Funktionelle Charakterisierung einzelner prä- und postsynaptischer Partner im zentralen Nervensystem der Drosophila-Larve mittels CaMPARI

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Bewertung der funktionellen synaptischen Konnektivität zwischen definierten Neuralknotenpartnern in lebenden und dissektionierten Drosophila-Larven. Konventionelle Methoden erfordern eine Sezierung oder körperliche Stimulation. Dieses Protokoll verwendet Optogenetik in intakten Larven und reduziert Artefakte.

Zunächst schmelzen Sie das Maismehl-Agar-Medium 8-10 Sekunden lang in der Mikrowelle ohne Kochen und lassen Sie es bei Zimmertemperatur abkühlen, ohne zu festigen. Vor der vollständigen Abkühlung wird All-Trans-Retinal, oder ATR, zu einer Konzentration von 0,5 Millimolar hinzugefügt, um das Medium für Fliegen zu ergänzen, die eine csChrimson-Aktivierung benötigen. Decken Sie die Fläschchen vollständig mit Alufolie ab, um Lichteinwirkung zu vermeiden.

Kreuze jungfräuliche Frauen mit den CaMPARI- und csChrimson-Genen, wobei Männer die GAL4- und LexA-Driver-Gene in Plastikphiolen mit dem vorbereiteten Medium tragen. Bereite parallele Fläschchen ohne ATR als Steuerung vor. Brüten Sie die Phiolen bei 25 Grad Celsius aus, bis die Larven das dritte Stadium erreicht haben.

Benutze einen Pinsel, um eine Larve im dritten Larvenstadium zu sammeln. Spülen Sie die Larve in einer Drei-Well-Mikropunktplatte mit 0,1 molaren PBS, um haftende Nahrung zu entfernen. Legen Sie eine kleine Menge Modellierton an jede Ecke eines sauberen 18 x 18 Millimeter großen Deckschilds.

Setzen Sie die Larve in einen Tropfen PBS auf den Deckel und lassen Sie sie mit der Bauchseite nach unten orientieren. Lege einen sauberen Mikroskop-Objektträger über den Deckmantel mit der Larve. Sichern Sie den Deckmantel, indem Sie Modellierton auf die Ecken auftragen und dabei gerade genug Druck ausüben, um die Larve zu beruhigen, ohne sie zu zerquetschen oder das Glas zu zerbrechen.

Stellen Sie das Objektträger mit der Larve auf die Bühne eines Konfokalmikroskops, das mit einem 40x/1,2-Objektiv ausgestattet ist. Klicken Sie in der Oberfläche der Mikroskop-Software auf Live. Dann klicke unter dem Z-Stack-Panel auf Set First und dann Set Last und anschließend auf Stop, um einen Basis-Z-Stack postsynaptischer Neuronen zu erhalten, der CaMPARI ausdrückt.

Im Menü Kanäle stellen Sie den 488 Nanometer großen grünen Kanal mit 0,8 % Laserleistung ein. Als Nächstes stellen Sie den 561-Nanometer-Rotkanal auf 0,8 % Laserleistung ein. Im Z-Stack-Menü stellen Sie den Intervallwert auf 1 Mikrometer.

Im Erwerbsmenü wählen Sie Presets, um die Auflösung von 256 x 256 Pixel festzulegen. Ein Zeilenmittelwert von 2, bidirektionales Scannen und eine Scangeschwindigkeit von 9, was eine automatische Aktualisierung der Pixelzeit ermöglicht. Führen Sie alle Bildgebungen in einer dunklen Umgebung durch und behalten während des gesamten Experiments identische Aufnahmeparameter bei.

Stellen Sie das 405-Nanometer-Photokonversionslicht auf 0,5 % Laserleistung ein. Und das 561 Nanometer starke optogenetische Stimulationslicht auf 0,8 % Laserleistung. Klicke auf Live und wähle dann unter dem Histogramm-Panel Best Fit.

Lassen Sie beide Laser die Larve 30 Sekunden lang gleichzeitig stimulieren und stoppen Sie dann die Stimulation. Während der Nachstimulation der ZStack-Aufnahme mit denselben Parametern wie bei der Basislinie beobachten Sie rote CaMPARI-Fluoreszenz in laserstimulierten Neuronen von ATR-gefütterten Larven mit minimaler Photokonversion und Kontrollen. In der Fiji ImageJ-Software klicken Sie auf Datei und wählen Sie dann Öffnen.

Im BioFormats-Importoptionsfenster mit Standardeinstellungen klicken Sie auf OK, um das erworbene ZStack-Bild zu öffnen. Im Bildmenü wählen Sie Farbe und dann Kanäle aufteilen, um die roten und grünen Kanäle des aufgenommenen Bildes anzuzeigen. Für Hintergrundsubtraktion klicken Sie auf Verarbeiten und wählen Sie dann Hintergrund subtrahieren.

Im Pop-up-Fenster stellen Sie den Rolling-Ball-Radius auf 50 Pixel ein, klicken Sie dann auf OK und wählen Sie im Prozessstapel-Fenster Ja aus. Als Nächstes wählen Sie unter dem Menü Analysieren Tools und dann ROI Manager, um das ROI-Fenster zu öffnen. Verwenden Sie das freihändige Auswahlwerkzeug, um Interessensgebiete rund um einzelne Zellen zu markieren.

Im ROI-Fenster wählen Sie Hinzufügen, um die ausgewählte Gliederung zu speichern. Klicken Sie dann auf Messen, um Ergebnisse wie Flächen, Mittelwert, Standardabweichung und integrierte Dichte zu generieren. Der Vorgang wird für mehrere Zellen derselben Larve separat über grüne und rote Kanäle wiederholt.

Nach dem Export der Ergebnisse in eine Tabelle missen Sie das Verhältnis von Rot zu Grün oder R mal G der integrierten Dichten jeder Zelle und mitteln diese Werte, um das mittlere R-zu-G-Verhältnis pro Larve sowohl für die Vor- als auch nach der Stimulation zu berechnen. Schließlich berechnet man die Änderung der Fluoreszenz oder Delta R durch G, indem man das R-G-Verhältnis vor der Stimulation vom R-G-Verhältnis nach der Stimulation subtrahiert, um die postsynaptische Kalziumaktivität zu quantifizieren. Die funktionellen Konnektivitätsstudien zwischen dendritischen Arborisationsneuronen der Klasse IV oder cIVda-Neuronen und Basin-4-Interneuronen in Larven des dritten Stadiums zeigten, dass die Basin-4-Interneuronen aufgrund zytosolischer CaMPARI-Expression vor der Photokonversion und optogenen Lichtstimulation grüne Fluoreszenz zeigten.

Unter Ausgangsbedingungen wurde keine rote Fluoreszenz festgestellt, was das Fehlen einer Photokonversion vor der Stimulation bestätigt. Gleichzeitige Fotoumwandlung, Lichtbelichtung und optogenetische Stimulation führten zu der CaMPARI-Photokonversion von grüner zu roter Fluoreszenz. Das Fehlen roter Fluoreszenz in der Kontrolle deutet darauf hin, dass die Photokonversion speziell durch csChrimson-vermittelte neuronale Aktivität angetrieben wurde.

Delta-rot durch grüne Fluoreszenz war bei Versuchstieren signifikant höher als bei keinem ATR-Kontrollobjekt. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die synaptische Partnerschaft zu bestätigen, indem es die Nachverfolgung der präsynaptischen Stimulation gefolgt von unmittelbaren postsynaptischen Reaktionen bei lebend entwickelnden Tieren ermöglicht. Der schwierigste Schritt ist die ordnungsgemäße Immobilisierung des Tieres, die ausreichend Druck erfordert, um eine Bewegung zu verhindern, ohne das Tier zu schädigen.

Zukünftige Studien könnten die Verfolgung, die Entstehung, Stärkung und sogar die Eliminierung synaptischer Verbindungen zwischen bestimmten neuronalen Populationen während eines sich entwickelnden Tieres ermöglichen.