-Platte, um sicherzustellen, dass alle Vertiefungen 200 Mikroliter mit einheitlichem Meniskus und ohne Blasen enthalten. Zentrifugieren Sie die Platte zwei Minuten bei 100 × g und inkubieren Sie sie anschließend 16 bis 18 Stunden unter standardmäßigen Inkubationsbedingungen.Zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten bei 300 × g und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie alle Vertiefungen mit je 200 µL Fluoreszenz-Aktiviert-Zellsortier- oder FACS-Puffer. Bereiten Sie eine Master-Mischung für Oberflächenantikörper im FACS-Puffer wie hier dargestellt vor.Suspendieren Sie die Zellen erneut in 50 Mikroliter pro Vertiefung Antikörper-Mastermix und mischen Sie gründlich durch mindestens fünfmaliges Auf- und Abpipettieren. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten bei vier Grad Celsius, in Aluminiumfolie eingewickelt, um Lichteinfluss zu vermeiden. Geben Sie 150 Mikroliter pro Vertiefung FACS-Puffer hinzu.Nach der Zentrifugation die Zellen in 100 Mikroliter pro Mulde fünf Mikromolar DAPI in FACS-Puffer resuspendieren. Unverzüglich zur Durchflusszytometrie-Aufnahme übergehen, ohne vorherige Inkubation vor der Aufnahme. Die Durchflusszytometrie mit dem Cytek Aurora-Gerät durchführen und die Fluoreszenzkanäle für CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI sowie alle weiteren Fluorophore aufzeichnen.Während der Kokultur wurden Effektorzellen, lebende Zielzellen und tote Zellen mittels Echtzeit-Lebendzellmikroskopie visualisiert. Die CAR2- und CAR3-NK-92-Zellen zeigten eine schnellere Abtötungskinetik als die CAR1-NK-92-Zellen, insbesondere zu früheren Zeitpunkten bei einem gleichen Effektor-zu-Ziel-Zell-Verhältnis. Die Abtötung der Zielzellen nahm mit höheren Effektor-zu-Ziel-Verhältnissen zu, einschließlich der Kontroll-NK-92-Zellen, die eine natürliche Zytotoxizität aufwiesen.CAR2- und CAR3-NK-92-Zellen zeigten bei niedrigeren Effektor-zu-Target-Verhältnissen zu späteren Zeitpunkten eine höhere Wirksamkeit. Während zu früheren Zeitpunkten eine erhöhte Wirksamkeit bei intermediären Effektor-zu-Target-Verhältnissen beobachtet wurde. Zur Quantifizierung der Wirksamkeit, Abtötungskinetik und gesamten zytotoxischen Leistungsfähigkeit von CAR-NK-92-Zellen über verschiedene Effektorpopulationen hinweg wurden drei Parameter definiert: KR50, KT50 und IKI-50.Die Zugabe von Daratumumab allein verringerte die Überlebensfähigkeit der Zielzellen nicht, was bestätigt, dass der Antikörper ohne Effektorzellen keine direkte Wirkung auf die Vitalität der Zielzellen hatte. Die Kokultur mit NK-Zellen allein reduzierte die Überlebensfähigkeit der Zielzellen auf etwa 70 %, was auf eine basale natürliche Zytotoxizität hinweist. Die Zugabe von Daratumumab verringerte die Zellüberlebensfähigkeit weiter auf etwa 37 %, was mit einer verstärkten antikörpervermittelten Zytotoxizität übereinstimmt.Im Gegensatz dazu zeigte die Isotyp-Kontrollbedingung eine Überlebensrate von etwa 62 %, vergleichbar mit der NK-allein-Bedingung. Die Degranulation der NK-Zellen war am niedrigsten in der Koinkubation von NK-Zellen und Zielzellen ohne Antikörper und am höchsten in der mit Daratumumab behandelten Bedingung mit etwa 31 %, während die Isotyp-Kontrolle eine mittlere Degranulation mit etwa 19 % aufwies. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die natürliche Zytotoxizität von NK-Zellen zu quantifizieren, die Tumortötungspotenz von CAR-NK-Konstrukten zu bewerten und die ADCC-Wirksamkeit monoklonaler Antikörper zu vergleichen. Ein wesentlicher Aspekt bei der Durchführung dieses Protokolls ist die sorgfältige und konsistente Zellzählung, Pipettierung und Auftragung von NK- und Zielzellen, um zuverlässige und interpretierbare Ergebnisse sicherzustellen.Zukünftige Studien können diese Protokolle nutzen, um die Immunevasion von NK-Zellen zu untersuchen, die Tumoranfälligkeit zu vergleichen und neuartige, auf NK-Zellen basierende Immuntherapien bei verschiedenen Krebserkrankungen zu bewerten.

quantifying-nk-cell-cytotoxicity-potentiated-chimeric-antigen

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die lytische Aktivität natürlicher Killerzellen gegen fluoreszenzgefärbte Zielzellen. Die Methode ermöglicht die Messung der NK-Zell-induzierten Zytotoxizität durch Färbung toter Zellen und Verwendung eines Durchflusszytometers zur Quantifizierung lebender und toter Zielzellen.

Natürlicher Killerzell-vermittelter Zytotoxizitätsassay Probenvorbereitung für die durchflusszytometrische Analyse

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt einen sensitiven, zellbasierten Zytotoxizitätstest. Durch die Aufzählung der Abnahme der Häufigkeit von lebenden CD4+ T-Zielzellen in Gegenwart einer zunehmenden Anzahl von Effektor-CD8+ T-Zellen ermöglicht dieser Assay die direkte Beurteilung der zytolytischen Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen.

Zellbasierter Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität

Eine einfache und zuverlässige Methode wird hier beschrieben eine Reihe von NK-Zellfunktionen wie Degranulierung, Zytokin und Chemokin-Produktion in verschiedenen NK-Zelluntergruppen zu analysieren.

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Diese Arbeit beschreibt einen fortgeschrittenen Arbeitsablauf zur genauen und schnellen Bestimmung der NK-Zellzahl (Natural Killer) und der Zytotoxizität von NK-Zellen in menschlichen Blutproben.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

Eine Flow Cytometry basierende Methode quantitativ bestimmen die zytotoxische Aktivität des menschlichen natürliche Killerzellen wird hier angezeigt.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Wir beschreiben ein quantitatives Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay-System zur Bewertung der Wirksamkeit von chimeric antigenen Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf flüssige und solide Tumorzellen abzielen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Immuneffektorzellen sowie Kombinationsbehandlungen zu bewerten.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Ein Protokoll zur Bewertung der quantitativen Abtötung von Tumorzellen durch Jurkat-Zellen, die chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren, der auf ein einzelnes Tumorantigen abzielt. Dieses Protokoll kann als Screening-Plattform für die schnelle Optimierung von CAR-Scharnierkonstrukten vor der Bestätigung in aus dem peripheren Blut gewonnenen T-Zellen verwendet werden.

Schnelle In-vitro-Zytotoxizitätsbewertung des Jurkat-exprimierenden chimären Antigenrezeptors mittels Fluoreszenzbildgebung

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Identifizierung von Verbindungen vor, die den ADCC-Mechanismus, einen wichtigen Krebszell-Abtötungsmechanismus von Antitumor-Antikörpern, modulieren. Die zytotoxische Wirkung von NK-Zellen wird in Brustkrebszell-Sphäroiden in Gegenwart von Trastuzumab gemessen. Die Bildanalyse identifiziert lebende und tote Killer- und Zielzellen in Sphäroide.

Quantifizierung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität in einem Tumor-Sphäroid-Modell: Anwendung für die Wirkstoffforschung

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Doppelemulsionströpfchen, die eine T-Zelle und eine Krebszielzelle verkapseln, um die Zellabtötung auf Einzelzellebene zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die duale Quantifizierung sowohl zytotoxischer Moleküle als auch der Apoptose der Zielzellen innerhalb einer großen Population von T-Zellen.

Tröpfchenbasierter Zytotoxizitätsassay zur Beurteilung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf Einzelzellebene

Ragon Institute of Mass General, MIT, and Harvard.  Dieses Protokoll bietet einen standardisierten in-vitro. Arbeitsablauf für die konsistente Messung der natürlichen, chimerischen Antigenrezeptor-vermittelten und antikörperabhängigen Zytotoxizität menschlicher natürlicher Killerzellen mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie.

Quantifizierung der NK-Zell-Zytotoxizität, verstärkt durch chimerische Antigenrezeptoren und therapeutische Antikörper mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie

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