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Diese Arbeit wurde vom Cancer Biology and Precision Therapeutics Center der China Medical University im Rahmen des Featured Areas Research Center Programms im Rahmen des Higher Education Sprout Project des Ministeriums für Bildung (MOE) in Taiwan (CBPTC-PROJ-5-2) unterstützt.
Wir danken dem Cancer Biology and Precision Therapeutics Center für die finanzielle Unterstützung und akademische Förderung.

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Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an.

Mehrere Schritte in diesem Protokoll sind entscheidend, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Erstens beeinflusst die Qualität und Reinheit der PBMC-Isolierung direkt die Ausbeute an Makrophagen und die Differenzierungseffizienz. Ein sorgfältiges Aufschichten verdünnten Blutes auf die Ficoll-Dichtegradienten und die Zentrifugation mit ausgeschalteter Bremse sind unerlässlich, um die Buffy-Coat-Grenzschicht zu erhalten. Unvollständige Erythrozytenlyse oder übermäßige Inkubation mit dem Lysepuffer bee...

Brustkrebs ist weltweit die häufigste bei Frauen diagnostizierte maligne Erkrankung und macht jährlich etwa 2,3 Millionen neue Fälle aus1. Die Erkrankung ist klinisch heterogen und wird basierend auf dem Status der Hormonrezeptoren – Östrogenrezeptor (ER) und Progesteronrezeptor (PR) – sowie der Expression des Onkogens humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) in mindestens vier wichtige molekulare Subtypen eingeteilt2. Luminal-A-Tumoren exprimieren ER und/oder PR ohne HER2-Überexpression (ER/PR+ und HER2−); Luminal-B-Tumoren exprimieren sowohl ER/PR als auch HER2 (ER/PR+ und HER2+); HER2+-Tumoren zeichnen sich durch eine hohe HER2-Expression unabhängig vom Hormonrezeptorstatus aus; und der triple-negativen Brustkrebs (TNBC) weist keinen Nachweis aller drei Marker auf (ER−, PR− und HER2−)2,3. Unter diesen Subtypen stellt TNBC die klinisch herausforderndste Form dar und macht etwa 15–20 % aller Brustkrebsfälle aus. Patientinnen mit TNBC weisen den aggressivsten Krankheitsverlauf auf, mit der schlechtesten Prognose und der kürzesten Überlebensrate innerhalb von fünf Jahren, bedingt durch schlechte Ansprechen auf herkömmliche Chemotherapien und das Fehlen wirksamer zielgerichteter Therapien3,4. Darüber hinaus zeigt TNBC eine signifikant hohe Neigung zu viszeralen Metastasen, insbesondere zu den Lungen innerhalb von fünf Jahren nach der Diagnosestellung, und Patientinnen mit fortgeschrittenem oder metastasierendem TNBC (mTNBC) haben eine mediane Überlebensdauer, die selten zwei Jahre überschreitet5,6. Diese Statistiken unterstreichen die dringende, bisher unerfüllte Notwendigkeit neuer therapeutischer Strategien für TNBC.
Die Tumormikroumgebung (TME) spielt eine entscheidende Rolle bei der Progression von Brustkrebs und der Immunvermeidung. Tumorzugeordnete Makrophagen gehören zu den häufigsten Immunzellen innerhalb der TME und wurden kürzlich als entscheidende Vermittler der angeborenen Anti-Tumor-Immunität anerkannt7,8,9. Während TAMs historisch in proinflammatorische „M1“- und protumorale „M2“-Zustände unterteilt wurden, vermag dieses binäre Modell die tatsächliche Heterogenität der Makrophagen nicht abzubilden. Vielmehr besetzen TAMs ein dynamisches funktionelles Spektrum, das sich als Reaktion auf die vielfältigen biochemischen Signale innerhalb der TME entwickelt. In diesem komplexen Umfeld unterwandern Krebszellen aktiv die Makrophagenaktivität durch verschiedene Strategien der Immunvermeidung, insbesondere durch die Überexpression von „nicht fressen“-Signalen. Die CD47/SIRPα-Achse war in diesem Zusammenhang der erste identifizierte Checkpoint der angeborenen Immunität6,10; kürzlich hat sich CD24 als neuartiges und starkes antiphagozytäres Signal erwiesen11,12. CD24 ist ein kleines, stark glykosyliertes, mucinartiges Glykoprotein, das über eine glycosylphosphatidylinositolartige Verankerung an der Zellmembran haftet13. Unter physiologischen Bedingungen wird CD24 in verschiedenen Immunzelllinien exprimiert, ist jedoch häufig in soliden Tumoren überexprimiert, darunter Brust-, Eierstock-, Pankreas- und kolorektale Karzinome14. Auf Tumorzellen bindet CD24 an den inhibitorischen Rezeptor Sialinsäure-bindendes immunglobulinähnliches Lektin 10 (Siglec-10), der auf Makrophagen exprimiert wird. Diese Interaktion löst die Phosphorylierung der immuntypischen Tyrosin-basierten inhibitorischen Motivdomänen im zytoplasmatischen Schwanz von Siglec-10 aus und aktiviert dadurch die Phosphatasen SHP-1 und SHP-2, welche die nachgeschaltete phagozytäre Signalübertragung unterdrücken11. Die Blockade der CD24/Siglec-10-Interaktion mittels monoklonaler Antikörper hat sich als wirksame Maßnahme erwiesen, um die Phagozytose von CD24-exprimierenden menschlichen Tumoren durch Makrophagen deutlich zu verstärken. In einer kürzlich durchgeführten Studie zeigten wir außerdem, dass der Knockout von CD24a in Brustkrebszellen deren Anfälligkeit für die phagozytäre Aufnahme durch Makrophagen in einem murinen Modell des triple-negativen Brustkrebs erhöht9.
Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) ist ein zentraler Mechanismus, durch den Antikörper Makrophagen anweisen, Tumorzellen zu phagozytieren15,16. Nach Bindung an auf Tumorzellen exprimierte Antigene erkennt die Fc-Region des Antikörpers Fcγ-Rezeptoren (FcγR) auf Makrophagen und löst dadurch intrazelluläre Signalwege aus, die in einer Umorganisation des Zytoskeletts, der Bildung einer phagozytotischen Mulde und dem Einhüllen der Zielzelle münden17.
In dieser Studie haben wir ein Zeitrafferaufnahmeverfahren für die Live-Cell-Bildgebung entwickelt und validiert, um die antikörpervermittelte Phagozytose von Brustkrebszellen durch Makrophagen zu messen. Die Methode verwendet aus peripheren mononukleären Blutkörperchen (PBMCs) von gesunden menschlichen Spenderinnen und Spendern stammende Makrophagen, die mit makrophagenkoloniestimulierendem Faktor (M-CSF) differenziert und anschließend mit Lipopolysaccharid (LPS) und Interferon-Gamma (IFN-γ) stimuliert werden. Die Durchflusszytometrie bestätigte die Hochregulation von CD80 innerhalb der CD11b⁺-Population nach Stimulation (Abbildung 1), was das klassisch aktivierte Phänotyp unterstützt. Dieser Aktivierungszustand verleiht eine starke antikörpervermittelte phagozytische Kapazität und eignet sich daher gut zur Beurteilung der antikörperabhängigen zellulären Phagozytose (ADCP). GFP-markierte CD24-positive Brustkrebszellen dienen als Zielzellen und werden vor der Kokultur mit einem therapeutischen anti-CD24 monoklonalen Antikörper opsonisiert. Phagozytische Ereignisse werden über einen Zeitraum von 16 Stunden mithilfe eines automatisierten Mikroskops unter kontrollierten Umweltbedingungen aufgezeichnet. Um eine quantitative Bewertung parallel zur dynamischen Visualisierung zu ermöglichen, wird ein separates Endpunkt-Assay unter identischen Kokulturbedingungen durchgeführt, wodurch eine exakte Messung der Phagozytose nach Entfernung nicht internalisierter Zielzellen möglich ist. Dieses Protokoll bietet eine standardisierte, reproduzierbare und visuell informative Plattform zur Beurteilung der durch einen anti-CD24-Antikörper vermittelten ADCP. Wichtig ist, dass die Kombination von Zeitrafferaufnahmen mit einer komplementären, auf Endpunkten basierenden Quantifizierungsstrategie die gleichzeitige Evaluierung von Phagozytosekinetik und -ausmaß ermöglicht. Die Methode kann angepasst werden, um andere makrophagengerichtete immuntherapeutische Zielstrukturen zu untersuchen. Dieses Protokoll eignet sich am besten zur Beurteilung der ADCP, die durch therapeutische monoklonale Antikörper gegen Oberflächenantigene auf Krebszellen vermittelt wird. Es ist gut geeignet für den vergleichenden Screening von Kandidatenantikörpern, die Charakterisierung von Dosis-Wirk-Beziehungen sowie für mechanistische Studien zur Bindung zwischen Fc und FcγR, einschließlich der Effekte der Blockade von „Nicht-fress-mich“-Signalen (z. B. CD47–SIRPα). Da der Assay primäre humane Makrophagen verwendet, eignet er sich auch für translationsmedizinische Studien, bei denen die Variabilität zwischen Spenderinnen und Spendern vor der klinischen Entwicklung bewertet werden muss.
<img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71461/71461fig1.jpg" /> 
Abbildung 1. Erzeugung und Validierung mittels Durchflusszytometrie von aus peripheren mononukleären Blutzellen abgeleiteten, mit IFN-γ/LPS stimulierten Makrophagen. Oberes Feld: Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) werden aus Vollblut gesunder Spender durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Ficoll-Lösung bei 400 × g für 30 min bei 20 °C isoliert, wobei alle Reagenzien zuvor auf 20 °C ± 2 °C vorgeglichen wurden. Die isolierten PBMCs werden 7 Tage lang in ImmunoCult-SF-Medium, ergänzt mit 100 ng/mL makrophagenkoloniestimulierendem Faktor (M-CSF), kultiviert, um die Differenzierung zu Makrophagen zu induzieren (Tag 0–7), wobei am Tag 5 eine erneute Mediumzugabe erfolgt. Am Tag 8 werden die differenzierten Makrophagen 48 h lang mit 100 ng/mL IFN-γ und 1 µg/mL LPS stimuliert (Tag 8–10). Anschließend werden die Zellen einer Durchflusszytometrie-Analyse unterzogen. Unteres Feld: Durchflusszytometrische Analyse der Makrophagen. Die Zellen wurden mit einem Oberflächenantikörperset bestehend aus CD11b-FITC, CD80-PE und CD206-PerCP-Cy5.5 gefärbt und vor der Messung mit DAPI versetzt, um tote Zellen auszuschließen. Gating-Strategie: Zunächst erfolgte die Auswahl lebender Zellen (DAPI⁻), gefolgt von der Identifizierung von CD11b⁺-Zellen in einem CD11b-FITC- vs. FSC-A-Diagramm zur Bestätigung der Makrophagen-Identität. Anschließend wurden die lebenden CD11b⁺-Ereignisse in einem CD80- vs. CD206-Dotplot analysiert, um die durch IFN-γ/LPS-Stimulation induzierte CD80⁺CD206⁻-Population nachzuweisen. Rechts: Repräsentativer Dotplot von CD11b-FITC vs. FSC-A, der zeigt, dass 99,8 % der selektierten Zellen CD11b⁺ waren und somit die Makrophagen-Identität bestätigt wird. Links: Der Großteil der CD11b⁺-Zellen befand sich innerhalb des CD80⁺CD206⁻-Gates (Q1: 95,2 %), was das erwartete proinflammatorische Phänotyp unter den angewendeten Stimulationsbedingungen anzeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71461/71461fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Anwender sollten mehrere Einschränkungen berücksichtigen, wenn sie diese Technik anwenden. Erstens kann die Spendervariabilität bei aus PBMCs abgeleiteten Makrophagen eine erhebliche Varianz der phagozytotischen Aktivität verursachen; wir empfehlen daher die Verwendung mehrerer Spender (n ≥ 3), wobei die Einzeldaten der Spender zusammen mit den gepoolten Ergebnissen angegeben werden sollten. Zweitens bildet das 2D-Kokultursystem die Tumormikroumgebung nicht vollständig ab, und die Ergebnisse sollten vor klinischer Interpretation in 3D- oder In-vivo-Modellen validiert werden. Drittens erfasst das 16-stündige Bildaufnahmeintervall frühe phagozytotische Ereignisse, spiegelt jedoch keine langfristigeren Prozesse wie die Antigenpräsentation oder die sekundäre Immunaktivierung wider. Daher bietet die kombinierte Anwendung von Echtzeit-Bildgebung und Endpunkt-Quantifizierung ein ergänzendes Rahmenwerk, das die Interpretierbarkeit und Reproduzierbarkeit von ADCP-Messungen verbessert.

<table><tbody><tr><td>0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Stammlösung</td><td>Sigma-Aldrich (oder gleichwertig)</td><td>E7889 (oder gleichwertig)</td><td>Wird zur Herstellung einer 10 mM EDTA-Arbeitslösung in PBS für die Zellablösung verwendet</td></tr><tr><td>24-Loch-Gewebekulturplatten (TC-behandelt)</td><td>Corning (oder gleichwertig)</td><td>3524</td><td>Wird für die Kokultur von Makrophagen und Krebszellen während des Phagozytose-Assays verwendet</td></tr><tr><td>Anti-humanes CD206-Antikörper (Durchflusszytometrie)</td><td>BioLegend (oder gleichwertig)</td><td>321122 (oder gleichwertig)</td><td>Marker für das alternative Makrophagen-Phänotyp</td></tr><tr><td>Anti-humaner monoklonaler CD24-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)</td><td>MA1-91384 (oder gleichwertig)</td><td>Wird zum Opsonieren von Krebszellen für die antikörperabhängige Phagozytose verwendet</td></tr><tr><td>Automatisiertes Live-Cell-Imaging-System mit Umweltkammer (z. B. Lionheart FX)</td><td>Agilent Technologies (oder gleichwertig)</td><td>BioTek Lionheart FX Automated Microscope</td><td>Ermöglicht langfristige Zeitrafferaufnahmen unter kontrollierten Temperatur- und &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Bedingungen</td></tr><tr><td>Bildgebungssoftware für automatisiertes Live-Cell-Imaging (z. B. Gen5)</td><td>Agilent Technologies (oder gleichwertig)</td><td>N/V</td><td>Wird zur Aufnahme und Analyse von Zeitrafferaufnahmen verwendet</td></tr><tr><td>Zentrifuge (Schwenkkorbrotor)</td><td>Thermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)</td><td>Multifuge X4R Pro mit TX-1000-Rotor (oder gleichwertig)</td><td>Wird für die PBMC-Isolierung und Zellwaschschritte verwendet</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Inkubator (37&amp;deg;C, 5 % &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)</td><td>Forma Direct Heat &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Inkubator (oder gleichwertig)</td><td>Sichert physiologische Bedingungen für die Zellkultur</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Gasversorgung mit Druckregler</td><td>Agilent Technologies (oder gleichwertig)</td><td>N/V</td><td>Liefert &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; für die Umweltsteuerung im Inkubator und im Imaging-System</td></tr><tr><td>Kegelröhrchen (15 mL und 50 mL)</td><td>Corning (oder gleichwertig)</td><td>352070 (oder gleichwertig)</td><td>Wird für PBMC-Isolierung, Waschen und Zentrifugationsschritte verwendet</td></tr><tr><td>EDTA-beschichtete Blutentnahmeröhrchen (Vacutainer)</td><td>BD Biosciences (oder gleichwertig)</td><td>367863 (oder gleichwertig)</td><td>Wird zur Entnahme von Vollblutproben von Spendern verwendet</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva (oder gleichwertig)</td><td>17144003 (oder gleichwertig)</td><td>Dichtegradientenmedium zur Isolierung von PBMCs</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer (z. B. FACSCanto II)</td><td>BD Biosciences (oder gleichwertig)</td><td>BD FACSCanto II&amp;nbsp;</td><td>Wird für die phänotypische Analyse von Makrophagen verwendet</td></tr><tr><td>Kompensationsperlen (Durchflusszytometrie)</td><td>Biolegend (oder gleichwertig)</td><td>424602</td><td>Wird für Einzelfarben-Kompensationskontrollen verwendet</td></tr><tr><td>FITC-markierter anti-humaner CD11b-Antikörper (Durchflusszytometrie)</td><td>BioLegend (oder gleichwertig)</td><td>101205 (oder gleichwertig)</td><td>Marker zur Identifizierung von Makrophagen</td></tr><tr><td>PE-markierter anti-humaner CD80-Antikörper (Durchflusszytometrie)</td><td>BioLegend (oder gleichwertig)</td><td>375410 (oder gleichwertig)</td><td>Marker, der mit dem aktivierten Makrophagen-Phänotyp assoziiert ist</td></tr><tr><td>GFP-exprimierende Brustkrebszelllinie (MDA-MB-468)</td><td>ATCC (oder gleichwertig)</td><td>HTB-132 (oder gleichwertig)</td><td>Zielzellen im Phagozytose-Assay; GFP ermöglicht die Visualisierung</td></tr><tr><td>ImmunoCult-SF-Makrophagenmedium</td><td>STEMCELL Technologies (oder gleichwertig)</td><td>10961 (oder gleichwertig)</td><td>Serumfreies Medium zur Differenzierung von Makrophagen</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)</td><td>12100046</td><td>Wird für die Kultur und Resuspension von Krebszellen verwendet</td></tr><tr><td>Isotyp-Kontrollantikörper (IgG)</td><td>Bio X Cell (oder gleichwertig)</td><td>BE0297 (oder gleichwertig)</td><td>Negativer Kontrollantikörper für den antikörperabhängigen Phagozytose-Assay</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharid (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich (oder gleichwertig)</td><td>L2630 (oder gleichwertig)</td><td>Stimulus zur Aktivierung von Makrophagen in Kombination mit IFN-&amp;gamma;</td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner Interferon-gamma (IFN-&amp;gamma;)</td><td>STEMCELL Technologies (oder gleichwertig)</td><td>78020 (oder gleichwertig)</td><td>Zytokin zur Aktivierung von Makrophagen</td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor (M-CSF)</td><td>STEMCELL Technologies (oder gleichwertig)</td><td>78057 (oder gleichwertig)</td><td>Wachstumsfaktor zur Differenzierung von Makrophagen</td></tr><tr><td>Pasteur-Pipetten oder serologische Pipetten</td><td>Jetbiofil (oder gleichwertig)</td><td>GSP010010 (oder gleichwertig)</td><td>Wird für die Flüssigkeitshandhabung während der PBMC-Isolierung und Zellkultur verwendet</td></tr><tr><td>PBS (Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-frei)</td><td>Thermo Fisher Scientific (oder gleichwertig)</td><td>BP399-500 (oder gleichwertig)</td><td>Puffer zur Zellwäsche und Verdünnungsschritte</td></tr><tr><td>Petri-Schalen (100 mm, nicht&amp;ndash;gewebekulturbehandelt)</td><td>Corning (oder gleichwertig)</td><td>430591</td><td>Wird für die Differenzierung von Makrophagen mittels Adhärenzselektion verwendet</td></tr><tr><td>Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen (RBC)</td><td>BioLegend (oder gleichwertig)</td><td>420301 (oder gleichwertig)</td><td>Wird zur Entfernung roter Blutkörperchen während der PBMC-Isolierung verwendet</td></tr><tr><td>Viobility 405/452 Fixierbarer Farbstoff</td><td>Miltenyi Biotec (oder gleichwertig)</td><td>130-130-404 (oder gleichwertig)</td><td>Wird zur Beurteilung der Zellviabilität während der Durchflusszytometrie-Analyse verwendet</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich (oder gleichwertig)</td><td>D9542 (oder gleichwertig)</td><td>Wird zur Ausschließung toter Zellen in der Durchflusszytometrie verwendet</td></tr></tbody></table>

zeitraffer-bildgebung der antikörpergesteuerten phagozytose von grün fluoreszenzproteinmarkierten triple-negativen brustkrebszellen durch makrophagen

Time-Lapse Imaging of Antibody-Driven Macrophage Phagocytosis of Green Fluorescence Protein&#8211;Labeled Triple-Negative Breast Cancer Cells

Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose ist ein zentraler Mechanismus, durch den Makrophagen Antikörper-opsonierte Krebszellen aufnehmen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode der Zeitrafferaufnahme an lebenden Zellen, um die antikörperabhängige Phagozytose grün fluoreszierend markierter, CD24-exprimierender triple-negativer Brustkrebszellen durch Makrophagen sichtbar zu machen. Die Makrophagen werden aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen gewonnen, mit Makrophagen-Koloniestimulierendem Faktor differenziert und mittels Interferon-gamma und Lipopolysaccharid polarisiert, um ein proinflammatorisches Phänotyp zu erzeugen. Vor der Kokultur mit Makrophagen in einem definierten Effektor-zu-Target-Verhältnis werden die Krebszellen mit einem monoklonalen Anti-CD24-Antikörper opsoniert. Phagozytosevorgänge werden über einen Zeitraum von 16 Stunden mithilfe eines automatisierten Mikroskops mit Umweltkontrolle zur Aufrechterhaltung physiologischer Bedingungen aufgezeichnet. Die Aufnahmen erfolgen in Hellfeld- und Fluoreszenzkanälen, wodurch die Identifizierung der Krebszellen und die Beobachtung ihrer Internalisierung durch Makrophagen ermöglicht wird. Repräsentative Zeitrafferbilder zeigen die fortschreitende Aufnahme fluoreszierender Krebszellen im Zeitverlauf. Zur quantitativen Bewertung wird ein paralleler Endpunkt-Assay unter identischen Kokulturbedingungen durchgeführt, bei dem nicht internalisierte Krebszellen vor der Bildaufnahme entfernt werden, um eine genaue Quantifizierung der Phagozytosevorgänge zu ermöglichen. Diese Methode bietet einen standardisierten und reproduzierbaren Ansatz zur Visualisierung der antikörpervermittelten Makrophagenphagozytose in vitro. Insbesondere ermöglicht die Kombination von Zeitrafferaufnahmen mit der quantitativen Endpunktanalyse eine komplementäre Beurteilung der Kinetik und des Ausmaßes der Phagozytose. Dieses Protokoll unterstützt die Evaluierung therapeutischer Antikörper und makrophagengerichteter Krebsimmuntherapien in einem kontrollierten in-vitro-System.

Die erfolgreiche Generierung und Polarisation von Makrophagen aus PBMCs wurde mittels morphologischer Beurteilung und Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt (Abbildung 1). PBMCs, die durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert wurden, wurden in einem mit M-CSF angereicherten Medium kultiviert, wodurch sich bis zum Tag 7 adhärente Zellen mit charakteristischer Makrophagen-Morphologie bildeten. Nach Stimulation mit IFN-γ und LPS zeigten die Zellen ein Phänotyp, der mit einer Aktivierung unte...

Dieses Protokoll beschreibt eine Zeitrafferaufnahme-Methode zur Live-Cell-Bildgebung, um die antikörperabhängige Phagozytose grün fluoreszierend markierter triple-negativer Brustkrebszellen durch aus peripheren mononukleären Blutzellen abgeleitete Makrophagen mithilfe eines automatisierten Mikroskops zu visualisieren.

Zeitraffer-Bildgebung der antikörpergesteuerten Phagozytose von grün fluoreszenzproteinmarkierten triple-negativen Brustkrebszellen durch Makrophagen

Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose ist ein Schlüsselmechanismus, durch den Makrophagen antikörper-opsonisierte Krebszellen aufnehmen. Dieses Protokoll beschreibt eine ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Aufspaltung der Proteine ​​entweder innerhalb der Plasmamembran oder in intrazellulären Orten eines Regulierungsmechanismus, stark beeinflussen können Signalisierung Ergebnisse, daher zu verstehen Signalisierung ist es wichtig, die räumliche und zeitliche Verhalten der beteiligten Proteine ​​zu untersuchen. Wir beschreiben hier eine TIRF-Mikroskopie basierendes System zur Signaltransduktion in T-Zellen zu studieren, aber ist breit anwendbar.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Dieses Video zeigt einen Assay zur Überwachung unabhängiger Makrophagen-vermittelter Phagozytose-Ereignisse der roten Blutkörperchen (RBC). Immunglobulin G (IgG)-opsonisierte humane Erythrozyten der Maus werden mit Mausmakrophagen inkubiert und unter einem konfokalen Mikroskop betrachtet. Die Erythrozyten werden von Makrophagen über eine phagozytäre Becherbildung verschlungen und gezielt für den lysosomalen Abbau eingesetzt.

Echtzeit-Bildgebung der Makrophagen-Phagozytose von IgG-opsonisierten roten Blutkörperchen

Wir beschreiben ein Verfahren zur Abbildung als Reaktion auf...

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Phagozytose von fluoreszierenden Partikeln durch adhärente Makrophagenzelllinien mit einer fluorometrischen Methode. Diese Methode ermöglicht eine Hochdurchsatz-Quantifizierung der Partikelinternalisierung sowie der daraus resultierenden Aktinpolymerisation.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie ausgedehnte Zeitraffer-Bildgebung von mehrzelligen Interaktionen in Echtzeit durchzuführen, in vivo auf Einzelzellauflösung.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

Hier beschreiben wir das Modell und den Ansatz zur Untersuchung der Funktionen von Lungenalveolarmakrophagen bei der Metastasierung von Krebs. Um die Rolle dieser Zellen bei der Metastasierung zu demonstrieren, wurde das syngene (4T1) Modell des Brustkrebses in Verbindung mit der Depletion von Alveolarmakrophagen mit Clodronat-Liposomen verwendet.

Untersuchung der Rolle von Alveolarmakrophagen in Metastasierung von Brustkrebs

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau, um die Bildung und den Verschluss von Phagosomen in lebenden Makrophagen mit Hilfe der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie in drei Dimensionen zu visualisieren. Es ermöglicht die Überwachung der Basis des phagozytischen Bechers, der sich ausdehnenden Pseudopoden sowie der genauen Stelle der Phagosomenspaltung.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Hier beschreiben wir Methoden mit Spinning Disk konfokalen Mikroskopie zu Bild phagocytic Einzelveranstaltungen durch Maus resident peritonealen Makrophagen. Die Protokolle können auf andere phagocytic Zellen ausgedehnt werden.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Efferocytosis, die phagocytic Entfernung der Apoptotic Zellen ist erforderlich, um die Homöostase und wird erleichtert durch die Rezeptoren und Signalwege, die für die Anerkennung, Engulfment und Internalisierung der Apoptotic Zellen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll für die Quantifizierung des Efferocytosis und die Aktivität der Efferocytic Signalwege.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Makrophagen-phagozytische Aktivität gegen Krebszellen, insbesondere 4T1 Maus-Mammakarzinom-Zellen, wurde in dieser Studie abgebildet. Das Modell der Kokultur von Lebenden Zellen wurde mit einer Kombination aus fluoreszierender und differentialer Interferenzkontrastmikroskopie erstellt und beobachtet. Diese Bewertung wurde mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware zur Entwicklung von Multipoint-Zeitraffervideos abget/die sich erstellt haben.

Time-Lapse 2D Imaging der phagozytischen Aktivität in M1 Macrophage-4T1 Maus-Mammary Karzinom-Zellen in Kokulturen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die intravitale Bildgebung einer abgeschwächten, BSL-2-zugelassenen Mycobacterium tuberculosis. Spannung in der Mauslunge unter Verwendung eines permanenten Lungenfensters. Dieser Ansatz ermöglicht eine longitudinale, einzelzellige Auflösungsanalyse früher Wirts-Pathogen-Interaktionen, einschließlich bacillärer Lokalisation, vaskulärer Dynamik und Makrophagenaufnahme innerhalb derselben Lungenmikroumgebung.

Intravitale Bildgebung der abgeschwächten auxotrophen Mycobacterium tuberculosis in der Mauslunge während früher intravaskulärer Infektion

National Taiwan University Hospital.  This protocol describes a time-lapse live-cell imaging method to visualize antibody-dependent macrophage phagocytosis of green fluorescent protein–labeled triple-negative breast cancer cells using peripheral blood mononuclear cell–derived macrophages and an automated microscope.

Zeitraffer-Bildgebung der antikörpergesteuerten Phagozytose von grün fluoreszenzproteinmarkierten triple-negativen Brustkrebszellen durch Makrophagen

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