Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): Ein Open-Source-, benutzerfreundliches Werkzeug zur quantitativen Analyse der Mikrogliamorphologie

Die Kartierung der Mikroglialparameter-Software, oder MMPS, ermöglicht es uns zu untersuchen, wie Ferroptose Mikrogliasubpopulationen nach ischämischem Schlaganfall verändert. MMPS adressiert wichtige Engpässe im Bereich der Mikroglialanalyse und umgeht damit umständliche Softwareanforderungen und erforderliches Programmierwissen. Um zu beginnen, öffnen Sie das GitHub-Repository auf dem Computer und laden Sie die Mapping Microglial Parameters Software oder das eigenständige MMPS-Paket herunter.

Im Download-Ordner doppelklickt man, um das Archiv-Tool zu starten und den komprimierten Ordner automatisch zu extrahieren. Doppelklicken Sie auf das extrahierte MMPS-Anwendungssymbol, um das MMPS-Paket zu überprüfen und zu öffnen. Klicken Sie auf die Option "Bildordner" auswählen und navigieren Sie durch das Verzeichnis des Computers, um die Projektdateien zu finden.

Erteile Ordnerzugriffsberechtigungen und wähle das Speicherverzeichnis des Bildes aus. Als Nächstes klickst du auf Ausgabeordner auswählen und dann auf das Ausgabeverzeichnis. Wählen Sie das zu verarbeitende Bild aus und wählen Sie dann Bildbeschriftung.

Weisen Sie Tieridentifikatoren und Behandlungsgruppen dem Bild zu und speichern Sie die Eingaben. Um die Pixelgröße des Bildes zu berechnen, wähle Kalibrieren in der Skalaleiste. Wählen Sie die Anfangs- und Endpunkte der Skala-Leiste aus, geben Sie die bekannte Skala-Leiste in Mikrometern ein und klicken Sie auf Anwenden.

Wählen Sie den Fluoreszenzkanal, der das Mikroglialsignal enthält. Wählen Sie Bilder für die Verarbeitung aus, indem Sie das Kästchen neben jedem Bildnamen ankreuzen und einzeln bearbeiten, wenn sich die Hintergrundfluoreszenz zwischen den Bildern unterscheidet. Überprüfen Sie die Tabs Original, Vorschau, Verarbeitung und Masken, um Bildverarbeitungsphasen zu vergleichen.

Wählen Sie die Vorschau des aktuellen Bildes aus, um zusätzliche Verarbeitungseinstellungen anzupassen. Für die Hintergrundsubtraktion stellen Sie den Rolling-Ball-Wert zwischen fünf und 150 Pixel ein. Um Beleuchtungsartefakte zu reduzieren, verwenden Sie einen Entschämmungswert von drei und stellen Sie die Schärfungswerte zwischen eins und zwei ein, um die Kantendefinition zu verbessern.

Nach der Optimierung der Bildbearbeitungseinstellungen klicken Sie auf ausgewählte Bilder verarbeiten. Als Nächstes wählen Sie Somas auswählen, alle Bilder. Klicken Sie auf 'Farbe C anzeigen' für die RGB-Composite-Ansicht.

Wählen Sie Kanäle aus und deaktivieren Sie dann alle ungenutzten Kanäle, wenn das Bild farblich verzerrt erscheint. Klicken Sie auf die Anzeigeanpassungen, um die Kanalhelligkeit in der RGB-Ansicht anzupassen. Wählen Sie Mikroglia-Somen, die DAPI und ionisierte Kalziumbindungsadaptermolekül eins oder IBA1-Kolokalisation zeigen.

Entfernen Sie falsch ausgewählte Soma mit der Backspace- oder Delete-Taste. Drücken Sie Enter oder Return, um zum nächsten Bild fortzufahren. Wähle nach der Auswahl der Somas alle Umrisse aus.

Skizzieren Sie den Soma-Perimeter jeder ausgewählten Mikrogliazelle mit mindestens acht Umrisspunkten, ohne die zellulären Prozesse. Entfernen Sie falsch platzierte Umrisspunkte, indem Sie den letzten Punkt rückgängig machen, löschen oder Rücktaste verwenden. Drücken Sie Enter, Return, Doppelklick oder Rechtsklick, um jede Soma-Gliederung abzuschließen.

Klicke auf "Generiere alle Masken" nach Abschluss der Soma-Gliederung. In den Maskengenerierungseinstellungen sollten Sie die minimale Intensität anpassen, um Hintergrundpixel zu reduzieren und Hintergrundunterdrückung sowie Verzweigungserhaltung auszugleichen. Wählen Sie alle Masken mit der Qualitätssicherung der Masken aus, um mit der Qualitätssicherung der Masken zu beginnen, und überprüfen Sie alle präsentierten Masken von den größten bis zu den kleinsten Bereichen.

Vergleichen Sie jede Maske mit der entsprechenden Mikroglia mit den Tabs Processing und Mask. Um Masken zu akzeptieren, verwenden Sie die Tastenkombination A. Um Masken abzulehnen, verwenden Sie die R-Tastenkombination.

Um eine Annahme oder Ablehnung rückgängig zu machen, drücken Sie B. Verwenden Sie die Pfeiltasten der Tastatur, um durch die Maskengrößen zu navigieren. Wählen Sie die größte akzeptable Maske, die Mikroglialverzweigungen genau erfasst, ohne benachbarte Zellen, übermäßigen Hintergrund, Bildgrenzen oder Skalierungsbalken einzubeziehen. Wenn die meisten ungenau sind, nutze die Option "Alle Masken löschen", um die Masken mit einem anderen Schwellenwert zu regenerieren.

Wähle als Nächstes einfache Eigenschaften berechnen, um verschiedene Parameter für akzeptierte Masken zu berechnen, und klicke dann auf Okay. Für weitere Analysen laden Sie fractalanalysisimagej herunter. Py, Sholl.

py und skeletonanalysisimagej. PY-Plugins. Für Fraktal- und Rumpfanalysen öffnen und laufen Sie fractalanalysisimagej.

py als Fiji-Plugin. Dann gib du den Standort des Ausgabeverzeichnisses ein. Geben Sie die Pixelgröße ein und wählen Sie die Option für die größte Maske, um die größte akzeptierte Maske pro Zelle zu analysieren.

Für Sholl-Analyse öffnen Sie Sholl. py als Fiji-Plugin. Geben Sie den Standort des Ausgabeverzeichnisses, gewünschte Pixelgröße, Schrittweite ein.

Wählen Sie den Soma-Radius als Startradius oder geben Sie einen festen Soma-Radius ein, wenn keine MMPS-abgeleiteten Soma-Radien verwendet werden. Open Skeletonanalysisimagej. py als Fiji-Plugin für Skelettanalyse.

Durchsuchen und geben Sie die Pfade für das Maskenverzeichnis, das Ausgabeverzeichnis und die Pixelgröße ein, wenn Sie aufgefordert werden. Nach Abschluss exportieren Sie alle von Plugins generierten Ergebnisse als kommagetrennte Wertedateien in die jeweiligen Ausgabeverzeichnisse. Eine Validierungsstudie von MMPS mit einem Lipopolysaccharid- oder LPS-induzierten Nagetier-Neuroinflammationsmodell zeigte, dass die LPS-Verabreichung im Vergleich zu fahrzeugbehandelten Kontrollen signifikant den durchschnittlichen Schwerpunkt und den Zellumfang verringerte.

Es wurden keine signifikanten Unterschiede in Maskenbereich, Rundung oder Exzentrizität zwischen den Behandlungsgruppen beobachtet. Der Soma-Bereich war bei LPS-behandelten Tieren im Vergleich zu Vehikelkontrollen signifikant erhöht, was mit einer aktivationsassoziierten morphologischen Umgestaltung glialer Zellen übereinstimmt. Weiter flussabwärts zeigten fortgeschrittene morphologische Analysen nur eine schwache Korrelation zwischen Mikroglia-Rundheit und -umfang bei fahrzeugbehandelten Ratten und eine starke Korrelation bei LPS-behandelten Ratten, was auf einen Zusammenhang zwischen erhöhter Mikroglialaktivierung und reduzierter Rundung und Umfang hindeutet.

Zusätzlich zeigte der Maskenbereich starke positive Korrelationen mit dem durchschnittlichen Schwerpunktabstand sowohl in Vehicle- als auch in LPS-behandelten Gruppen, die mit Veränderungen der Verzweigung im Zusammenhang mit der Mikroglialaktivierung übereinstimmen. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, komplexe Mikroglialverzweigungen, morphologische Homogenität und strukturelle Komplexität zu untersuchen. Die Aufnahme von hochauflösenden immunfluoreszenten Bildern ist entscheidend für die präzise Nutzung von MMPS.

Zukünftige Studien können MMPS nutzen, um zu untersuchen, wie ferroptotische Inhibitoren die Mikroglialmorphologie nach verschiedenen Erkrankungen des Nervensystems wie Schlaganfall verändern.