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Nichtübertragbare chronische Krankheiten – Nationales Wissenschafts- und Technologiemajorprojekt (Nr. 2023ZD0516500), Finanzierung für klinische Forschung an Hochschulen auf höchstem Niveau (2026-PUMCH-A-103) und CMB-Programm für offene Wettbewerbe (24-561) sowie Programm zur Förderung des wissenschaftlichen Nachwuchses am Peking Union Medical College Hospital (Nr. UGG11571).

Alle Proben wurden im Rahmen eines Protokolls erhoben, das vom Ethikprüfungsausschuss des Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, genehmigt wurde (Genehmigungsnummer I-24PJ1778). Von jedem Teilnehmer oder dessen gesetzlich bevollmächtigten Vertreter wurde vor der Probensammlung eine schriftliche informierte Einwilligung eingeholt. Die Zielpathogen-Panel- und Reaktionsmulden-Zuordnungen sind in Tabelle 1 aufgeführt, und die Verbrauchsmaterialien, die während der Probenvorverarbeitung verwendet wurden, sind in Tabelle 2 aufgelistet.
1. Sammlung klinischer Proben aus dem unteren Respirationstrakt auf der Intensivstation
<ol>
	<li>Sputum-Sammlung
	<ol>
		<li>Spülen Sie die Mundhöhle dreimal mit sauberem Wasser oder steriler physiologischer Kochsalzlösung aus, um Speisereste und muköse orale Flora zu entfernen.</li>
		<li>Weisen Sie den Patienten an, zwei bis drei tiefe Atemzüge zu nehmen und anschließend kräftig zu husten, um tiefen Atemwegs-Sputum direkt in einen sterilen Sammelbehälter auszuhusten. 
		HINWEIS: Ein geeignetes Probenmaterial besteht aus zähflüssigem, eitrigem oder blutverschmiertem Material aus unterhalb der Trachea; klarer Speichel oder postnasaler Abfluss sind unzureichend und können die nachfolgende Detektion beeinträchtigen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Brachialaspirat (BAS)-Sammlung
	<ol>
		<li>Bei nicht intubierten Patienten wird ein steriler Absaugkatheter (ein 10–12 Fr-Katheter, angeschlossen an eine Absaugquelle mit einem Druck von −0,0267 MPa, äquivalent zu −200 mmHg) über nasalen oder oralen Zugang bis zu einer Tiefe von etwa 30 cm eingeführt.</li>
		<li>Während der Katheter langsam zurückgezogen wird, Absaugung unter gleichzeitigem Drehen des Katheters durchführen. Die aspirierten Sekrete in einer sterilen Sammelfalle sammeln. 
		HINWEIS: Falls nur geringe Sekretmengen vorhanden sind, vor der Absaugung etwa 5 mL sterile Kochsalzlösung über den Katheter zugeben.</li>
		<li>Bei mechanisch beatmeten Patienten wählen Sie den Absaugkatheter entsprechend der Größe des endotrachealen Tubus: Verwenden Sie einen 10 Fr-Katheter für einen 7,0–7,5 mm Tubus und einen 12 Fr-Katheter für einen 8,0 mm Tubus.</li>
		<li>Bevor Sie absaugen, hyperoxygenieren Sie den Patienten 30–60 Sekunden lang mit 100 % Sauerstoff. Trennen Sie den Beatmungsschlauchkreislauf und führen Sie den ausgewählten Katheter über die künstliche Atemwegsöffnung ein, bis ein Widerstand spürbar ist.</li>
		<li>Wenden Sie einen Unterdruck von −0,0267 MPa (äquivalent zu −200 mmHg) an und begrenzen Sie jeden Absaugvorgang – und damit die Dauer der Beatmungspause – auf maximal 15 Sekunden, um eine Derekrutierung und Hypoxämie zu minimieren. Hyperoxygenieren Sie den Patienten anschließend erneut 30–60 Sekunden lang mit 100 % Sauerstoff.</li>
		<li>Geben Sie 1–2 mL sterile Kochsalzlösung über den Katheter zu und warten Sie 3 Sekunden.</li>
		<li>Führen Sie die Absaugung durch und ziehen Sie den Katheter zurück. Sammeln Sie die aspirierten Sekrete in einer sterilen Sammelfalle. Schließen Sie den Beatmungsschlauchkreislauf unmittelbar nach der Probengewinnung wieder an. 
		HINWEIS: Es ist unbedingt erforderlich, während des gesamten Vorgangs eine strenge aseptische Technik anzuwenden, um nosokomiale Kontamination der Probe zu vermeiden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sammlung von Bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF)
	<ol>
		<li>Identifizieren Sie das Zielsegment anhand der Thoraxbildgebung. Führen Sie das Bronchoskop vor und blockieren Sie es im entsprechenden segmentalen oder subsegmentalen Bronchus.</li>
		<li>Geben Sie rasch Portionen von 20–50 mL steriler Kochsalzlösung zu, insgesamt 3–5 Portionen (60–120 mL insgesamt). Führen Sie nach jeder Portion eine sanfte Absaugung durch und sammeln Sie die zurückgewonnene Flüssigkeit in einem sterilen, verschlossenen Behälter. 
		WARNHINWEIS: Während der BAL muss bei Intensivpatienten eine kontinuierliche hämodynamische und ventilatorische Überwachung erfolgen. Passen Sie die Beatmungseinstellungen bei mechanisch beatmeten Patienten entsprechend an. 
		HINWEIS: Die typische Rückgewinnungsrate beträgt 40–60 % des applizierten Volumens. Eine geringe Rückflussmenge kann eine Neupositionierung der Bronchoskopt Spitze erforderlich machen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Verflüssigung und Lyse von Krankheitserregern
<ol>
	<li>Aspirieren Sie mit der Einwegpipette #2 die Probe bis zur Markierungslinie (ca. 1 mL) und geben Sie sie in das Verflüssigungsgefäß. Drücken Sie den Pipettenbalg mehrmals, um sämtliches viskoses Material zu überführen, und verschließen Sie anschließend das Gefäß. 
	ANMERKUNG: Bei BALF oder wässrigem Sputum zwei Pipettenvolumina aufnehmen, um eine ausreichende Pathogenmenge sicherzustellen.</li>
	<li>Schütteln Sie das Verflüssigungsgefäß kräftig von Hand für 1 Minute. Prüfen Sie die Probe visuell und setzen Sie das Schütteln fort, bis keine sichtbaren Schleimklumpen mehr vorhanden sind und die Probe ungehindert durch die Einwegpipette #1 fließt (einheitliche, wasserähnliche Konsistenz). Schütteln Sie mindestens 1 Minute lang, und verlängern Sie die Zeit bei stark viskosen Proben nach Bedarf, bis diese Kriterien erfüllt sind.</li>
	<li>Öffnen Sie die Verschlusskappe des Lysegefäßes.</li>
	<li>Aspirieren Sie mit der Einwegpipette #1 etwa 0,5 mL der homogenisierten Probe und geben Sie diese in das Lysegefäß.</li>
	<li>Schließen Sie die Verschlusskappe und vergewissern Sie sich, dass die Spitzenkappe fest angezogen ist.</li>
	<li>Setzen Sie das Lysegefäß in das Probenvorverarbeitungsgerät (SP-Gerät) ein, indem Sie es nach unten drücken, bis es sicher sitzt. Drücken Sie auf Start.</li>
	<li>Lassen Sie das SP-Gerät den automatisierten Verflüssigungs-Lyse-Zyklus (Parameter in Tabelle 3) abschließen, der etwa 15 Minuten dauert. 
	ANMERKUNG: Öffnen oder entfernen Sie das Gefäß während der Bearbeitung nicht.</li>
</ol>
3. Chip-Beladung und automatische Detektion
<ol>
	<li>Reagenz- und Probenzugabe
	<ol>
		<li>Nehmen Sie den CD-Chip aus der Lagerung bei 4 °C und lassen Sie ihn 10 min bei Raumtemperatur (ca. 25 °C) akklimatisieren. 
		&#8203;HINWEIS: Die Reagenzgefäße O und B sowie das vorverarbeitete Lysat werden bei Raumtemperatur verwendet; die LAMP-Amplifikation auf dem Chip erfolgt bei 65 °C (siehe Schritt 3.2.3 und Tabelle 3).</li>
		<li>Öffnen Sie die Folienverpackung und legen Sie den Chip auf eine ebene Fläche.</li>
		<li>Drehen Sie die Kappe gegen den Uhrzeigersinn, um den Chip zu öffnen.</li>
		<li>Klopfen Sie leicht gegen das Gefäß O, um die Flüssigkeit am Boden des Gefäßes zu sammeln.</li>
		<li>Entfernen Sie die Kappe von Gefäß O, führen Sie die Düse in die O-Öffnung ein und geben Sie den gesamten Inhalt in die Öffnung ab.</li>
		<li>Entsorgen Sie Gefäß O. Wiederholen Sie den Vorgang mit Gefäß B und der B-Öffnung.</li>
		<li>Entnehmen Sie das aufgearbeitete Lysegefäß aus dem SP-Gerät und entfernen Sie die Spitzenkappe.</li>
		<li>Richten Sie die Gefäßspitze an der S-Öffnung aus und geben Sie das gesamte Volumen des Lysats in den Chip ab.</li>
		<li>Entsorgen Sie das verwendete Lysegefäß.</li>
		<li>Drehen Sie die Chipkappe im Uhrzeigersinn, bis zwei hörbare Klicks eine vollständige Versiegelung bestätigen. 
		HINWEIS: Eine unvollständige Befüllung einer beliebigen Öffnung kann zu Ausfällen einzelner Kanäle führen. Stellen Sie vor dem Versiegeln sicher, dass die Abgabe vollständig erfolgt ist. Um unvollständige Versiegelung und Kontaminationsrisiken zu vermeiden, tragen Sie beim Verschließen der Kappe keine PE-Handschuhe; Latex- oder Nitrilhandschuhe werden stattdessen empfohlen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Betrieb des Geräts
	<ol>
		<li>Schalten Sie den automatisierten Nukleinsäureanalysator ein. Tippen Sie auf Erkennen, scannen Sie den Barcode auf der Chip-Folienverpackung und geben Sie die Patientendaten und die Proben-ID ein.</li>
		<li>Setzen Sie den Chip auf die Drehspindel und drücken Sie nach unten, bis ein Klicken die Verriegelung bestätigt.</li>
		<li>Tippen Sie auf Start. Das Gerät führt autonom die zentrifugale Reagenzverteilung, die magnetische Bead-Extraktion, die LAMP-Amplifikation bei 65 °C und die Fluoreszenzdetektion durch. Die Laufzeit beträgt ca. 45 min (die Reagenz-/Probenzugabe und der instrumentelle Arbeitsablauf sind in Abbildung 3 zusammengefasst). 
		HINWEIS: Öffnen Sie den Deckel während des Laufs nicht.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Auswertung der Ergebnisse
	<ol>
		<li>Die Software ermittelt den Wendepunkt jeder s-förmigen Amplifikationskurve durch Analyse des Maximums der zweiten Ableitung und gibt den entsprechenden TP-Wert (Zeit bis zur Positivität) an.</li>
		<li>Vergleichen Sie jeden TP-Wert mit dem entsprechenden Schwellenwert in Tabelle 4. Stufen Sie Kanäle mit TP-Werten unterhalb oder gleich dem Schwellenwert als positiv ein und Kanäle mit TP-Werten oberhalb des Schwellenwerts als negativ.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass der interne Kontrollkanal (Wanne 16) eine s-förmige Amplifikationskurve mit einem TP-Wert unter 12 min aufweist.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Lauf, wenn die interne Kontrolle fehlschlägt. Wiederholen Sie den Test mit einem neuen Chip oder entnehmen Sie die Probe erneut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990&#8211;2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect Dis. 2018;18(11):1191-1210.</li>
	<li>Niederman MS, Torres A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220150.</li>
	<li>Weiser JN, Ferreira DM, Paton JC. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 2018;16(6):355-367.</li>
	<li>Reynolds D et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: another pandemic. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220068.</li>
	<li>Schauwvlieghe AFAD et al. Invasive aspergillosis in patients admitted to the intensive care unit with severe influenza: a retrospective cohort study. Lancet Respir Med. 2018;6(10):782-792.</li>
	<li>Meersseman W et al. Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid: a tool for diagnosing aspergillosis in intensive care unit patients. Am J Respir Crit Care Med. 2008;177(1):27-34.</li>
	<li>Seymour CW et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 2017;376(23):2235-2244.</li>
	<li>Noviello S, Huang DB. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 2019;9(2):37.</li>
	<li>Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019;20(6):341-355.</li>
	<li>Hanson KE et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: clinical and diagnostic recommendations from the IDSA&#39;s diagnostics committee. Clin Infect Dis. 2020;71(10):2744-2751.</li>
	<li>Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.</li>
	<li>Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells. 2021;10(8):1931.</li>
	<li>Parida M et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008;18(6):407-421.</li>
	<li>Ou H et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 2021;10(10):11053-11066.</li>
	<li>Lai JX et al. Rapid detection of bacterial pathogens causing lower respiratory tract infections via microfluidic-chip-based loop-mediated isothermal amplification. J Vis Exp. 2024;(205):e66677.</li>
</ol>

Die Autoren geben keine Wettbewerbsinteressen an.

Die schnelle Identifizierung von Krankheitserregern ist entscheidend für das Infektionsmanagement auf Intensivstationen. Das hier beschriebene System verkürzt die Zeit bis zur Identifizierung des Erregers von den üblicherweise für Kulturen erforderlichen 3 bis 5 Tagen auf weniger als 1 Stunde, also auf einen Zeitraum, in dem häufig bereits Entscheidungen über antimikrobielle Erstlinientherapien getroffen werden7. Durch die Integration der Nukleinsäure-Extraktion, -Reinigung und der 16-fachen LAMP-Amplifikation auf einem einzigen geschlossenen Chip entfällt der manuelle DNA-Extraktionsschritt, der bisher das wesentliche betriebliche Engpass bei früheren LAMP-Chip-Plattformen darstellte15. Das Ergebnis ist ein einziger Ladevorgang, der von Personal ohne spezielle Schulung in Molekularbiologie durchgeführt werden kann.
Mehrere prozedurale Aspekte erfordern besondere Aufmerksamkeit. Die Probengüte ist entscheidend. Tiefe Atemwegsproben, wie Bronchialaspirat oder Bronchoalveolärlavageflüssigkeit, sind bei beatmeten Patienten dem ausgeworfenen Sputum vorzuziehen, da eine oropharyngeale Kontamination bei diesen das Signal des eigentlichen Erregers überlagern kann. Eine unvollständige Verflüssigung ist die häufigste Ursache für eine suboptimale Lyse; das manuelle Schütteln sollte daher so lange fortgesetzt werden, bis die Probe eindeutig eine wässrige Konsistenz erreicht hat. Während des Beladens des Chips kann das unvollständige Entleeren entweder des Reagenzglases oder des Lyserohrs bewirken, dass den nachgeschalteten Vertiefungen das erforderliche Ausgangsmaterial fehlt, was zu kanalspezifischen Fehlschlägen führen kann, die fälschlicherweise als negative Ergebnisse interpretiert werden. Zudem ist das zweistufige Schließen der Chipkappe nicht nur eine mechanische Funktion; es ist notwendig, um den geschlossenen Kopfraum aufrechtzuerhalten, der für die isotherme Amplifikation erforderlich ist, und um Verdunstungsverluste zu verhindern.
Die Fehlersuche ist relativ einfach. Stark viskoses ICU-Sputum erfordert möglicherweise ein manuelles Schütteln über einen längeren Zeitraum als die empfohlene Dauer von 1 Minute. Verdünnte Proben, insbesondere Bronchoalveoläres Lavagefluid, erfordern möglicherweise die doppelte standardmäßige Pipettiermenge, um eine geringere Pathogendichte auszugleichen. Das Versagen der internen Kontrolle, definiert als Fehlen einer S-förmigen Amplifikationskurve oder ein TP-Wert von mehr als 12 Minuten, weist entweder auf unzureichende Zellulärität der Probe oder auf eine Fluidikstörung innerhalb des Chips hin. In solchen Fällen ist die angemessene Maßnahme, eine neue Probe zu entnehmen oder die Untersuchung mit einem neuen Chip zu wiederholen, anstatt einzelne Kanäle neu zu interpretieren.
Diese Methode weist jedoch auch wichtige Einschränkungen auf. Das Panel ist auf 15 vordefinierte Zielstrukturen beschränkt, und Organismen außerhalb dieser Liste, einschließlich vieler antimikrobieller Resistenzdeterminanten, können nicht nachgewiesen werden. Jeder Primeransatz zielt auf einen konservierten, artenspezifischen Bereich des jeweiligen Organismus ab, mit Ausnahme des gattungsspezifischen Aspergillus-Assays; daher werden Arten oder Stämme, die im Panel nicht vertreten sind, nicht detektiert, und intraspezifische Variationen auf Stamm-Ebene werden vom Panel nicht erfasst. Da jede der 16 Vertiefungen einen spezifischen lyophilisierten Primeransatz enthält, ist das Panel modular aufgebaut und kann in zukünftigen Versionen umkonfiguriert werden, um zusätzliche Zielstrukturen aufzunehmen.
Das Testergebnis ist qualitativ. Obwohl die TP-Werte eine lose Beziehung zur Pathogenlast aufweisen können, können sie quantitative Kulturergebnisse oder auf Zyklusschwellenwerten basierende PCR-Schätzungen nicht ersetzen. Wie bei jedem Nukleinsäureamplifikationstest, der an Atemwegsproben durchgeführt wird, kann der Assay allein keine Unterscheidung zwischen Besiedlung und echter Infektion treffen. Die klinische Interpretation muss daher die Chip-Ergebnisse mit entzündungsmarker wie C-reaktivem Protein und Procalcitonin, bildgebenden Befunden, Pilz-Biomarkern wie Galaktomannan und (1,3)-β-D-Glucan sowie dem gesamten klinischen Verlauf kombinieren. Zudem liefert das System keine Daten zur antimikrobiellen Empfindlichkeit, und die konventionelle Kultur bleibt für diesen Zweck unverzichtbar.
Abschließend wurden alle in dieser Studie enthaltenen Proben aus einer einzigen Intensivstation der Tertiärversorgung gewonnen, und die Prävalenz von Krankheitserregern sowie Muster von Co-Infektionen können zwischen verschiedenen Einrichtungen und Patientenpopulationen variieren. Die vorliegende Arbeit sollte daher als Pilotstudie verstanden werden, die den Nachweis des Konzepts an einem kleinen, gezielt ausgewählten Satz repräsentativer Proben demonstriert; sie war nicht darauf ausgelegt, die diagnostische Genauigkeit zu ermitteln. Die klinische Sensitivität und Spezifität pro Ziel sowie die systematische Übereinstimmung mit der konventionellen Kultur und der metagenomischen Next-Generation-Sequenzierung (mNGS) werden in einer geplanten prospektiven, multizentrischen Studie mit konsekutiv rekrutierten Teilnehmern etabliert.
Als erste Maßnahme zur Beurteilung der analytischen Leistungsfähigkeit wurde die Nachweisgrenze (LoD) für jedes Ziel mittels digitaler PCR-quantifizierter genomischer Nukleinsäure bestimmt, die in eine negative Matrix aus Bronchoalveolärflüssigkeit eingefügt wurde. Die Proben wurden seriell verdünnt und in dreifacher Ausführung getestet. Die LoD wurde als die niedrigste Konzentration definiert, die in mindestens 95 % der Wiederholungen nachgewiesen wurde. Die ermittelten LoD-Werte lagen je nach Nachweis zwischen 1.000 und 4.000 Kopien/mL (Tabelle 7). Da in dieser Pilotstudie keine quantitativen Angaben auf Basis von Koloniezählungen für die einzelnen Organismen verfügbar waren, werden diese LoD-Schätzungen in zukünftigen Arbeiten mit formal aufgezählten Referenzstämmen präzisiert.
Der Vergleich mit bestehenden diagnostischen Ansätzen verdeutlicht weiter die Stellung dieser Plattform. Die konventionelle Kultur ist zwar langsam, bleibt aber der Referenzstandard und liefert Informationen zur Empfindlichkeit. Die metagenomische Sequenzierung der nächsten Generation bietet eine deutlich umfassendere Abdeckung von Organismen, ist jedoch mit erheblich höheren Kosten, längeren Durchlaufzeiten (typischerweise 24–48 h) und einem Bioinformatikaufwand verbunden, den viele Intensivstationen vor Ort nicht bewältigen können9. Standardisierte multiplex PCR-Panels verkürzen die Zeit bis zum Ergebnis, erfordern aber in der Regel weiterhin eine separate Nukleinsäure-Extraktion und je nach Plattform eine Batch-Verarbeitung, die zusätzliche Verzögerungen verursachen kann10.
Aus Kostensicht, obwohl eine formale Kosten-Nutzen-Analyse außerhalb des Rahmens dieser Pilotstudie lag, adressiert die Plattform die wichtigsten realen Kostenfaktoren auf der Intensivstation, einschließlich Kultur und konventioneller oder multiplexer PCR (ein qualitativer Vergleich der Methoden ist in Tabelle 8 dargestellt). Sie liefert Ergebnisse innerhalb von etwa 1 h, verglichen mit 2–5 Tagen bei Sputumkultur, 4–8 h bei konventioneller PCR (die in der Regel eine Batch-Verarbeitung erfordert) und &gt;24 h bei metagenomischem Sequenzieren. Da der Workflow vollständig integriert ist („sample-in, result-out“), ist nur ein einziger manueller Ladeschritt erforderlich, es ist keine separate Nukleinsäure-Extraktion nötig, die Durchführung ist am Bettplatz ohne spezialisiertes bakteriologisches oder molekularbiologisches Labor sowie ohne Fachpersonal aus dem Bereich der Molekularbiologie möglich, und es wird eine geschlossene Einweg-Kassette verwendet, wodurch kontaminationsbedingte Wiederholungstests reduziert werden. Auch die Gerätekosten sind gering, da weder ein Echtzeit-PCR-Gerät noch eine Sequenzierplattform benötigt werden. Für schwer kranke Intensivpatienten könnte diese schnelle Durchlaufzeit die Dauer einer unangemessenen empirischen Therapie verkürzen und den Krankenhausaufenthalt verkürzen, was einen indirekten, aber möglicherweise erheblichen Kostenvorteil darstellt.
Das vorliegende System nimmt eine eindeutig abgegrenzte Nische ein, die durch schnelle Durchlaufzeiten, einfache Handhabung und die biosichere geschlossene Kartusche definiert ist, Eigenschaften, die gemeinsam eine Anwendung am Krankenbett ermöglichen. Die Einbeziehung von drei Pilzzielen ist eine besonders wichtige Eigenschaft. Aspergillus-Arten wurden in 5 der 10 Proben nachgewiesen (TP-Bereich: 5,5–8 min). Angesichts der bekannten Grenzen der Kultur und des engen diagnostischen Zeitfensters der Galaktomannan-Testung für Aspergillus5,6 könnte ein molekularer Nachweis innerhalb von 45 Minuten eine frühzeitige Einleitung einer gezielten antifungalen Therapie ermöglichen, obwohl der klinische Nutzen dieses früheren Nachweises in prospektiven Studien noch belegt werden muss.
Mehrere zukünftige Entwicklungen liegen auf der Hand. Die Erweiterung des Panels, um zumindest wichtige Resistenzdeterminanten wie Carbapenemase-Gene und mecA einzuschließen, würde dazu beitragen, die Lücke zwischen der Pathogenerkennung und der empirischen antimikrobiellen Therapiewahl zu schließen. Darüber hinaus könnten maschinelle Lernmodelle, die auf gepaarten Amplifikationsprofilen und klinischen Metadaten trainiert sind, mit wachsendem Umfang der TP-Datensätze langfristig helfen, eine Kolonisation von einer echten Infektion zu unterscheiden, obwohl solche Anwendungen eine sorgfältige prospektive Validierung erfordern werden. Allgemeiner formuliert wird eine multizentrische Evaluation über geografisch unterschiedliche Intensivpatientenpopulationen notwendig sein, bevor die diagnostische Leistungsfähigkeit dieser Plattform als verallgemeinerbar angesehen werden kann.

Bei kritisch kranken Patienten auf der Intensivstation sind Infektionen der unteren Atemwege, wobei die beatmungsassoziierte Pneumonie (VAP) die häufigste Form darstellt, nach wie vor eine anhaltende Ursache für Morbidität, verlängerte mechanische Beatmung und erhöhte Letalität1,4. Das mikrobiologische Spektrum von auf der Intensivstation erworbenen Infektionen der unteren Atemwege (LRTIs) unterscheidet sich deutlich von dem bei ambulant erworbenen Erkrankungen. Multiresistente gramnegative Erreger (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii) dominieren, oft in polymikrobiellen Konstellationen, die eine empirische Therapie erschweren3,4. Opportunistische Pilze tragen eine zusätzliche Komplexitätsebene bei. Die invasive pulmonale Aspergillose, die einst als Kennzeichen starker Immunsuppression galt, wird heute zunehmend auch bei nicht-neutropenischen Intensivpatienten diagnostiziert, insbesondere nach schwerer Influenza und COVID-195. Bestehende diagnostische Algorithmen zur Aspergillose kombinieren kulturabhängige Verfahren mit geringer Ausbeute und die Antigentestung auf Galaktomannan (GM). Der GM-Assay ist jedoch durch gut dokumentierte diagnostische Zeitfenster und variable Sensitivität bei nicht-neutropenischen Wirtsorganismen eingeschränkt6. Jede Stunde Verzögerung bei der Einleitung einer geeigneten antimikrobiellen Therapie bei Sepsis ist mit einer messbaren Erhöhung der Sterblichkeit verbunden7. Insgesamt erfordern die Geschwindigkeit und Komplexität von Intensivstationeninfektionen diagnostische Werkzeuge, die der klinischen Dringlichkeit gerecht werden.
Die klassische mikrobiologische Kultur ist zwar für die Empfindlichkeitstestung unverzichtbar, jedoch grundsätzlich zeitlich limitiert: Die Durchlaufzeit beträgt 3 bis 5 Tage, anspruchsvolle Organismen werden übersehen, und die Positivrate bei Pilzkulturen bleibt niedrig8. Die metagenomische Next-Generation-Sequenzierung (mNGS) bietet eine unvoreingenommene Alternative, doch ihre klinische Anwendung wird durch hohe Kosten, eine Bearbeitungsdauer von 24 bis 48 Stunden, die Abhängigkeit von Bioinformatik-Pipelines und die begrenzte Eignung für die Point-of-Care-Diagnostik eingeschränkt9. PCR-basierte Testpanels haben die Zeitspanne verkürzt, erfordern jedoch weiterhin mehrstufige Nukleinsäure-Extraktion, thermocyclerbasierte Geräte und – bei herkömmlichen Verfahren – eine elektrophoretische Analyse nach der Amplifikation10. Keine dieser Plattformen erfüllt vollständig die zusammenlaufenden Anforderungen auf der Intensivstation: eine Dauer von weniger als einer Stunde, minimale manuelle Bearbeitungszeit, multiplexfähige Abdeckung von Pathogenen einschließlich Pilzen und ausreichende Bedienbarkeit für nicht-laborerfahrene Personal.
Die LAMP-Methode (loop-vermittelte isothermale Amplifikation) behebt mehrere dieser Einschränkungen. Erstmals von Notomi et al. beschrieben, amplifiziert die Methode Ziel-DNA bei konstanten 65 °C unter Verwendung eines Satzes von vier bis sechs Primern, die sechs unterschiedliche Regionen erkennen, wobei eine Strangverdrängungs-Polymerase zum Einsatz kommt11. Die Reaktion erzeugt charakteristische Stamm-Schleifen- und blumenkohlartige Amplikonstrukturen, die mittels Echtzeit-Fluoreszenz nachweisbar sind und S-förmige Kurven ergeben, sobald die Schwelle überschritten wird, was innerhalb weniger Minuten geschieht. Die Empfindlichkeit bei niedrigen Matrizenkonzentrationen ist hoch, und das Mehrfachprimer-Design verleiht eine Selektivität, die falsch-positive Ergebnisse begrenzt12,13. In Kombination mit mikrofluidischen Chip-Plattformen kann LAMP parallelisiert werden, sodass mehrere Zielstrukturen aus einer einzigen Probenaufgabe analysiert werden14. Frühere Arbeiten zeigten, dass LAMP-Chip-Systeme Atemwegserreger mit einer Durchlaufzeit deutlich unter drei Stunden nachweisen können15. Eine wesentliche Einschränkung dieser Systeme ist jedoch ihre Abhängigkeit von einer separaten, manuellen DNA-Extraktion, die zusätzliche Zeit, betriebliche Komplexität und Kontaminationsrisiken mit sich bringt.
Das hier beschriebene System beseitigt diesen Engpass. Aufbauend auf einem Einweg-Mikrofluidik-Chip in Scheibenform (86 mm Durchmesser) integriert es Probenzugabe, die nukleinsäurebasierte Reinigung mittels magnetischer Beads und die 16-plex LAMP-Amplifikation in einer einzigen geschlossenen Kartusche (Abbildung 1). Der Bediener führt lediglich einen kurzen manuellen Liquefaktions-Lyse-Schritt mit einem speziell konzipierten Probengefäß durch und gibt anschließend das Lysat sowie zwei Reagenzienfläschchen auf den Chip (Abbildung 2). Ab diesem Zeitpunkt übernimmt das Gerät vollständig automatisch die Nukleinsäure-Extraktion, die isothermale Amplifikation bei 65 °C und die Fluoreszenzdetektion und liefert innerhalb von 45 Minuten qualitative Ergebnisse für 15 klinisch relevante Zielstrukturen, nämlich 11 Bakterien, 3 Pilze (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) und einen atypischen Erreger (Mycoplasma pneumoniae). Ein Gen der Neuroblastom-Breakpoint-Familie (NBPF), das als interne Kontrolle dient, überprüft in jedem Test die Probenqualität und die Reaktionsintegrität. Dieses Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für den gesamten Arbeitsablauf – von der Probenentnahme auf der Intensivstation über die Vorbehandlung, die Beladung des Chips, die automatisierte Detektion bis hin zur Ergebnisinterpretation – und richtet sich sowohl an Personal im klinischen Labor als auch an Teams an der Intensivbettseite.

<table><tbody><tr><td>Automatischer Nukleinsäure-Analysator</td><td>Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd</td><td>THE-T80-01</td><td>TurboFlow T; führt zentrifugale Reagenzverteilung, magnetische Bead-Extraktion, LAMP durch bei 65 &amp;deg;Cund Echtzeit-Fluoreszenznachweis (~45 min Laufzeit)</td></tr><tr><td>#1 Einweg-Pasteurpipette</td><td>Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)</td><td>Maßgefertigt</td><td>Einwegverbrauchsmaterial; 0,5 mL; überträgt homogenisiertes Probenmaterial in Lysepipette</td></tr><tr><td>#2 Einweg-Pasteurpipette</td><td>Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)</td><td>Maßgefertigt</td><td>Einwegverbrauchsmaterial; 2 mL; aspiriert Probe bis zur Markierungslinie in das Verflüssigungsrohr</td></tr><tr><td>CD-Chip</td><td>Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd</td><td>Maßgefertigt</td><td>Einwegverbrauchsmaterial; 86-mm-Scheibe mit zentralem Ladebereich (Anschlüsse O, B, S), Bereich für die Magnetkügelchen-Reinigung und äußerem Ring mit 16 Reaktionsgefäßen (15 Pathogen-Ziele + NBPF-Interner Kontrollbereich)</td></tr><tr><td>LAMP-Reaktionsreagenzien</td><td>Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td><td>16730ES80</td><td>LAMP-Reaktionsreagenzien als lyophilisierte Kügelchen in CD-Chip vorgelagert</td></tr><tr><td>Verflüssigungsgefäß</td><td>Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd</td><td>Maßgefertigt</td><td>Einwegverbrauchsmaterial; 2 mL/Röhrchen; dient zum Aufnehmen der Probe zur manuellen Homogenisierung</td></tr><tr><td>Lyseröhrchen</td><td>Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd</td><td>Maßgefertigt</td><td>Einwegverbrauchsmaterial; 0,5 mL/Röhrchen; komprimierbarer Silikonkörper mit 200 &amp;micro;m Filtermembran; vorbeladene Lysereagenzien</td></tr><tr><td>Primer</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td><td>Maßgefertigt</td><td>Primergemisch in der Reaktionskammer des CD-Chips eingebettet</td></tr><tr><td>Vorverarbeitungseinrichtung für Proben</td><td>Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd</td><td>THE-R10-02</td><td>TS-2000; automatisierte Verflüssigung&amp;ndash;Lysezyklus (~15 min)</td></tr><tr><td>Einmaldosisfläschchen &amp;ldquo;B&amp;rdquo;</td><td>Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd</td><td>Maßgefertigt</td><td>Einwegverbrauchsmaterial; vorverpacktes Reagenz auf Chip; je Test eines erforderlich; Lagerung bei 4 &amp;deg;C und auf Raumtemperatur (~25 &amp;deg;C) vor dem Beladen</td></tr><tr><td>Einmaldosisfläschchen &amp;ldquo;O&amp;rdquo;</td><td>Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd</td><td>Maßgefertigt</td><td>Einwegverbrauchsmaterial; vorverpacktes Reagenz auf Chip; je Test eines erforderlich; Lagerung bei 4 &amp;deg;C und auf Raumtemperatur (~25 &amp;deg;C) vor dem Beladen</td></tr></tbody></table>

schnelle point-of-care-detektion von pathogenen für infektionen der unteren atemwege bei intensivpatienten

Rapid Point-of-Care Detection of Pathogens for Lower Respiratory Tract Infections in ICU Patients

Untere Atemwegsinfektionen (LRTIs) gehören zu den häufigsten Ursachen für eine klinische Verschlechterung und den Tod bei schwerkranken Patienten. Auf der Intensivstation (ICU) ist die zeitnahe Identifizierung des verursachenden Erregers für eine angemessene antimikrobielle Therapie entscheidend; herkömmliche Kulturmethoden benötigen jedoch 3 bis 5 Tage und weisen insbesondere bei Pilzen suboptimale Nachweisraten auf. Molekulare Ansätze wie die PCR verkürzen die Durchlaufzeit, sind aber weiterhin auf manuelle Nukleinsäure-Extraktion und Thermocycling angewiesen, was ihre Eignung für den Einsatz am Bett reduziert. Dieses Protokoll beschreibt einen Point-of-Care-Arbeitsablauf, der auf einem vollständig integrierten, scheibenförmigen mikrofluidischen Chip (CD-Chip) basiert und die magnetkugelbasierte Nukleinsäure-Reinigung mit der LAMP-Technik (loop-mediated isothermal amplification) kombiniert. Nach einem vereinfachten manuellen Verflüssigungs- und Lysisschritt wird die aufbereitete Probe gemeinsam mit zwei vorgepackten Reagenzgefäßen auf den Chip aufgebracht. Das Gerät führt anschließend automatisch die Extraktion, die Amplifikation bei 65 °C und die Echtzeit-Fluoreszenzauswertung durch und liefert innerhalb von 45 Minuten qualitativen Nachweis für 15 Zielstrukturen, nämlich 11 Bakterien, 3 Pilze und einen atypischen Erreger (ca. 1 Stunde für den gesamten sample-to-answer-Arbeitsablauf einschließlich des manuellen Vorverarbeitungsschritts). Wir präsentieren Nachweisdaten aus 10 ICU-Proben, darunter Sputum, bronchiale Aspirate und Bronchoalveolärlavageflüssigkeit, mit sowohl Einzel- als auch polymikrobiellen Ko-Infektionen, bei denen bis zu 7 Organismen auf einem einzigen Chip nachgewiesen wurden. Das geschlossene Kartuschendesign minimiert das Risiko einer Aerosolkontamination, und der einstufige Ladevorgang erfordert keine spezielle Schulung, wodurch dieses System sich als praktisches diagnostisches Werkzeug am Bett für ICU-Teams eignet.

Dieses Protokoll beschreibt eine vollständig integrierte, chipbasierte Mikrofluidik-Methode unter Verwendung der LAMP-Technik, die den Nachweis von 15 Krankheitserregern, die bei auf der Intensivstation behandelten Patienten Infektionen der unteren Atemwege verursachen, innerhalb einer Stunde am Point-of-Care ermöglicht.

Schnelle Point-of-Care-Detektion von Pathogenen für Infektionen der unteren Atemwege bei Intensivpatienten

Infektionen der unteren Atemwege (Lower Respiratory Tract Infections, LRTIs) gehören zu den führenden Ursachen für klinische Verschlechterungen und Todesfälle bei kritisch kranken Patienten. Auf der Intensivstation ...

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Forschung

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Eine schnelle und genaue Point-of-Care-Test für invasiver pulmonaler Aspergillose wird vorgestellt. Es nutzt die Vorteile der Lateral-Flow-Technologie unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antikörper, der an ein...

Nachweis des invasiven Pulmonale Aspergillose bei malignen hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie

Eine integrierte Mikrofluidvorrichtung thermoplastischen Chip zur Verwendung als molekulare Diagnostik entwickelt. Der Chip führt Nukleinsäureextraktion, reverse Transkriptase und PCR. Methoden zur Herstellung und den Betrieb der Chip beschrieben.

Mikrofluidischen Chip Herstellung und Verfahren zur Influenza Detect

Hochdurchsatz-Untersuchung von DNA und RNA basieren Pathogenen durch nanoskalige PCR beschrieben wird ein syndromic Eckzahn und equine Atmungs PCR Panel.

Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Ein schnell einsetzbaren, off-Grid Labor wurde entworfen und für abgelegene, ressourcenbeschränkte globale Einstellungen gebaut. Die Eigenschaften und kritische Aspekte der logistisch verbessert, erweiterbar, multifunktionale Labormodule werden erforscht. Eine Checkliste für einen Labor-Workflow und ein Protokoll für die Atemwege virale diagnostischer Test entwickelt und vorgestellt.

Entfernten Labor Management: Respiratorischen Virus-Diagnostik

Das Protokoll demonstriert einen schnellen und standardisierten Arbeitsablauf für die mikrobiologische Vor-Ort-Bewertung (M-ROSE), der drei Schritte umfasst: Herstellung von Objektträgern, Färbung und Interpretation. Dieses Protokoll wird Ärzten helfen, schnelle klinische Entscheidungen zu treffen.

Mikrobiologische Vor-Ort-Schnellbewertung für pulmonale Infektionskrankheiten

Verschiedene bakterielle Krankheitserreger können Atemwegsinfektionen verursachen und zu ernsthaften Gesundheitsproblemen führen, wenn sie nicht genau erkannt und sofort behandelt werden. Der schnelle und genaue Nachweis dieser Erreger durch schleifenvermittelte isotherme Amplifikation ermöglicht ein effektives Management und eine effektive Kontrolle von Atemwegsinfektionen im klinischen Umfeld.

Schneller Nachweis von bakteriellen Krankheitserregern, die Infektionen der unteren Atemwege verursachen, durch mikrofluidische Chip-basierte schleifenvermittelte isotherme Amplifikation

Hier stellen wir die Schritt-für-Schritt-Vorbereitung von vorgemischten, lyophilisierten rekombinasebasierten isothermen Amplifikationen und Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-basierten Reaktionen vor, die für den Nachweis von Nukleinsäure-Biomarkern von Krankheitserregern oder anderen genetischen Markern von Interesse verwendet werden können.

Point-of-Care CRISPR-basierte Diagnostik mit vorgemischten und gefriergetrockneten Reagenzien

Um den schnellen und präzisen Nachweis von Acinetobacter baumannii zu ermöglichen, stellen wir ein Protokoll vor, das die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) in Verbindung mit der LbaCas12a-Endonuklease zur Identifizierung von A. baumannii-Infektionen verwendet.

Schneller und spezifischer Nachweis von Acinetobacter baumannii-Infektionen mit einem Rekombinase-Polymerase-Amplifikations-/Cas12a-basierten System

Hier stellen wir ein Protokoll für die Anwendung von POCUS am Bett im ARDS-Management auf der Intensivstation vor. Es beschreibt standardisierte Techniken für Lungen-, Herz-, Zwerchfell-, Venen- und Magenuntersuchungen, um die Belüftung zu steuern, das Absetzen vorherzusagen und Komplikationen zu verhindern.

Die Anwendung der Point-of-Care-Ultraschalluntersuchung (POCUS) bei der Behandlung des akuten Atemnotsyndroms (ARDS) auf der Intensivstation

Demonstration einer raschen quantitativen Assay der Hemmung der Blutgerinnung durch den niedrigen Molekulargewicht-Heparin, Enoxaparin. Der Beitrag von Enoxaparin durch Entfernen seinen Einfluss durch Verdauung mit Heparinase beurteilt. Eine umfassendere Beschreibung des Tests wird in unserer veröffentlichten Papier detailliert.

Schnelle Point-of-Care-Test von Enoxaparin Gerinnungshemmer Wirksamkeit im Vollblut

Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College.  This protocol describes a fully integrated microfluidic chip-based LAMP method enabling point-of-care detection of 15 pathogens causing lower respiratory tract infections in ICU patients within one hour.

Schnelle Point-of-Care-Detektion von Pathogenen für Infektionen der unteren Atemwege bei Intensivpatienten

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