Mikroinjektion von Interleukin-6 in den Blutkreislauf der TSC-Zebrafischlarven zur Untersuchung neuropsychiatrischer störungsähnlicher Verhaltensweisen

Meine Forschung untersucht, wie durch IL-6 ausgelöste Entzündungen mit genetischen Risikomutationen für Autismus interagieren, um die Gehirnentwicklung und -funktion zu beeinflussen. Im Gegensatz zu der breiten, durch LPS ausgelösten Entzündung ermöglicht dieses Protokoll eine gezielte Erhöhung von IL-6, wodurch die spezifischen neurodevelopmentalen Wirkungen dieses Zytokins präzise untersucht werden können. Zunächst sammeln Sie die Mikroinjektionsnadeln, die benötigten Reagenzien und zweitags postbefruchtete Zebrafischeier.

Stellen Sie eine 1 %ige (Gewicht pro Volumen) Agarose-Lösung in E3-Medium her und erhitzen Sie sie, bis die Agarose vollständig gelöst ist und die Lösung klar wird. Lassen Sie die Agarose-Lösung kurz abkühlen. Gießen Sie etwa 30 Milliliter in eine 100 Millimeter große Petrischale, um eine gleichmäßige Schicht über die gesamte Oberfläche zu gewährleisten.

Während das Agarose noch flüssig ist, aber bereits beginnt zu erstarren, legen Sie vorsichtig eine Silikonform auf die Oberfläche, um gleichmäßige Rillen zu erzeugen. Überführen Sie etwa 100 chorionierte Embryonen zwei Tage nach der Befruchtung in eine kleine, mit Agarose beschichtete 50-Millimeter-Petri-Schale. Geben Sie vier Milliliter frisch zubereitete Pronase-Lösung in die Schale, wobei sichergestellt werden muss, dass die Embryonen vollständig untergetaucht sind.

Bei Raumtemperatur drei bis fünf Minuten inkubieren. Unter einem Stereomikroskop die Freisetzung der Embryonen aus den Chorionen beobachten. Die Petrischale intermittierend vorsichtig rotieren oder schwenken, um die enzymatische Entfernung der Chorionen zu erleichtern.

Fortsetzen, bis die Mehrheit der Embryonen aus ihren Chorionen freigesetzt ist. Die Embryonen gründlich waschen, indem sie durch fünf bis sechs Wechsel frisches E3-Embryomedium überführt werden. Sicherstellen, dass alle Chorionen und Pronase-Rückstände entfernt sind, um Schäden an den Larven zu vermeiden und optimale Kulturbedingungen aufrechtzuerhalten.

Überführen Sie mit einer Glas-Pasteur-Pipette etwa 50 dechorionierte Larven in eine 100 Millimeter große Petrischale, die 40 Milliliter E3-Medium enthält. Bewahren Sie die Larven bis zur Mikroinjektion im E3-Medium auf. Brechen Sie unter einem Stereomikroskop mit feiner Pinzette vorsichtig die Spitze der zuvor vorbereiteten Glas-Kapillare ab, um eine Mikropipette mit einer Öffnung von etwa drei Mikrometern Durchmesser zu erzeugen.

Stellen Sie eine Natriumchloridlösung mit 0,9 % Gewicht pro Volumen für Kontrollinjektionen her. Und eine Lösung mit zwei Pikogramm pro Nanoliter Interleukin 6 oder IL-6 in 0,9 % Natriumchlorid für die IL-6-Injektionen. Geben Sie ein Mikroliter 0,05 % Trypanblau zu jeweils 10 Mikrolitern Injektionslösung hinzu, um die Sichtbarmachung während der Injektion zu erleichtern.

Mit einer Pipette die Lösung in eine Mikrolader-Spitze aufnehmen. Anschließend die vorbereitete Mikropipetten-Injektionsnadel mithilfe der Mikrolader-Spitze mit etwa drei Mikrolitern der Injektionslösung rückwärts befüllen, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden. Die beladene Injektionsnadel sicher in der Kapillarhalterung befestigen, die mit dem Mikroinjektionssystem verbunden wird.

Bringen Sie dann einen kleinen Tropfen Mineralöl auf einen Kalibrierungsschlitten auf. Kalibrieren Sie das Injektionsvolumen, indem Sie Tropfen in das Mineralöl ausstoßen. Messen Sie den Tropfendurchmesser mithilfe des Kalibrierungsschlittens mit einer 0,01-Millimeter-Skala.

Stellen Sie den Injektionsdruck so ein, dass ein Tröpfchen mit einem Volumen von etwa einem Nanoliter entsteht. Betäuben Sie die Larven in kleinen Portionen, indem Sie Tricain dem E3-Medium in einer endgültigen 1X-Konzentration hinzufügen, um Stress zu minimieren und eine gleichmäßige Sedierung sicherzustellen. Überführen Sie einzelne zwei Tage nach der Befruchtung stammende Larven auf eine verfestigte Agarose-Injektionsplatte.

Platzieren Sie die Petrischale unter dem Stereomikroskop. Orientieren Sie jedes Larvenexemplar vorsichtig mit einer Glaspipette, sodass der Ductus Cuvieri deutlich sichtbar und zugänglich ist. Positionieren Sie die Mikropipettenspitze am Eintrittspunkt des Ductus Cuvieri, indem Sie die sich in Richtung Herz bewegenden Blutzellen unter dem Stereomikroskop verfolgen.

Spritzen Sie die erste Tröpfchen der vorbereiteten Lösung in den Ductus Cuvieri. Spritzen Sie nach etwa 20 Sekunden ein zweites Tröpfchen in den Ductus Cuvieri. Überführen Sie die Larven nach der Injektion vorsichtig in eine frische 100 Millimeter große Petrischale, die 40 Milliliter E3-Medium enthält.

Bringen Sie die Larven zur Erholung in einen Inkubator bei 28,5 Grad Celsius zurück. Am folgenden Tag wiederholen Sie das Mikroinjektionsverfahren wie zuvor gezeigt. Verwenden Sie die Larven fünf Tage nach der Befruchtung für nachgeschaltete Anwendungen, einschließlich Verhaltensassays, Gehirnbildgebung oder Immunfluoreszenzanalysen.

Die Mikroinjektion von IL-6 beeinträchtigte die Larvenviabilität im Vergleich zu Natriumchlorid-Injektionen nicht. Die Überlebensraten fünf Tage nach der Befruchtung unterschieden sich nicht zwischen den mit IL-6 und den mit NaCl injizierten Gruppen, was darauf hindeutet, dass das Dosierungsregime gut vertragen wird und keine unspezifische Toxizität verursacht. Mikroinjektionen verringerten die Viabilität leicht im Vergleich zu nicht injizierten Geschwistern.

Die homozygoten Tuberösen Sklerose-Komplex-2- oder TSC2-Mutanten wiesen signifikant höhere Basalwerte an Prostaglandin E2 oder PGE2 auf als ihre Wildtyp-Geschwister. Heterozygote TSC2-Mutanten zeigten im Vergleich zu Wildtyp-Geschwistern einen geringfügigen, nicht signifikanten Anstieg der Basalwerte von PGE2. Die PGE2-Spiegel stiegen bei heterozygoten TSC2-Mutanten nach Mikroinjektion von IL-6 stark an.

Der Open-Field-Test zeigte, dass TSC2-Mutanten im Vergleich zu wildtypischen Geschwistern in nicht injizierten Kontrollen ein erhöhtes angstähnliches Verhalten aufwiesen, und IL-6-Mikroinjektionen beeinflussten dieses Verhalten nicht. Sowohl heterozygote als auch homozygote TSC2-Mutanten verbrachten in nicht injizierten Kontrollen sowie bei IL-6-injizierten TSC2-Larven signifikant mehr Zeit in der äußeren Zone der Versuchsarena und zeigten eine verminderte Erkundung des Zentrums im Vergleich zu wildtypischen Geschwistern. IL-6-Injektionen verstärkten repetitive, stereotype Schwimmverhaltensmuster, insbesondere bei heterozygoten TSC2-Mutanten.

Der Anteil an IL-6-injizierten heterozygoten TSC2-Mutanten, die wiederholtes Looping zeigten, war im Vergleich zu Natriumchlorid-injizierten Kontrollen signifikant erhöht. Dieses Protokoll ermöglicht kontrollierte Untersuchungen zur IL-6-bedingten Entzündung, um Gen-Umwelt-Interaktionen bei der neurologischen Entwicklung und dem Verhalten von Zebrafischen zu bewerten. Wichtige Aspekte bei der Durchführung dieses Protokolls sind eine konsistente Nadelgröße, ein genaues Injektionsvolumen von zwei Nanolitern und die Minimierung der Zeit der Larven außerhalb des E3-Mediums. Künftige Studien können untersuchen, wie IL-6-bedingte Entzündungen und genetische Risikofaktoren gemeinsam die Gehirnentwicklung und das Verhalten beeinflussen.