Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur verifizierbaren Identifikation von Proteinen, die direkt mit LncRNA interagieren: Von kultivierten Zellen bis zum Maus-Hoden

Unsere Forschung hat cPDiRT entwickelt, eine UV-Vernetzungsmethode, um RNA-Protein-Interaktionen direkt sowohl in Kulturzellen als auch in nativen Geweben wie Hoden abzubilden und so die molekularen Mechanismen von TUG1 in der Spermatogenese aufzuklären. Dieses Protokoll ermöglicht die direkte Abbildung von RNA-Protein-Interaktionen in einem breiteren Spektrum an Systemen, von Kulturzellen bis hin zu intakten, nativen Geweben. Beginnen Sie damit, die GC2-Zellen dreimal mit PBS zu waschen, um das restliche Kulturmedium zu entfernen.

Anschließend drei Milliliter PBS zur Platte hinzufügen und gleichmäßig verteilen, bevor die Vernetzung erfolgt. Die Zellen in einem 254-Nanometer-Ultraviolett-Vernetzungsgerät mit einer Dosis von 4.000 Millijoule pro Quadratzentimeter bestrahlen. Die Zellen in PBS sammeln und die Zellsuspension bei vier Grad Celsius mit 3000G fünf Minuten lang zentrifugieren.

Nach dem Verwerfen des Überstandes das Pellet wiegen und eine Mindestmasse von 500 Milligramm pro Probe bestätigen. Hoden von vierwöchigen männlichen C57BL6-Mäusen sammeln. Das entkapselte Hodengewebe zweimal mit 5 bis 10 Milliliter DMEM waschen.

Anschließend inkubieren Sie 100 Milligramm Gewebe mit 10 Milliliter DMEM, das ein Milligramm pro Milliliter Kollagenase IV enthält, bei 37 Grad Celsius. Setzen Sie die Verdauung 5 bis 15 Minuten lang fort, bis die Samenkanälchen freigesetzt sind. Danach zentrifugieren Sie die Suspension bei 1000G für eine Minute bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand.

Waschen Sie das Pellet mit 5 bis 10 Milliliter DMEM. Zentrifugieren Sie die Suspension erneut bei 1000×g für eine Minute bei vier Grad Celsius. Und resuspendieren Sie das Pellet in 0,25 % Trypsin, das ein Milligramm pro Milliliter Desoxyribonuklease I enthält. Inkubieren Sie die Suspension bei 37 Grad Celsius für 5 bis 15 Minuten.

Anschießend eine gleiche Menge DMEM mit 10 % FBS hinzufügen, um die enzymatische Verdauung zu stoppen. Die Suspension durch einen 70-Mikrometer-Zellsieb filtern. Die Zellen bei 2000 × g fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 5 bis 10 Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie die Suspension erneut bei 2000G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Einzelzell-Suspension in PBS und verteilen Sie sie gleichmäßig auf eine 15 cm große Kulturschale.

Vernetzen Sie die Hodenzellen wie zuvor für GC2-Zellen gezeigt. Lassen Sie bei den Kontrollzellen die Bestrahlung aus. Sammeln Sie die vernetzten Zellen ein.

Zentrifugieren Sie die Suspension bei 3000G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand. Stellen Sie eine Mindestpelletmasse von 500 Milligramm sicher, indem Sie aus mindestens 10 bis 12 Mäusen isolierte Hodenzellen sammeln. Nach dem Wiegen des Pellets suspendieren Sie diesen erneut in Zelllysepuffer im Verhältnis von 100 Milligramm Pellet pro ein Milliliter Puffer.

Nach dem Wirbeln das Probenmaterial mit einem fokussierten Ultraschallzerreißer oder einem Ultraschallbad so lange sonizieren, bis das Lysat optisch klar erscheint. Anschließend etwa 10 Mikroliter des Lysats für die RNA- und Proteinanalyse in Mikrozentrifugenröhrchen portionieren. 30 Mikroliter vorgewaschene magnetische Kügelchen zum Lysat hinzufügen.

Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten bei 37 Grad Celsius mit sanftem Mischen in einem Hybridisierofen. Stellen Sie die Proben etwa eine Minute lang oder bis die Lösung klar wird auf einen Magnethalter. Überführen Sie das geklärte Lysat in ein frisches Röhrchen.

Stellen Sie das neue Röhrchen auf den Magnethalter. Überführen Sie dann das Lysat in ein anderes Röhrchen, um eventuelle Reste von Perlen zu entfernen. Geben Sie zwei Volumina Hybridisierungspuffer, der auf 37 Grad Celsius temperiert ist, zu jeder Probe hinzu.

Fügen Sie biotinylierte DNA-Sonden im Verhältnis von einem Mikroliter 100-Mikromolar-Sondenstammlösung pro Milliliter Lyssat hinzu. Inkubieren Sie die Proben 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius mit End-over-End-Rotation in einem Hybridisierungsbrutschrank. Spülen Sie unmittelbar vor der Verwendung 100 Mikroliter Streptavidin-Magnetkugeln dreimal mit Zelllysepuffer.

Entfernen Sie nach der letzten Waschung den restlichen Puffer. Zentrifugieren Sie die Hybridisierungsreaktionsgefäße kurz. Geben Sie dann die hybridisierte Probe zu den gewaschenen Kügelchen und mischen Sie vorsichtig.

Bringen Sie die Beadsuspension in das ursprüngliche Röhrchen zurück und inkubieren Sie sie 30 bis 40 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Rühren. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Proben kurz. Stellen Sie die Röhrchen ein bis zwei Minuten auf einen Magnethalter, oder bis die Lösung klar wird.

Danach die Überstände verwerfen. Zum Waschen der Kügelchen ein Milliliter Waschpuffer hinzufügen und die Röhrchen fünf Minuten lang im Hybridisierofen bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach fünf Waschschritten 1–10 % der Kügelchen zur RNA-Analyse in ein frisches Röhrchen überführen.

Schließlich 40 µL 1X SDS-Probenpuffer zu den verbleibenden Perlen hinzufügen. Die Proben 30 Minuten bei 95 °C auskochen, um die Proteine zu eluieren und die Vernetzungen rückgängig zu machen. Die Proteine für die nachgeschaltete Massenspektrometrie-Analyse gewinnen.

Die ChIRP-Massenspektrometrie-Analyse identifizierte in GC2-Zellen mehr als 190 Proteine, die im Vergleich zur negativen Kontrolle angereichert waren. Bei einer UV-Dosis von 4.000 Millijoule pro Quadratzentimeter identifizierte cPDiRT-MS eine selektivere Proteingruppe. Mehr als zwei Drittel dieser Proteine überlappten sich mit denjenigen, die mittels herkömmlicher ChIRP-MS identifiziert wurden.

Die meisten Proteine, die mit mindestens zwei eindeutigen Peptiden identifiziert wurden, wurden reproduzierbar in biologischen Wiederholungen sowohl in GC2-Zellen als auch in Maustestes nachgewiesen. Die Genontologie-Analyse der reproduzierbar identifizierten Proteine ergab biologische Prozesse, die im Allgemeinen mit den bekannten Funktionen von TUG1 übereinstimmen. Der Vergleich der Datensätze aus GC2-Zellen und Maustestes identifizierte 15 Proteine, die gemeinsam angereichert waren.

Die verbesserte Cross-Linking-Immunpräzipitationsequenzierung zeigte klare und spezifische Bindungsspitzen auf dem TUG1-Transkript für PABPC1 und CCT3. cPDiRT ermöglicht es Forschern, Proteine zu identifizieren und zu quantifizieren, die direkt mit einer bestimmten verknüpften RNA in Kulturzellen sowie in nativen Geweben interagieren. Die größte Herausforderung besteht darin, eine effiziente UV-Vernetzung zu erreichen, während gleichzeitig eine hohe Spezifität für direkte RNA-Protein-Interaktionen gewährleistet wird.

Unser Protokoll wird zukünftige Studien unterstützen, diesen Ansatz auf andere RNAs und Gewebe anzuwenden, um die direkte Umsetzung von RNA in Proteine während der Entwicklung und der Fortpflanzung zu untersuchen.