Principles of ortsspezifische Rekombinase (SSR)-Technologie

Hallo, mein Name ist Frank Buchholz. Ich bin Gruppenleiter am Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik. Und unsere Arbeit wird aufrechterhalten.

Unsere Arbeit umfasst zwei Aspekte. Der eine bezieht sich auf das RNA-I-Screening. Der andere bezieht sich auf die Entwicklung ortsspezifischer Rekombinasen für die fortgeschrittene Genom-Editierung.

Mein Hintergrund ist der eines Biologen, eines Molekularbiologen, und ich habe Biologie studiert. Anschließend absolvierte ich meine Promotion am Europäischen Laboratorium für Molekularbiologie in Heidelberg und machte danach mein Postdoc-Stipendium in San Francisco an der UCSF mit Mike Bishop, wo wir an Tiermodellen für Leukämie forschten. Das Max-Puncture-Institut hier in Dresden versucht, sozusagen mindestens zwei verschiedene Aspekte zu verbinden, nämlich Entwicklungsbiologie und Zellbiologie, mit dem grundlegenden Ziel, wie man sagen könnte, zu verstehen, wie Zellen Gewebe bilden.

Das ist im Grunde das übergeordnete Ziel des Instituts hier in Ston. Wir arbeiten also im Wesentlichen in zwei Bereichen. Ein Bereich betrifft RNAi-Tests, bei denen versucht wird, neue Funktionen bisher nicht charakterisierter Gene in biologischen Prozessen zu identifizieren.

Der andere Bereich befasst sich mit der genomischen Gentechnik, um Technologien zu entwickeln, die eine anspruchsvolle Bearbeitung von Genomen mithilfe von standortspezifischen Rekombinasen ermöglichen. Obwohl standortspezifische Rekombinasen bereits in den achtziger Jahren entdeckt wurden – beispielsweise die Cre-Rekombinase, mit der wir arbeiten, die Anfang der achtziger Jahre identifiziert wurde – handelt es sich dabei ursprünglich um ein bakteriophages Protein. Es stammt also ursprünglich von einem Bakteriophagen, also praktisch einem Virus, das Bakterien infiziert.

Es liegt also sehr weit von dem entfernt, was heute verwendet wird, aber es wurde sehr schnell erkannt, dass diese Enzyme sehr interessante Funktionen erfüllen können, die auch in anderen Organismen genutzt werden können. Spleißspezifische Rekombinasen sind Proteine, die an DNA binden und dabei spezifisch an eine bestimmte DNA-Sequenz andocken. Wenn sie an diese Zielsequenzen binden, können sie die DNA schneiden und anschließend die Stellen neu anordnen, sodass sie im Grunde auch den Ligationsprozess durchführen. So kann man mit dieser standortspezifischen Rekombination DNA-Sequenzen neu anordnen, ähnlich wie mit einer Schere und Klebstoff, um DNA-Abschnitte auf eine Weise zusammenzufügen, wie sie zuvor nicht verbunden waren.

Diese ortsspezifischen Rekombinasen, wie ich bereits sagte, wurden ursprünglich in Bakterien entdeckt. Anschließend wurde an Phagen untersucht, ob sie auch in anderen Organismen funktionieren. Und interessanterweise erfüllten sie ihre Funktion auch in anderen Organismen.

Wenn Sie also eine organisationspezifische Rekombinase-Zielsequenz in einem Organismus haben, die Sie in diesen eingebaut haben, erfüllen diese Enzyme ihre Funktion. Die besonders prominente Anwendung dieser organisationspezifischen Rekombinasen, insbesondere derjenigen, die keine Cofaktoren benötigen, wie die Flip-Rekombinase oder die Cre-Rekombinase, die wir als Ausgangspunkt für die hier besprochene Arbeit verwendet haben, liegt darin, dass sie ohne Cofaktoren funktionieren.

Und wenn Sie sie in einem Tier beispielsweise oder in Zellen eines Tieres exprimieren, können sie die Sequenzen erkennen, die sie in diesem Organismus identifizieren, und diese dann direkt ausschneiden und einfügen bzw. bestimmte Sequenzen herausschneiden. Was bisher durchgeführt wurde bzw. worin diese Enzyme sehr erfolgreich eingesetzt wurden, ist beispielsweise die sogenannte bedingte Mutagenese bei Mäusen. Nehmen wir an, Sie haben ein Gen, von dem Sie wissen, dass es ein interessantes Gen ist, und Sie möchten die Funktion dieses Gens herausfinden.

Ein sehr prominentes Experiment ist die Erzeugung einer sogenannten Knockout-Maus. Für diese Technologie, die Sie kürzlich gesehen haben, wurde in diesem Jahr tatsächlich der Nobelpreis verliehen, um im Wesentlichen eine Genlöschung in einer Maus durchzuführen. Manchmal stellt man jedoch fest, dass das betreffende Gen ein essentielles Gen ist und die Maus bereits sehr früh in der Embryogenese stirbt, wenn man es in einem Tier ausschaltet.

Nun, dies zeigt Ihnen, dass Ihr Gen sehr wichtig ist, sagt aber nicht wirklich etwas über die Funktion aus. Eine heute sehr verbreitete Methode, um dies herauszufinden, ist die sogenannte bedingte Gen-Knockout-Strategie. Dabei flankieren Sie Ihr Gen der Interesse mit Target-Sequenzen für diese sequenzspezifischen Rekombinasen.

Das bedeutet, dass in diesen Mäusen das Gen wie bei Wildtyp-Mäusen exprimiert wird. Wenn man diese Mäuse jedoch mit einer Maus kreuzt, die die CRE-Rekombinase beispielsweise unter einer gewebespezifischen Promotorsequenz exprimiert, kann man das Gen von Interesse gezielt in bestimmten Zellen löschen, die anhand der Expression der Rekombinase vordefiniert werden können. Aus diesen Experimenten wissen wir außerdem, dass diese Rekombinationen sehr effizient Sequenzen aus ganzen Organismen entfernen können.

Und dies war eine Voraussetzung für unsere Idee, eine Rekombinase zu entwickeln, die an der von uns vorab definierten Stelle schneidet, was bisher eine der größten Einschränkungen für die Weiterentwicklung der Standortspezifischen Rekombinase darstellte: Man musste die Erkennungs-Sequenz in das Genom einer Zelle eines Organismus einbauen, den man verwenden wollte. Daher fragten wir uns: Können wir diese Hürde überwinden?

Im Wesentlichen wird die molekulare Evolution genutzt. Soweit mir bekannt, werden rekombinierende Enzyme mit spezifischer Bindungsstelle derzeit nicht therapeutisch eingesetzt. Wie bereits erwähnt, liegt dies hauptsächlich daran, dass der Mensch keine Zielstelle besitzt, die von einem der in der Natur verfügbaren Rekombinasen erkannt werden würde.

Sie müssen daher zuerst verändert werden, um sie in einem therapeutischen Umfeld einsetzen zu können. Derzeit stecken wir noch ganz am Anfang, was ihre mögliche Verwendung betrifft. Die Zeit wird zeigen, ob es uns tatsächlich gelingt, diese Enzyme für therapeutische Anwendungen zu entwickeln, und ob dies überhaupt möglich ist.