Name: Kontaktlose Co-Kultur-Assays für morphometrische Studien während interspezifischer Interaktionen bei Pilzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Erfahren Sie kontaktlose Co-Kultur-Assays zur Untersuchung mikrobieller Interaktionen bei Pilzen. Diese Methoden ermöglichen morphometrische Analysen von Reaktionen auf interspezifische Faktoren ohne direkten Zellkontakt.

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Diese Arbeit wurde durch das DBT-Wellcome Trust India Alliance Intermediate Fellowship (IA/I/19/1/504294) unterstützt, das RNP verliehen wurde. KBSS erhielt Unterstützung durch das Sonderforschungsstipendium der Ahmedabad University (AU/SRG/SAS/20-21/07_KS_03.25) und durch das SERB-Core Research Grant (URBSASE23A6/SERB/23-24/KS_02.27). Die in Abbildung 1 verwendeten Symbole wurden adaptiert von Servier Medical Art (https://smart.servier.com/), lizenziert unter CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), sowie von BioArt Source, NIAID, NIH.

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Die Autoren geben an, keine konkurrierenden oder widersprüchlichen Interessen zu haben.

Ein früherer Bericht, der eine Membran-Einlegeplatte und einen CFS-basierten Assay verwendete, zeigte, dass C. albicans Hyphen als Reaktion auf C. glabrata-Zellen oder deren CFS ausbildet. Diese Reaktion wurde jedoch nicht durch andere Hefen, wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae und Candida dubliniensis30, ausgelöst. Zudem war diese hyphale Reaktion nicht auf den Labormessstamm C. albicans SC5314 beschränkt, sondern trat auch in anderen genomischen Hintergründen auf, einschließlich des klinischen Isolats WUM5A30. In diesem Protokoll wurde anhand dieser Erkenntnisse ein standardisierter Arbeitsablauf entwickelt, um drei morphologische Parameter zu quantifizieren: Hyphenlänge, Hyphenvolumen und Hyphendicke. Darüber hinaus wurden diese morphologischen Faktoren verwendet, um zu bewerten, wie Variationen in Ploidie und dem Status des Paarungstyp-Lokus die morphologischen Eigenschaften von C. albicans als Reaktion auf ein sekretiertes Induktormolekül beeinflussen.
Die hier beschriebenen kontaktlosen Methoden bieten einen einfachen experimentellen Rahmen, um die morphometrischen Ergebnisse löslicher, überspezifischer Signalstoffe sichtbar zu machen und zu analysieren. Während die Membran-Insert-Kulturplatte eine bidirektionale Diffusion zwischen aktiven Kulturen ermöglicht, bietet der CFS-basierte Assay ein skalierbares Format, da die benötigten induktiven Komponenten unabhängig von der nachgeschalteten Zielkultur gewonnen werden. Um die Konsistenz des Assays sicherzustellen, ist es erforderlich, im Membran-Insert-Kulturplatten-Setup ein Verhältnis von etwa 1:50 (C. albicans zu C. glabrata) beizubehalten. Dieser Konzentrationsgradient gewährleistet einen ausreichenden Fluss der löslichen induktiven Moleküle durch die Membranbarriere, bleibt dabei jedoch unterhalb der Anreicherungsschwellen endogener Quorum-Sensing-Inhibitoren wie Farnesol, die die Filamentationskinetik von C. albicans hemmen können31,32. Ebenso ist ein kritischer Schritt im CFS-basierten Assay die 18-stündige Inkubationszeit, die erforderlich ist, damit die C. glabrata-Quellkultur einheitlich die späte stationäre Wachstumsphase erreicht. Falls die Inkubationszeit der C. glabrata-Kultur weniger als 12 Stunden oder mehr als 24 Stunden beträgt, ist die gewonnene CFS wahrscheinlich nicht optimal hinsichtlich der Konzentration des hier untersuchten spezifischen Induktormoleküls, was zu einer suboptimalen Hypheninduktion führt. Der geeignete Wachstumsstadium zum CFS-Gewinn oder das Verhältnis der Kulturen muss für jedes neue experimentelle Ziel und/oder neue Kombinationen mikrobieller Spezies standardisiert werden.
Um die Reproduzierbarkeit des Assays in verschiedenen Laborumgebungen zu maximieren, werden folgende wesentliche prozedurale Verbesserungen empfohlen. Es wird empfohlen, Glucose-Minimalmedium (GMM) für die Übernachtkultivierung aller diploiden C. albicans-Stämme zu verwenden. Die Verwendung von GMM unterdrückt die Hintergrund-Autofilamentierung, die häufig in nährstoffreichem YPD-Medium beobachtet wird. Eine solche Autofilamentierung wurde auch in anderen Studien beschrieben, obwohl der zugrundeliegende Mechanismus noch unklar ist33. Außerdem wird die vollständige physische Entfernung des Polycarbonatmembran-Einsatzes vor der Bildaufnahme empfohlen, um Lichtstreuung und optische Aberrationen zu eliminieren, die bei der Hellfeldmikroskopie mit hoher Vergrößerung stören können.
Während diese kontaktfreien Konfigurationen dabei helfen, die Rollen löslicher Signalstoffe voneinander zu trennen, bringen sie spezifische experimentelle Herausforderungen mit sich. Beispielsweise sind kontaktfreie Assays anfällig für geringfügige Risiken wie Membranrupturen aufgrund unsachgemäßer Handhabung und infolgedessen mikrobiellen Übergang. Daher sollte beim Positionieren der Pipettenspitzen besondere Sorgfalt darauf geachtet werden, dass die Spitzen die Kammerwände der Inserts berühren und nicht die Membran, während Proben entnommen werden. Zudem kann es aufgrund falscher (zu großer) Porengrößen zu physikalischer Kreuzkontamination zwischen den Kompartimenten kommen, was leicht vermieden werden kann, indem Inserts mit einer geeigneten Porengröße der Membran verwendet werden. Pilzüberwucherung oder umfangreiche Biofilmbildung können die poröse Membran bedecken. Dies wird vermieden, indem die anfängliche Inokulation auf einen OD600 = 0,1 begrenzt und die Inkubation nicht länger als 12 h durchgeführt wird. Außerdem können sich Mikroorganismen innerhalb der Geräte-Vertiefungen nicht homogen verteilen, sondern neigen dazu, sich in der Nähe der Membran zu sammeln oder anzulagern, was zu unerwarteten Verzerrungen bei der optischen Dichtemessung führen kann. Darüber hinaus können diese Systeme, da sie die beiden Populationen physisch voneinander trennen, keine Wechselwirkungen replizieren oder bewerten, die auf direktem, physischem Zell-zu-Zell-Kontakt beruhen. Beispielsweise die Reifung gemischtartiger Biofilme, mechanische Co-Aggregation oder Signalgebung durch an der Zellwand verankerte Adhäsine. Obwohl diese plattenbasierten Assays einen effektiven Endpunktschnappschuss der frühen Filamentationskinetik (nach 3 h) liefern, erfassen sie weder Langzeit-Wachstumsdynamiken noch räumliches Verhalten. Für Forschende, die eine kontinuierliche Echtzeitverfolgung über längere Zeiträume benötigen, könnten spezialisierte mikrofluidische Perfusionskanäle oder automatisierte Live-Cell-Imaging-Kammern eine besser geeignete Alternative darstellen.
Die zelluläre Geometrie ist grundlegend mit der metabolischen Effizienz verknüpft, wobei das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen (SA/V) als entscheidender Faktor für die Nährstoffaufnahme und den intrazellulären Transport fungiert. Bei dimorphen und fadenförmigen Pilzen stellt der Übergang in eine langgestreckte Hyphen-Form eine strukturelle Anpassung dar, um ein optimiertes SA/V-Verhältnis aufrechtzuerhalten. Dies ermöglicht eine verteilte Nährstoffaufnahme entlang der verlängerten Filamentwand und gleichzeitig die Aufrechterhaltung stoffwechselaktiver Prozesse in Richtung der Hyphenspitze34,35,36,37. Unsere Studie zeigt jedoch, dass die morphometrische Skalierung nicht in gleichem Maße proportional über verschiedene Ploidiezustände und Konfigurationen des Paarungstyp-Lokus hinweg ist.
Die generierten morphometrischen Datensätze über Dieses Verfolgungsprotokoll zeigt klare strukturelle Skalierungstrends in Korrelation mit dem Ploidiegrad, wobei haploide Linien durchgängig niedrigere absolute Werte bei allen geometrischen Parametern aufweisen als die entsprechenden diploiden Stämme (Abbildung 5). Innerhalb des diploiden Hintergrunds das homozygote MAT&#945;/&#945; Konfiguration zeigte im Vergleich eine verbesserte Filamentationskinetik (Länge und Volumen) MATa/a oder MATa/&#945; Stämme unter diesen in vitro Bedingungen. Da eine verstärkte Filamentbildung häufig mit einer erhöhten Penetrationskapazität assoziiert ist, ist unklar, warum klinische Isolate von C. albicans werden vorwiegend als heterozygote Diploide isoliert (MATa/&#945;). Es ist denkbar, dass der heterozygote Zustand innerhalb eines immunokompetenten Wirts einen breiteren Fitnessvorteil für eine langfristige kommensale Besiedlung bietet. Mit anderen Worten, die strukturellen Eigenschaften des MATa/&#945; Morphotypen sind dahingehend optimiert, im Hinblick auf die Immunüberwachung des Wirts zu überleben. Zukünftige Untersuchungen sollten daher diese standardisierten Kokultursysteme nutzen, um die vergleichende Fitness unterschiedlicher mating-type-homozygoter Stämme unter variierenden selektiven Druckbedingungen systematisch zu bewerten.
Frühere Studien haben dokumentiert, dass die Vakuolenmorphismus, Fission-Fusionsdynamik und strukturelle Expansion eine wichtige Rolle bei der Regulation des inneren Volumens und des Turgordrucks wachsender filamentöser Pilze spielen. Beispielsweise sind bei dem Reisblast-Erreger Magnaporthe oryzae deutliche Übergänge zwischen schlanken vegetativen Hyphen und kugeligen invasiven Strukturen eng mit Veränderungen in der Vakuolenorganisation koordiniert38,39,40. Der vorliegende Protokollansatz überwachte jedoch nicht direkt die Vakuolendynamik während der Filamentierung von C. albicans; die Erfassung dieser inneren Organellenveränderungen in Bezug auf das gesamte strukturelle Volumen stellt jedoch einen aussagekräftigen Ansatz für zukünftige Untersuchungen dar. Zudem ist weiterführende Forschung erforderlich, um zu klären, warum bestimmte, von Pilzen stammende Sekretomkomponenten andere kinetische Muster der morphologischen Skalierung hervorrufen als vom Wirt stammende chemische Induktoren wie Serum.
Die in diesem Protokoll beschriebenen kontaktfreien Co-Kultur-Methoden können angepasst werden, um Interaktionen zwischen verschiedenen Arten und über Arten- oder Reichsgrenzen hinweg zu untersuchen, beispielsweise die Signalübertragungsdynamik zwischen opportunistischen Bakterienpopulationen und dimorphen Pilzen. Darüber hinaus kann diese quantitative Plattform aufgrund der Skalierbarkeit der 96-Well- und 24-Well-Formate für chemische Screens eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind die Identifizierung von kleinen Molekülinhibitoren oder neuartigen antimykotischen Verbindungen, die gezielt durch das Sekretom angeregte Filamentierungswege stören, ohne die grundlegende Zellviabilität direkt zu beeinträchtigen.

In natürlichen und klinischen Ökosystemen leben Mikroorganismen typischerweise in strukturierten polymikrobiellen Gemeinschaften, die durch komplexe Netzwerke intra- und&#160;interspezifischer&#160;Kommunikation reguliert werden1. Diese Gemeinschaften nutzen vielfältige chemische Signale, darunter Quorum-Sensing-Moleküle, flüchtige organische Verbindungen sowie sekretorische Peptide und Proteine, um verhaltensmäßige Prozesse auf Populationsebene zu koordinieren2. Die Kartierung dieser Kommunikationsdynamiken ist entscheidend, da kooperative, konkurrierende oder räuberische Nischeninteraktionen den mikrobiellen Stoffwechsel, die räumliche Architektur und die Anpassung an Stressfaktoren erheblich verändern3. Klinisch zeigen diese polymikrobiellen Netzwerke (wie beispielsweise bakteriell-pilzliche Gemeinschaften aus zwei Arten oder interspezifische pilzliche Gemeinschaften) im Vergleich zu Reinkulturen häufig eine synergistische Virulenz, eine beschleunigte Besiedlung von Gewebe und eine erhöhte antimikrobielle Resistenz4,5. Die Aufklärung der molekularen Determinanten mikrobieller Kommunikation ist daher entscheidend, um traditionelle Modelle zu überwinden und innovative antiinfektiöse Strategien zur Störung der Stabilität solcher Gemeinschaften zu entwickeln6.
Um unterschiedliche Formen der mikrobiellen Kommunikation zu untersuchen, nutzen Forscher vielfältige experimentelle Ansätze, die hauptsächlich in der Zellbiologie von Säugetieren, der Immunologie und der Onkologie Anwendung finden7,8,9. Beispielsweise dienen Direktkontakt-Ko-Kultivierungsmodelle als Standard zur Untersuchung&#160;juxtakriner&#160;Signalwege und physischer Zell-zu-Zell-Interaktionen10. Ähnliche Aufbauten mit Modifikationen werden ebenfalls verwendet, um physikalische Wechselwirkungen zwischen Mikroben zu erforschen, insbesondere deren gegenseitige Hemmung oder Reaktion auf Wirkstoffe9,11,12. Allerdings ist es schwierig, die zugrundeliegenden Mechanismen voneinander abzugrenzen, da sowohl kontaktabhängige als auch diffusible Signale zur beobachteten Reaktion beitragen. Während herkömmliche kontaktbasierte Assays räumliche Einblicke ermöglichen, sind sie arbeitsintensiv und/oder erfordern spezifische Markierungen der Stämme, was bei Nicht-Modellorganismen mühsam sein kann. Umgekehrt kommen Transwell-(Membraninsert-Platten)Assays, vor allem in Studien an Säugetierzellen, zum Einsatz, um die Beiträge kontaktabhängiger und diffusibler Signale voneinander zu trennen13,14,15,16. Diese Methode ist besonders nützlich, wenn die zelluläre Kommunikation durch sezernierte Moleküle vermittelt wird, da sie eine Echtzeitanalyse der Signalübertragungsdynamik zwischen Zellpopulationen erlaubt17. Darüber hinaus bieten kontaktfreie Assays den Vorteil einer Membrantrennung, die auch die Integration von Experimenten mit computerbasierten Modellen ermöglicht, um so Mikroben dynamisch zu verfolgen, die mit herkömmlichen Methoden übersehen werden18. Dieser Ansatz wird gelegentlich genutzt, um gleichzeitig die Entwicklungs­kinetik verschiedener Bakterienspezies zu untersuchen19.
Eine kostengünstigere Hochdurchsatz-Alternative zum Membran-Einsatz-Well-Platten-Assay ist der zellfreie Überstand-(CFS-)basierte oder auf konditioniertem Medium basierende Assay. Dieser wird bekanntermaßen in der regenerativen Medizin und der Gefäßbiologie eingesetzt, um Sekretome zu isolieren, die für das Verständnis der stammzellvermittelten Gewebereparatur und/oder der tumorigenen Angiogenese erforderlich sind20. Ähnlich haben CFS-Systeme in mikrobiellen Studien zur Aufklärung der polymikrobiellen Konkurrenz beigetragen. Beispielsweise wurden bakterielle Filtrate (wie&#160;Pseudomonas aeruginosa&#160;Acyl-Homoserinlactone oder&#160;Lactobacillus&#160;Metaboliten) verwendet, um die Reifung von Pilz-Biofilmen zu modulieren21,22.&#160;In jüngerer Zeit haben mikrofluidische Plattformen durch Organ-auf-einem-Chip-Technologien eine hochpräzise physiologische Biomimetik ermöglicht23,24. Obwohl mikrofluidische Systeme zur gleichzeitigen Detektion der Reaktion der mikrobiellen Gemeinschaft auf deren Sekretome eingesetzt wurden, erfordern sie spezialisierte Instrumente und Expertise und sind möglicherweise nicht in allen Laboren leicht umsetzbar25,26,27. Daher versprechen Membran-Einsatz-Well-Platten- und CFS-basierte Assays, in den meisten Fällen die Methoden der Wahl zu sein. Die Wahl zwischen diesen beiden Assays hängt von der Art des sekretorischen Moleküls ab. Ist das sekretorische Molekül instabil, d. h. hat eine kurze Halbwertszeit und erfordert die Messung der Echtzeitaktivität, ist der Membran-Einsatz-Well-Platten-Assay besser geeignet. Ist das sekretorische Molekül dagegen stabil und ist das Experiment im großen Maßstab angelegt, wäre ein CFS-basierter Assay wirtschaftlicher.
Das Hauptziel dieses Protokolls besteht darin, eine schrittweise qualitative und quantitative Verfolgungsmethode zur Bewertung morphologischer Merkmale vorzustellen, wobei die Membran-Insert-Platte und CFS-Plattformen verwendet werden (Abbildung 1). Hier wurde dies am Beispiel der durch Sekretionsfaktoren vermittelten Kommunikation zwischen Candida albicans und Candida glabrata demonstriert. Darüber hinaus können mit diesen Werkzeugen auch die Auswirkungen intrinsischer genetischer Variablen (Ploidie und Zustand des Paarungsorts) auf die absolute geometrische Entwicklung (Länge, Volumen und Durchmesser) von &#160;C. albicans&#160;Hyphen quantifiziert werden, wenn sie sekretorischen Signalstoffen ausgesetzt sind. Dieses etablierte Protokoll bietet eine einfache und kostengünstige, berührungslose Plattform, die sich zur Untersuchung der Signalübertragungsdynamik zwischen Arten eignet.

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m PES-Spritzenfilter</td><td>Millipore (Merck)</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>HiMedia</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>HiMedia</td><td>GRM016</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 24-Well-Trägerplatte mit Zellkultur-Einlagen (0.4 &amp;mu;m)</td><td>Thermo Scientific</td><td>141002</td><td></td></tr><tr><td>Nunc BioLite 96-Well-Multischale, zellkulturgeeignet, flacher Boden</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Proteose-Pepton</td><td>HiMedia</td><td>RM005</td><td></td></tr><tr><td>Uridin</td><td>Sigma</td><td>U6381</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>HiMedia</td><td>RM027</td><td></td></tr><tr><td>Hefenitrogenbase, mit Ammoniumsulfat, ohne Aminosäuren</td><td>HiMedia</td><td>M878</td><td></td></tr></tbody></table>

kontaktlose co-kultur-assays für morphometrische studien während interspezifischer interaktionen bei pilzen

Contactless Co-Culture Assays for Morphometric Studies During Inter-Species Interactions in Fungi

Das zelluläre Verhalten und die Morphologie werden in einer mikrobiellen Gemeinschaft normalerweise durch verschiedene intra- und extrazelluläre Faktoren beeinflusst. Verschiedene verfügbare Ansätze zur Untersuchung der mikrobiellen Kommunikation können mühsam sein und/oder spezialisierte Einrichtungen und Fachkenntnisse erfordern.&#160;Hier werden zwei komplementäre kontaktlose Co-Kultur-Ansätze beschrieben, der Membran-Insert-Multiwellplatte-Co-Kultur-Assay und der auf zellfreien Überständen (CFS) basierende Assay, die beide auf morphologischen Übergängen als messbare Reaktion beruhen, um die Rolle verschiedener Faktoren in einer gegebenen Interaktion zwischen Arten zu untersuchen. Das Membran-Insert-Multiwellplattensystem ermöglicht, während es die Diffusion extrazellulärer Moleküle erlaubt, eine Echtzeit-Interaktion zwischen räumlich getrennten Arten. Im Vergleich dazu bietet der CFS-basierte Assay einen vereinfachten, skalierbaren Ansatz zur Bewertung von Reaktionen auf konditioniertes Medium. Der hier vorgestellte Protokollablauf umfasst standardisierte Verfahren zur Kulturpräparation, Erzeugung konditionierter Überstände, Assay-Setup, Mikroskopie, Bildaufnahme, quantitative morphometrische Analyse mittels Fiji sowie statistische Auswertung. Dies wurde anhand eines Beispiels der pilzlichen morphologischen Reaktion auf intrinsische und extrinsische Faktoren demonstriert. Die hier vorgestellten Methoden bieten zugängliche und anpassbare alternative Werkzeuge zur Untersuchung neuartiger mikrobieller Interaktionen in einer Gemeinschaft und könnten leicht erweiterbar sein, um Mechanismen zu erforschen, die dem Zusammenleben mehrerer Arten in einer Gemeinschaft zugrunde liegen.

Kontaktlose Kokultur-Assays zur Untersuchung von Interaktionen zwischen Arten
Lösliche, wenig abgegebene extrazelluläre Signalmoleküle vermitteln oft zentrale Kommunikationsereignisse während einer gemischten mikrobiellen Koexistenz. Solche Dynamiken wurden mithilfe zweier kontaktloser zellbasierter Aufbauten untersucht, die entwickelt wurden, um Interaktionsmuster zwischen C. albicans und C. glabrata zu analysieren, während direkter physikalischer Zell-zu-Zell-Kontakt verhindert wurde. Die erste Konfiguration verwendete ein integriertes Kultursystem mit Membran-Einschub-Well-Platte, bei dem die beiden Populationen physisch durch eine inerte, poröse Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 0,4 µm getrennt waren, wodurch eine ungehinderte bidirektionale Diffusion sekretierter Moleküle über die Barriere ermöglicht wurde. Der zweite Aufbau überwachte das Wachstum von C. albicans-Hefezellen, die direkt in Mikrotiterplatten kultiviert wurden, die zellfreies Überstandsmaterial enthielten, das aus stationären C. glabrata-Kulturen (CgCFS) gewonnen worden war.
In Übereinstimmung mit den vorherigen Untersuchungen30 entwickelten heterozygote diploide Wildtyp-Zellen von C. albicans (SC5314) leicht echte Hyphen als Reaktion auf C. glabrata-Zellen, die durch die Membraninsert-Barriere getrennt waren, oder auf das filtrierte CgCFS. Dagegen blieben Zellen, die in reinem negativen Kontrollmedium (GMM oder YPD) kultiviert wurden, vorwiegend in der Hefe- und Pseudohyphenform (Abbildung 2A). Die vergleichenden Analysen zeigten eine Übereinstimmung zwischen den beiden Testaufbauten. Beide Assays ergaben vergleichbare Werte bei allen strukturellen Parametern, einschließlich Filamentlänge, -volumen und -dicke (Abbildung 2). Ein Unterschied in den morphologischen Parametern galt als signifikant, wenn der p-Wert aus den entsprechenden statistischen Tests, gefolgt von Post-hoc-Tests für multiple Vergleiche, das Signifikanzniveau von 0,05 erreichte. Diese Beobachtungen zeigten, dass bei C. albicans-Zellen kein signifikanter Unterschied in der Länge der echten Hyphen bestand, die entweder im Membraninsert-Well-Platten-System durch C. glabrata-Zellen induziert wurden (39,66 µm ± 6,81 µm) oder bei Exposition gegenüber dem filtrierten CgCFS (37,13 µm ± 6,50 µm; Abbildung 2B). Ebenso unterschieden sich die Volumina dieser induzierten Filamente im Membraninsert-Well-Platten-System (112,10 µm3 ± 22,59 µm3) nicht signifikant von denen im CgCFS-konditionierten Medium (109,78 µm3 ± 34,69 µm3; Abbildung 2C). Außerdem bestätigten Durchmesser-Messungen, dass die durchschnittliche Hyphendicke zwischen den beiden Aufbauten konsistent blieb, mit Werten von 1,89 ± 0,10 µm für die Membraninsert-Well-Platten-Konfiguration und 1,92 µm ± 0,23 µm für die CgCFS-Behandlung (Abbildung 2D).
Ploidiezustände und Konfigurationen des Kopplungstyps verändern die morphologischen Dimensionen in vitro
Die Rollen von Ploidieebenen und Mating-Locus-Architekturen bei der Steuerung dimorpher Übergänge wurden in verschiedenen pilzlichen Modellsystemen nachgewiesen. Hier wurde eine analytische Nachverfolgungspipeline angewandt, um Filamentierungsmetriken – insbesondere Hyphenlänge, strukturelles Volumen, Dicke sowie das entsprechende Volumen der Mutterhefezelle – in einer Reihe von haploiden (MATa oder MATα) und diploiden (MATa/a, MATα/α oder MATa/α) C. albicans-Stämmen zu quantifizieren.
Die strukturelle Profilierung zeigte, dass der homozygote diploide Alpha-Stamm (MATα/α) nach Exposition gegenüber entweder dem induktiven CgCFS-Sekretom oder der positiven Serumkontrolle Filamente mit signifikant längeren Achsen (45,56 µm ± 9,24 µm und 46,62 µm ± 9,07 µm) und größerem Volumen (125,24 µm3 ± 39,94 µm3 und 119,45 µm3 ± 37,32 µm3) bildete im Vergleich zum homozygoten diploiden MATa/a-Stamm (Abbildung 3A,C). Während standardmäßige klinische Isolate von C. albicans vorwiegend als heterozygote Diploide vorliegen, wiesen der Referenzstamm MATa/α nach Induktion (insbesondere mit Serum) längere Filamente und größere Volumina im Vergleich zum MATa/a-Stamm auf. Diese waren jedoch signifikant geringer als beim homozygoten MATα/α-Stamm (Abbildung 3B,D).
Gleichzeitig zeigten die haploiden Stämme ein inverses Muster, bei dem der haploide MATa-Stamm unter beiden Induktionsbedingungen eine signifikante Zunahme der Hyphenlänge im Vergleich zum haploiden MATα-Stamm aufwies (CgCFS: 22,06 µm ± 5,41 µm gegenüber 17,58 µm ± 4,12 µm; Serum: 23,71 µm ± 6,59 µm gegenüber 21,00 µm ± 5,29 µm; Abbildung 4A). Interessanterweise führte diese Längenzunahme im haploiden Hintergrund nur als Reaktion auf CgCFS zu einer Zunahme des Hyphenvolumens (38,84 µm3 ± 19,58 µm3 gegenüber 34,25 µm3 ± 19,62 µm3) (Abbildung 4B). Diese ersten in vitro-Messungen deuten auf eine komplexe Wechselwirkung zwischen Ploidiezuständen und Konfigurationen des Paarungstyp-Lokus hin und legen nahe, dass die MATa- und MATα-Loci vermutlich unterschiedlich zur Dynamik der Filamentbildung beitragen.
Um die statistischen Zusammenhänge zwischen diesen strukturellen Kenngrößen über die kombinierten Datensätze hinweg zu untersuchen, wurden eine Rangkorrelation nach Spearman (ρ) und eine lineare Regression nach Pearson (R2) durchgeführt, die alle getesteten Ploidie- und Kopplungstyp-Varianten umfassten. Positive Korrelationen wurden bei allen analysierten Paaren beobachtet: Hyphenlänge versus Hyphenvolumen, Hyphenlänge versus Hyphendicke, Hyphenlänge versus Mutterzellvolumen sowie gesamtes Hyphenvolumen versus Mutterhefezellvolumen (Abbildung 5, ergänzende Tabelle 1 und ergänzende Tabelle 2).
Der stärkste Zusammenhang wurde zwischen der Hyphenlänge und dem berechneten hyphalen Volumen beobachtet (ρ = 0.91; Abbildung 5A). Umgekehrt war die schwächste Korrelation zwischen dem Ausgangsvolumen der Mutterhefezelle und dem entstehenden hyphalen Volumen (ρ = 0.63; Abbildung 5C). Außerdem korrelierte die Hyphendicke nicht so stark mit der Hyphenlänge wie das hyphale Volumen (Abbildung 5A,D). Das Volumen der Mutterzelle, die Hyphenlänge und die Hyphendicke wiesen keine statistisch signifikanten Unterschiede in ihren Korrelationen auf (Abbildung 5B,D). Diese geometrischen Verteilungen legen nahe, dass ein größeres initiales Volumen der Mutterhefezelle nicht zwangsläufig zu längeren Hyphen oder einem höheren Volumen führen muss.
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse die Nützlichkeit sowohl der Membran-Insert-Well-Platte als auch der auf CFS basierenden Assays zur Visualisierung und Quantifizierung morphogenetischer Variationen in C. albicans ohne jeglichen physischen Kontakt. Die durch dieses Protokoll gewonnenen Daten offenbaren unterschiedliche morphologische Merkmale in verschiedenen Ploidie-Hintergründen und Konfigurationen des Kopplungstyps. Diese kontaktlosen Assay-Setups bieten eine flexible, skalierbare Methodik, die angepasst werden kann, um Signaldynamiken zwischen Arten in vielfältigen mikrobiellen Kombinationen zu untersuchen.
<img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig1.jpg" /> 
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung des Membran-Insert-Platten-Kokulturs und der CFS-basierten Hypheninduktionsassays mit Candida-Arten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig2.jpg" /> 
Abbildung 2: Vergleich der beobachteten Hyphenmorphismen zwischen der Membran-Insert-Wellplatte und CFS-basierten kontaktlosen Assays. (A) Repräsentative Hellfeld-Mikroaufnahmen, die die morphologische Reaktion von C. albicans gegenüber YPD (Kontrolle), C. glabrata in einer Membran-Insert-Wellplattenanordnung oder gegenüber dem mit dem C. glabrata-zellfreien Überstand (CFS) konditionierten Medium zeigen. Rosa, schwarze und weiße Pfeilspitzen kennzeichnen jeweils die Hefeform, Pseudohyphen und echte Hyphen. Maßstab, 10 µm. Hyphenlängen (B), Hyphenvolumina (C) und Hyphendicke (D) eines heterozygoten diploiden C. albicans-Stamms (SC5314), die als Reaktion auf C. glabrata-Zellen in einer Membran-Insert-Wellplattenanordnung oder auf C. glabrata-CFS beobachtet wurden. Die Daten zeigen Median ± 95 % Konfidenzintervalle aus drei unabhängigen biologischen Experimenten mit n = 50 Zellen. ns, nicht signifikant: p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig3.jpg" /> 
Abbildung 3: Der Kopplungstyp und die Zygosität haben signifikante Auswirkungen auf die Hyphenmorphe in diploiden C. albicans. Diagramme, die die vergleichenden Hyphenlängen in Reaktion auf das angegebene Induktormolekül zwischen homozygoten Diploiden (A) und zwischen hetero- und homozygoten Diploiden (B) von C. albicans darstellen. Ebenso werden die vergleichenden Hyphenvolumina in Reaktion auf die genannten Induktormoleküle zwischen homozygoten Diploiden (C) und zwischen hetero- und homozygoten Diploiden (D) gezeigt. Kontrolle: YPD, das Kontrollmedium, das keine Hyphenbildung induziert. Die Daten zeigen Median ± 95 % Konfidenzintervalle aus drei unabhängigen biologischen Experimenten mit n = 50 Zellen. Die angegebenen Zahlen oben im Diagramm sind p-Werte, ermittelt durch Wilcoxon-Rangsummentest-Vergleiche. **: p &#60; 0,01, ***: p &#60; 0,001, ****: p &#60; 0,0001, statistisch signifikant; ns, nicht signifikant: p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig4.jpg" /> 
Abbildung 4: Hyphale Eigenschaften in haploiden C. albicans als Reaktion auf verschiedene molekulare Induktoren. Die Diagramme zeigen die Hyphenlängen (A) und Hyphenvolumina (B) in haploiden C. albicans-Stämmen als Reaktion auf die angegebenen Induktoren. Kontrolle: YPD, das Medium, das keine Hyphenbildung induziert. Die Daten stellen den Median ± 95 % Konfidenzintervalle aus drei unabhängigen biologischen Experimenten mit jeweils n = 50 Zellen dar. Angegebene Zahlen bezeichnen p-Werte, berechnet mittels Wilcoxon-Rangsummentest. **: p &#60; 0,01, ***: p &#60; 0,001, ****: p &#60; 0,0001, statistisch signifikant; ns, nicht signifikant: p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig5.jpg" /> 
Abbildung 5: Korrelation zwischen morphologischen Parametern, die der Ploidie von C. albicans entsprechen. Die Diagramme zeigen die Spearman-Korrelation und lineare Regression zwischen den in dieser Studie verwendeten morphologischen Parametern, d. h. Hyphen-Volumen und Hyphen-Länge (A), Zellvolumen und Hyphen-Länge (B), Zellvolumen und Hyphen-Volumen (C) sowie Hyphen-Dicke und Hyphen-Länge (D). ρ: Spearman-Korrelationskoeffizient; R2: Bestimmtheitsmaß aus der linearen Regressionsanalyse; p: p-Wert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stamm</td>
			<td>Art</td>
			<td>Ploidie</td>
			<td>Genotyp</td>
			<td>Quelle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBS138</td>
			<td>Candida glabrata</td>
			<td>Haploid (1n)</td>
			<td>MATα</td>
			<td>ATCC 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5314</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Diploid (2n)</td>
			<td>Heterozygot (MATa/α)</td>
			<td>ATCC MYA-2876</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1132</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Diploid (2n)</td>
			<td>Homozygot (MATa/a); arg4Δ/arg4Δ, leu2Δ/leu2Δ, his1Δ/his1Δ, URA3/ura3Δ</td>
			<td rowspan="2">Schaefer, D., Côte, P., Whiteway, M., Bennett, R.J. Barrier Activity in Candida albicans Mediates Pheromone Degradation and Promotes Mating. Eukaryotic Cell. 6 (6), 907–918, doi: 10.1128/ec.00090-07 (2007).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1133</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Diploid (2n)</td>
			<td>Homozygot (MATα/α); arg4Δ/arg4Δ, leu2Δ/leu2Δ, his1Δ/his1Δ, URA3/ura3Δ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY896</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Haploid (1n)</td>
			<td>Homozygot (MATa); ura3∆::imm434 his4 gal1∆::ura3∆::HIS4</td>
			<td rowspan="2">Hickman, M.A. et al. The ‘obligate diploid’ Candida albicans forms mating-competent haploids. Nature. 494 (7435), 55–59, doi: 10.1038/nature11865 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY803</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Haploid (1n)</td>
			<td>Homozygot (MATα); his4 ura3Δ::HIS4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Stämme von Candida albicans und Candida glabrata, die in dieser Studie verwendet wurden. Die Tabelle enthält die Bezeichnungen, expliziten Genotypen, Ploidiezustände und die Zygosität des Kopplungstyps der in den Ko-Kulturversuchen mit kontaktlosen Membraneinlegeplatten und Assays basierend auf zellfreier Überstandflüssigkeit (CFS) untersuchten Pilzstämme.
Erweiterte Tabelle 1: Daten statistischer Analysen, die an verschiedenen morphologischen Parametern von C. albicans durchgeführt wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Erweiterte Tabelle 2: Rohwerte aller biologischen Wiederholungen verschiedener morphologischer Parameter von C. albicans, die in dieser Studie untersucht wurden.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Zusatzdatei 1: Liste der in dieser Studie verwendeten Medien mit ihren Zusammensetzungen.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental File 1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Es werden zwei kontaktlose Co-Kultur-Ansätze zur qualitativen und quantitativen Beurteilung morphologischer Reaktionen von Pilzen während interartlicher Interaktionen beschrieben. Das Protokoll veranschaulicht, wie intrinsische Faktoren das Hyphenwachstum beeinflussen, am Beispiel eines interartlichen Candida-Assays. Diese Methoden lassen sich leicht anpassen, um die interartliche Kommunikation bei verschiedenen Mikroorganismen zu untersuchen.

Kontaktlose Co-Kultur-Assays für morphometrische Studien während interspezifischer Interaktionen bei Pilzen

Das zelluläre Verhalten und die Morphologie werden in einer mikrobiellen Gemeinschaft üblicherweise durch verschiedene intra- und extrazelluläre Faktoren beeinflusst. Verschiedene Ansätze ...

Wir untersuchen die molekulare Kommunikation in Wirt-Pathogen- und interartlichen Pilz-Interaktionen und fragen danach, wie sezernierte Signale die mikrobielle Morphologie und das Verhalten beeinflussen. Bestehende Methoden können aufwendig, kostspielig oder verwirrend sein. Dieses Protokoll bietet einen einfachen, anpassungsfähigen, kontaktlosen Assay, um neuartige interartliche mikrobielle Wechselwirkungen zu untersuchen. Dieses Protokoll unterstützt grundlegende und translationsorientierte Forschung zu Interaktionen zwischen Arten und über Reichsgrenzen hinweg in vielfältigen biologischen und klinischen Systemen.Beginnen Sie damit, eine Agarplatte mit Glucose-Minimalmedium mit Kolonien von Candida glabrata CBS 138, eine sterile Öse und ein Reagenzglas mit steriler Hefe-Extrakt-Pepton-Dextrose, oder YPD, Brühe im Sicherheitswerkbank einzustellen. Wählen Sie eine einzelne isolierte Kolonie von der Platte aus und impfen Sie sie in 10 Milliliter YPD-Brühe an. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit kontinuierlicher Schüttelung bei 200 U/min für 18 Stunden. Nehmen Sie die Übernachtkultur. Überprüfen Sie die Hefemorphologie und das Fehlen von Kontaminationen mittels Lichtmikroskopie. Übertragen Sie die Kultur in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 5.000 × g für fünf Minuten bei 25 Grad Celsius. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand und bewahren Sie das Zellpellet für den Membran-Einsatz-Test auf. Für den Zielstamm Candida albicans impfen Sie eine einzelne Kolonie in 5 Milliliter GMM-Brühe bei einem diploiden Stamm oder YPD-Brühe bei einem haploiden Stamm an. Inkubieren Sie die beimpfte Kultur bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min für 12 Stunden. Überprüfen Sie die optische Dichte der Übernachtkultur bei 600 Nanometern. Verdünnen Sie anschließend die Kultur mit vorgewärmter GMM auf ein Endvolumen von 1 Milliliter und eine endgültige OD bei 600 Nanometern von 0,1. Nehmen Sie eine sterile 24-Loch-Gewebekulturplatte. Geben Sie 1 Milliliter Candida albicans-Suspension mit einem OD bei 600 Nanometern von 0,1 in jede ausgewählte untere Kammer oder Bauchhöhle einer Zellkulturplatte mit Doppelkammer. Entnehmen Sie danach das Candida glabrata-Pellet und resuspendieren Sie es in 1 Milliliter GMM-Brühe. Zentrifugieren Sie bei 5.000 × g für 3 Minuten und verwerfen Sie das Überstand. Wiederholen Sie die Waschung zweimal. Resuspendieren Sie das endgültige Pellet in frischer GMM-Brühe und stellen Sie den OD bei 600 Nanometern der Zellsuspension auf fünf ein. Bringen Sie anschließend mit sterilen Pinzetten einen sterilen Membraneinsatz mit einer Polycarbonatmembran mit 0,4-Mikrometer-Poren in jedes Arbeitsloch ein. Befestigen Sie den Einsatz fest in den Löchern und geben Sie 750 Mikroliter der hergestellten Candida glabrata-Suspension in jede obere oder luminalen Kammer. Bedecken Sie die zusammengestellte Platte und inkubieren Sie sie für drei Stunden bei 37 Grad Celsius im stationären Zustand. Nach der Inkubation entfernen Sie mit sterilen Pinzetten jeden oberen Einsatz und entsorgen Sie diesen sicher. Stellen Sie die 24-Loch-Platte auf ein invertiertes Mikroskop, das mit DIC-Optik sowie 10x-, 20x- und extra langen Arbeitsabstand 40x-Objektiven ausgestattet ist, zur morphologischen Auswertung. Nach der erforderlichen Inkubationszeit die Bodenflächen der Mulden mit dem 10x-Objektiv scannen, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu überprüfen und Nachverfolgungsfehler oder anomales Clustering zu erkennen. Mindestens 10 separate Bildausschnitte mit dem kalibrierten 20x-Objektiv aufnehmen, um den Kernsatz an Daten zur Filamentanzahl und Populationsverteilung zu erhalten. Für eine detaillierte phänotypische Analyse und zur Messung der Zellgrenzen Mikroaufnahmen mit dem 40x-Objektiv mit extra langem Arbeitsabstand erfassen. Anschließend alle Rohbilddateien speichern. Die neueste Version der Fiji-Software starten. Das Zielmikrograf über Datei und dann Öffnen öffnen. Um die Hyphallänge zu messen, das Linienselektions-Symbol anklicken und das Werkzeug „Gliederungslinie“ auswählen. Den Cursor an der Stelle platzieren, an der das Filament aus der Mutterhefezellenwand austritt. Die zentrale Längsachse der Hypha entlangführen, Ankerpunkte hinzufügen, um Kurven und Biegungen zu verfolgen, und am apikalen Ende abschließen. Den Messbefehl über Strg + M unter Windows oder Befehlstaste + M unter Mac OS ausführen, um die Gesamtlänge L in Mikrometern im Ergebnisfenster zu protokollieren. Mit dem Pinselwerkzeug die gemessene Zelle markieren, um eine doppelte Analyse zu verhindern. Die dazugehörige Mutterhefezelle lokalisieren. Mit dem Werkzeug „Gliederungslinie“ eine gerade Linie über die maximale Längsachse der Zelle zeichnen und messen, um die Hauptachse A zu erfassen. Danach eine Linie senkrecht zur Hauptachse über die breiteste Querausdehnung zeichnen und messen, um die Nebenachse B zu erfassen. Das Volumen der Mutterhefezelle, CV, in Kubikmikrometern anhand des im Softwarepaket enthaltenen Modells des verlängerten Sphäroids berechnen. Um die Hyphaldicke zu messen, mit dem Werkzeug „Gliederungslinie“ eine Linie von Außenwand zu Außenwand senkrecht zur Längsachse der Hypha ziehen. Den Durchmesser an drei gleichmäßig verteilten Positionen entlang des Filaments erfassen. Den arithmetischen Mittelwert der drei Durchmesser berechnen, um die durchschnittliche Dicke d zu erhalten, und diesen durch 2 teilen, um den Radius r zu ermitteln. Das gesamte Hyphalvolumen HV in Kubikmikrometern berechnen, indem das unverzweigte Filament als Zylinder behandelt wird.Berechnen Sie den Mittelwert oder Median der Zellmessung für jedes biologische Replikat und verwenden Sie diese Werte auf Replikat-Ebene für nachfolgende statistische Vergleiche. Bevor parametrische Methoden angewendet werden, überprüfen Sie den Datensatz der biologischen Replikate auf Normalverteilung mithilfe des Shapiro-Wilk- oder D'Agostino-Pearson-Tests. Für einen Vergleich zwischen zwei Gruppen verwenden Sie einen ungepaarten zweiseitigen t-Test, wenn der Datensatz einer Normalverteilung folgt. Nach Durchführung der statistischen Analysen und Erstellung der grafischen Darstellungen wenden Sie einheitliche statistische Kennzeichnungen in allen Abbildungen an.Candida albicans-Zellen bildeten in zwei kontaktlosen Testsystemen echte Hyphen aus, und zwar entweder bei Exposition gegenüber membrangetrennten Candida glabrata-Zellen oder gegenüber filtriertem, zellfreiem Überstand von Candida glabrata. Die Kontrollzellen hingegen behielten überwiegend Hefe- und Pseudohyphen-Morphologien bei. Zwischen dem membrangetrennten Kokultivierungsansatz und dem Ansatz mit filtriertem zellfreiem Überstand wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet; beide zeigten vergleichbare Hyphenlängen, Hyphenvolumina und Dicken.Das Protokoll ermöglicht es Forschenden, die Koexistenz mehrerer Arten zu untersuchen, indem morphologische Reaktionen auf zwischenartige Signalübertragung innerhalb mikrobieller Gemeinschaften gemessen werden. Die zentrale Herausforderung besteht darin, den molekularen Austausch über die Membran sicherzustellen, was durch Schütteln der Platte und Aufrechterhaltung eines ausreichenden hydrostatischen Drucks erreicht werden kann. Die Live-Cell-Bildgebung von Organellen-Dynamiken könnte Aufschluss darüber geben, wie molekulare Kommunikation die zwischenartigen Interaktionen mechanistisch gestaltet.

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