Funktionelle Charakterisierung einzelner prä- und postsynaptischer Partner im zentralen Nervensystem der Drosophila-Larve mittels CaMPARI
June 16th, 2026
Dieses Protokoll bewertet die funktionelle synaptische Aktivität zwischen definierten neuronalen Partnern in vivo im zentralen Nervensystem der Drosophila melanogaster-Larven mit genetisch codierten Werkzeugen. CsChrimson-vermittelte optogenetische Stimulation präsynaptischer cIVda-Sensorneuronen induziert eine calciumabhängige Photokonversion von CaMPARI in postsynaptischen Basin-4-Interneuronen.
Unsere Forschung konzentriert sich auf die Beurteilung der funktionellen synaptischen Konnektivität zwischen definierten neuronalen Knotenpartnern in lebenden und dissezierten Drosophila-Larven. Herkömmliche Methoden erfordern eine Dissektion oder physische Stimulation. Dieses Protokoll verwendet Optogenetik in intakten Larven und reduziert Artefakte.
Zum Beginn das Maismehl-Agar-Medium in einer Mikrowelle für 8-10 Sekunden ohne Kochen schmelzen und bei Raumtemperatur ohne Verfestigung abkühlen lassen. Vor dem vollständigen Abkühlen fügen Sie all-trans-Retinal oder ATR in einer Konzentration von 0,5 Millimolar hinzu, um das Medium für Fliegen zu ergänzen, die eine csChrimson-Aktivierung benötigen. Decken Sie die Fläschchen vollständig mit Alufolie ab, um Lichteinwirkung zu verhindern.
Kreuzen Sie Jungfernweibchen, die die CaMPARI- und csChrimson-Gene tragen, mit Männchen, die die GAL4- und LexA-Treibergene in Plastikfläschchen mit dem vorbereiteten Medium tragen. Bereiten Sie parallele Fläschchen ohne ATR als Kontrollen vor. Inkubier Sie die Fläschchen bei 25 Grad Celsius, bis die Larven das dritte Larvenstadium erreichen.
Verwenden Sie einen Pinsel, um eine Larve im dritten Larvenstadium zu sammeln. Spülen Sie die Larve in einer Mikro-Spot-Platte mit drei Kammern, die 0,1 molares PBS enthält, um anhaftendes Futter zu entfernen. Platzieren Sie eine kleine Menge Modelliermasse an jeder Ecke eines sauberen 18 x 18 Millimeter Deckglases.
Platzieren Sie die Larve in einem Tropfen PBS auf dem Deckglas und lassen Sie sie sich mit der Bauchseite nach unten orientieren. Platzieren Sie einen sauberen Objektträger über dem Deckglas mit der Larve. Sichern Sie das Deckglas, indem Sie Modelliermasse auf die Ecken auftragen, mit gerade genug Druck, um die Larve zu immobilisieren, ohne sie zu zerquetschen oder das Glas zu brechen.
Platzieren Sie den Objektträger mit der Larve auf der Bühne eines konfokalen Mikroskops, das mit einem 40x/1.2-Objektiv ausgestattet ist. Klicken Sie in der Mikroskop-Software-Oberfläche auf Live. Klicken Sie dann unter dem Z Stack-Panel auf Set First und dann auf Set Last, gefolgt von Stop, um einen Baseline-Z Stack von postsynaptischen Neuronen zu erfassen, die CaMPARI exprimieren.
Setzen Sie unter dem Channels-Menü den 488 Nanometer grünen Kanal mit 0,8% Laserleistung. Setzen Sie als Nächstes den 561 Nanometer roten Kanal auf 0,8% Laserleistung. Setzen Sie unter dem Z Stack-Menü den Intervallwert auf 1 Mikrometer.
Wählen Sie im Acquisition-Menü Presets, um die 256 x 256 Pixel Auflösung einzustellen. Ein Line Averaging Wert von 2, bidirektionales Scannen und eine Scangeschwindigkeit von 9, die automatische Aktualisierung der Pixelzeit ermöglicht. Führen Sie alle Bildgebung in einer dunklen Umgebung durch und halten Sie identische Aufnahmeparameter während des gesamten Experiments bei.
Setzen Sie das 405 Nanometer Photokonversionslicht auf 0,5% Laserleistung. Und das 561 Nanometer optogenetische Stimulationslicht auf 0,8% Laserleistung. Klicken Sie auf Live und wählen Sie Best Fit unter dem Histogramm-Panel.
Lassen Sie beide Laser die Larve für 30 Sekunden gleichzeitig stimulieren, dann beenden Sie die Stimulation. Während der post-stimulativen ZStack-Erfassung unter Verwendung der gleichen Parameter wie bei der Baseline beobachten Sie rote CaMPARI-Fluoreszenz in laser-stimulierten Neuronen von ATR-gefütterten Larven mit minimaler Photokonversion und Kontrollen. Klicken Sie in der Fiji ImageJ Software auf Datei und wählen Sie dann Öffnen.
Klicken Sie im Fenster mit den BioFormats-Importoptionen mit Standardeinstellungen auf OK, um das erfasste ZStack-Bild zu öffnen. Wählen Sie unter dem Bild-Menü Farbe und dann Split Channels, um die roten und grünen Kanäle des erfassten Bildes anzuzeigen. Für die Hintergrundsubtraktion klicken Sie auf Prozess und wählen Sie dann Hintergrund subtrahieren.
Setzen Sie im Pop-up-Fenster den Rolling Ball Radius auf 50 Pixel und klicken Sie dann auf OK und wählen Sie Ja im Process Stack-Fenster. Wählen Sie als Nächstes unter dem Analyse-Menü Werkzeuge und dann ROI Manager, um das ROI-Fenster zu öffnen. Verwenden Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug, um Bereiche von Interesse um einzelne Zellen herum zu umreißen.
Wählen Sie im ROI-Fenster Hinzufügen, um den ausgewählten Umriss zu speichern. Klicken Sie dann auf Messen, um Fläche, Mittelwert, Standardabweichung und integrierte Dichte-Ergebnisse zu generieren. Wiederholen Sie den Prozess für mehrere Zellen derselben Larve getrennt für die grünen und roten Kanäle.
Nachdem Sie die Ergebnisse in ein Tabellenkalkulation exportiert haben, messen Sie das Rot zu Grün oder R durch G-Verhältnis der integrierten Dichten für jede Zelle und berechnen Sie den Durchschnitt dieser Werte, um das mittlere R durch G-Verhältnis pro Larve für sowohl die Vor- als auch Nach-Stimulationsbilder zu berechnen. Berechnen Sie schließlich die Fluoreszenzänderung oder Delta R durch G durch Subtrahieren des Vor-Stimulations-R durch G-Verhältnis vom Nach-Stimulations-R durch G-Verhältnis, um die postsynaptische Calcium-Aktivität zu quantifizieren. Die funktionellen Konnektivitätsstudien zwischen Klasse-IV-dendritischen Arborisation oder cIVda-Neuronen und Basin-4-Interneuronen in Larven des dritten Larvenstadiums zeigten, dass die Basin-4-Interneuronen grüne Fluoreszenz aufgrund der cytoplasmatischen CaMPARI-Expression vor Photokonversion und optogenetischer Lichtstimulation aufwiesen.
Unter Baselinebedingungen wurde keine rote Fluoreszenz nachgewiesen, was das Fehlen einer Photokonversion vor der Stimulation bestätigte. Gleichzeitige Photokonversionslichtexposition und optogenetische Stimulation resultierten in CaMPARI-Photokonversion von grüner zu roter Fluoreszenz. Das Fehlen roter Fluoreszenz in der Kontrolle zeigt an, dass die Photokonversion spezifisch durch csChrimson-vermittelte neuronale Aktivität angetrieben wurde.
Delta rot durch grüne Fluoreszenz war bei experimentellen Tieren signifikant höher als bei Kontrollen ohne ATR. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine synaptische Partnerschaft zu bestätigen, indem es die Verfolgung der präsynaptischen Stimulation gefolgt von unmittelbaren postsynaptischen Reaktionen in sich entwickelnden lebenden Tieren ermöglicht. Der schwierigste Schritt ist die korrekte Immobilisierung der Tiere, die ausreichenden Druck erfordert, um Bewegungen zu verhindern, ohne das Tier zu schädigen.
Zukünftige Studien könnten die Verfolgung, die Bildung, Stärkung und sogar die Eliminierung von synaptischen Verbindungen zwischen spezifischen neuronalen Populationen während einer sich entwickelnden Tier ermöglichen.
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Overview
This article presents a method to functionally validate synaptic connectivity in the Drosophila larval nervous system by combining optogenetic activation with CaMPARI-based calcium imaging. The approach enables researchers to assess activity-dependent synaptic signaling between identified sensory neurons and interneurons in intact, undissected third-instar larvae.
Key Study Components
Area of Science
- Neurobiology
- Functional connectomics
- Optogenetics
- Calcium imaging
Background
- Connectome studies have mapped synaptic connectivity in various species, including Drosophila.
- Electron microscopy provides detailed anatomical data but lacks functional information.
- Recent Drosophila research has identified key neuronal networks underlying specific behaviors, such as nociception.
- Class IV dendritic arborization (cIVda) sensory neurons form major synaptic contacts with Basin-4 interneurons by the third instar larval stage.
Purpose of Study
- To functionally assess synaptic connectivity between cIVda nociceptors and Basin-4 interneurons in Drosophila larvae.
- To demonstrate the utility of CaMPARI as an activity-dependent reporter in live, undissected larvae.
- To establish a proof-of-principle protocol combining optogenetic stimulation and CaMPARI photoconversion.
Methods Used
- Immobilization of third-instar Drosophila larvae on microscope slides.
- Optogenetic activation of cIVda nociceptors using the red-shifted channelrhodopsin CsChrimson.
- Simultaneous CaMPARI photoconversion in Basin-4 interneurons to detect calcium influx.
- Fluorescence imaging to monitor CaMPARI color change as a readout of synaptic activity.
Main Results
- Calcium-dependent photoconversion of CaMPARI was observed in Basin-4 interneurons following optogenetic stimulation of cIVda neurons.
- The method provided functional evidence of synaptic connectivity despite internal larval movements and focal plane changes.
- The approach validated the anatomical connections identified by connectome studies with functional data.
Conclusions
- CaMPARI-based photoconversion is a reliable indicator of synaptic activation in intact Drosophila larvae.
- The protocol enables functional validation of connectomic data in vivo.
- This method can be broadly applied to study neuronal network function in genetically tractable organisms.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Functional validation of synaptic connectivity is critical for de-risking target selection and advancing mechanistic understanding in neurobiology-driven drug discovery. This CaMPARI-based approach enables direct assessment of activity-dependent signaling between defined neuronal partners in intact systems, bridging the gap between anatomical connectomics and actionable functional data. Such methods enhance predictive confidence at the target validation and early discovery inflection points, supporting portfolio decisions in CNS and neurodevelopmental pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of functional synaptic connectivity beyond anatomical mapping.
- Supports mechanistic de-risking by confirming physiologically relevant neuronal interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Facilitates development of validated, activity-dependent readouts for neuronal assays.
- Provides quantitative, ratiometric outputs suitable for reproducible screening workflows.
- Enables robust assay standardization by integrating optogenetic stimulation with functional imaging.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional synaptic data with disease-relevant neural circuits in preclinical models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking connectomic and functional endpoints.
- De-risks translational biomarker strategies by confirming in vivo neuronal activity patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through assay development and preclinical research, providing a reusable platform for functional connectomics in genetically tractable systems.
- Discovery Biology: Validates synaptic function and pathway engagement in intact neural circuits.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables ratiometric measurement of calcium-dependent activity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges anatomical and functional data to inform disease-relevant model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable workflow adaptable to diverse neuronal targets and circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes functional readouts and supports reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes targets with validated functional relevance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of CNS and neurodevelopmental programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, calcium imaging, and genetic model systems.
- Needs fluorescence microscopy infrastructure and precise light delivery systems.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data interpretation.
- Adaptation to other model systems depends on genetic tractability and optical accessibility.
- Internal movement and focal plane changes in live imaging must be managed for reliable outputs.