Name: Erzeugung von GABAergen Neuronen aus vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mittels doxycyclin-induzierbarer ASCL1/DLX2-Expression bei AAVS1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-31T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Lernen Sie die effiziente Differenzierung von hiPSCs zu GABAergen Neuronen mittels doxycyclin-induzierbarer ASCL1/DLX2-Expression am AAVS1-Locus. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare neuronale Modellierung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
	<li>Mertens J, Marchetto MC, Bardy C, Gage FH. Evaluating cell reprogramming, differentiation, and conversion technologies in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2016 Jul;17(7):424-37.</li>
	<li>Barabino A, Flamier A, Hanna R, H&#233;on E, Freedman BS, Bernier G. Deregulation of Neuro-Developmental Genes and Primary Cilium Cytoskeleton Anomalies in iPSC Retinal Sheets from Human Syndromic Ciliopathies. Stem Cell Reports. 2020 Mar 10;14(3):357-73.</li>
	<li>Katbe A, Hanna R, Flamier A, Serhani D, Hamam R, Barabino A, et al. Epigenomic alterations and neural development anomalies in induced pluripotent stem cells from sporadic Alzheimer&#8217;s disease. Development. 2026 Jan 1;153(1):dev204910.</li>
	<li>Liu Y, Flamier A, Bell GW, Diao AJ, Whitfield TW, Wang HC, et al. MECP2 directly interacts with RNA polymerase II to modulate transcription in human neurons. Neuron. 2024 Jun;112(12):1943-1958.e10.</li>
	<li>Flamier A, Bisht P, Richards A, Tomasello DL, Jaenisch R. Human iPS cell-derived sensory neurons can be infected by SARS-CoV-2. iScience. 2023 Sep 15;26(9).</li>
	<li>Wogram E, S&#252;mpelmann F, Khalil A, Flamier A, Fu D, Bell GW, et al. Human iPSC-Derived Microglia Integrate Into Cerebral Organoids and Assume an In&#160;Vivo-Like Phenotype. Eur J Neurosci. 2025 Nov;62(9):e70281.</li>
	<li>Mar&#237;n O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nat Rev Neurosci. 2012 Jan 18;13(2):107&#8211;20. PubMed PMID: 22251963.</li>
	<li>Yang N, Ng YH, Pang ZP, S&#252;dhof TC, Wernig M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 2011 Dec 2;9(6):517-25.</li>
	<li>Busskamp V, Lewis NE, Guye P, Ng AHM, Shipman SL, Byrne SM, et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Mol Syst Biol. 2014 Nov 17;10(11):760.</li>
	<li>Barretto N, Zhang H, Powell SK, Fernando MB, Zhang S, Flaherty EK, et al. ASCL1- and DLX2-induced GABAergic neurons from hiPSC-derived NPCs. J Neurosci Methods. 2020 Mar 15;334:108548.</li>
	<li>Gu J, Rollo B, Liu Z, O&#8217;Brien TJ, Kwan P, Cromer B, et al. Forward programming of human pluripotent stem cells to generate glutamatergic and GABAergic neurons in a tri-culture model with astrocytes. Stem Cell Res Ther. 2026 Feb 25;17(1):125.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&trade; Core Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td>Für Elektroporation/Nukleofektion von hiPSCs.</td></tr><tr><td>6-Well-Kulturplatten</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920300</td><td>Gewebekultur-behandelte Platten für hiPSC-Wartung und -Differenzierung.</td></tr><tr><td>BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78005</td><td>Rekombinantes menschliches Protein für neuronale Reifung; gemäß Herstelleranweisungen vorbereiten und bei einer Endkonzentration von 10 ng/ml verwenden.</td></tr><tr><td>Zellzähler (Countess)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10283</td><td>Zur Zellzählung.</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>VWR</td><td>76468-134</td><td>Zum Pelletieren von Zellen.</td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heracell VIOS 160i oder Äquivalent</td><td>Zellkultur-Inkubator zur Aufrechterhaltung von 37 &deg;C, feuchter Atmosphäre und 5% CO2.</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td>Sterile Kryovials für das Einfrieren von hiPSCs; äquivalente äußere Gewinde 1,8&ndash;2,0 ml Kryovials können verwendet werden.</td></tr><tr><td>Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract</td><td>Bio-Techne</td><td>BME001-05</td><td>Standard-BME-Beschichtungsmatrix, die im Protokoll verwendet wird. Überprüfen Sie die Chargen-spezifische Stammkonzentration aus dem Bio-Techne-Analysenzertifikat und verdünnen Sie in DMEM/F-12 auf eine Arbeitskonzentration von 80 &micro;g/mL.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Wisent</td><td>319-090-CL</td><td>Basismedium, das zur Verdünnung von BME verwendet wird.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethylsulfoxid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Kryoprotektor, der bei der Herstellung des Einfriermediums verwendet wird.</td></tr><tr><td>Donor-Plasmid: induzierbare ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 Targeting-Kassette</td><td>Custom-Plasmid</td><td>Addgene-Zugang steht noch aus</td><td>Custom AAVS1 Donor-Plasmid, das eine durch Doxycyclin induzierbarer ASCL1-P2A-DLX2 Kassette und Selektions-/Reporter-Elemente enthält. Plasmid-Karte und vollständige Sequenz als Ergänzungsdatei oder auf Anfrage bereitstellen.</td></tr><tr><td>Doxycyclin-Hyklat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>Zur Induktion der ASCL1-P2A-DLX2 Expression. Sterile Stammlösung herstellen, aliquotieren, vor Licht schützen, eingefroren lagern und bei einer Endkonzentration von 1 &micro;g/mL verwenden.</td></tr><tr><td>Ethanol (70%)</td><td>Commercial Alcohols / Greenfield Global</td><td>P016EAAN</td><td>Zur Sterilisation im biologischen Sicherheitsschrank; verwenden Sie institutionell genehmigtes 70% Ethanol oder Äquivalent.</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>Mikroskop zur Phasenkontrast- und Fluoreszenzbildgebung der Reporter-Expression und der neuronalen Morphologie.</td></tr><tr><td>GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78058</td><td>Rekombinantes menschliches Protein für neuronale Reifung; gemäß Herstelleranweisungen vorbereiten und bei einer Endkonzentration von 10 ng/mL verwenden.</td></tr><tr><td>hiPSC-Linie PGP1</td><td>EditCo Bio</td><td>PGP1 menschliche iPSC-Linie</td><td>Kommerziell verfügbare Open-Consent-menschliche iPSC-Linie, die in diesem Protokoll verwendet wird; Passagennummer und QC-Status vor dem Editieren und Differenzieren notieren.</td></tr><tr><td>Bildanalyse-Software</td><td>ImageJ/Fiji</td><td>Open-Source; verwendete Version sollte angegeben werden</td><td>Zur Fluoreszenzquantifizierung und zur Verarbeitung repräsentativer Bilder.</td></tr><tr><td>KnockOut&trade; Serumersatz (KOSR)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Bei der Herstellung des Einfriermediums verwendet.</td></tr><tr><td>Laminin-521</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0117</td><td>Optionales Hilfsmittel zur Fehlerbehebung. Nicht Teil des Standard-Beschichtungsprotokolls; kann als Alternative oder Doppelbeschichtungsmatrix verwendet werden, wenn neuronales Ablösen weiterhin auftritt.</td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff-Dewar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Locator 6 Plus oder Äquivalent</td><td>Langzeitlagerung von eingefrorenen hiPSCs in der Dampfphase oder flüssigem Stickstoff gemäß den institutionellen kryogenen Sicherheitsverfahren.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty&trade; Einfriercontainer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Für kontrolliertes Einfrieren von Zellen bei -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; Plus</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>Fütterungsfreies Erhaltungsmedium für hiPSCs.</td></tr><tr><td>Neuro-Induktionsmedium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>08582</td><td>Kommerzielles Neuro-Induktionsmedium, das für die frühe neuronale Induktion verwendet wird.</td></tr><tr><td>Neuro-Reifungsbasismedium (BrainPhys&trade; Neuronales Medium)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>Basismedium für neuronale Reifung; gemäß dem Protokoll mit BDNF, GDNF, NT-3, Doxycyclin und PluriSln-1 ergänzen.</td></tr><tr><td>NT-3 (Neurotropher Faktor 3)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78074</td><td>Rekombinantes menschliches Protein für neuronale Reifung; gemäß Herstelleranweisungen vorbereiten und bei einer Endkonzentration von 10 ng/mL verwenden.</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector&trade; X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>Kit mit Lösung P3 und Küvetten für die hiPSC-Nukleofektion.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Optionales Antibiotikum zur Reduzierung des Risikos bakterieller Kontamination.</td></tr><tr><td>Plasmocin&trade; prophylaktisch</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpp</td><td>Optionales Antibiotikum zur Verhinderung einer Mykoplasma-Kontamination.</td></tr><tr><td>PluriSIn-1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72822</td><td>Pluripotenter Zellüberlebensinhibitor zur Eliminierung undifferenzierter hiPSCs; gemäß Herstelleranweisungen vorbereiten und bei einer Endkonzentration von 20 &micro;M verwenden.</td></tr><tr><td>Puromycin-Dihydrochlorid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113803</td><td>Antibiotikum, das zur Selektion verwendet wird; sterile Stammlösung herstellen, aliquotieren, eingefroren lagern und die endgültige Arbeitskonzentration durch eine Abtötungskurve bestimmen, typischerweise 0,4&ndash;0,6 &micro;g/mL.</td></tr><tr><td>pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNA Plasmid</td><td>Addgene</td><td>85802</td><td>CRISPR/Cas9 Plasmid, das für AAVS1-Targeting verwendet wird; die AAVS1 gRNA-Sequenz in der Plasmid-Karte oder in den ergänzenden Informationen angeben.</td></tr><tr><td>qPCR-Analyse-Software</td><td>Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific</td><td>QuantStudio Design &amp; Analysis Software oder Äquivalent</td><td>Für Ct-Extraktion und RT-qPCR-Analyse; verwendete Softwareversion angeben.</td></tr><tr><td>qPCR-Master-Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td>

erzeugung von gabaergen neuronen aus vom menschen induzierten pluripotenten stammzellen mittels doxycyclin-induzierbarer ascl1/dlx2-expression bei aavs1

Generation of GABAergic Neurons from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Doxycycline-Inducible ASCL1/DLX2 Expression at AAVS1

Erzeugung von GABAergen Neuronen aus vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mittels doxycyclin-induzierbarer ASCL1/DLX2-Expression bei AAVS1

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) offer an unprecedented opportunity to model human neurological diseases in vitro. Reliable generation of ...

Unsere Forschung konzentriert sich darauf, eine reine Population GABAergen Neuronen aus hiPSCs zu erzeugen, um die menschliche neuronale Vielfalt und Erkrankungen zu modellieren. Bestehende Protokolle erfordern eine wiederholte virale Transduktion bei jeder Differenzierung. Dieses Protokoll behebt diese Einschränkung durch die Verwendung einer AAVS1-Zelllinie.Bereiten Sie zunächst das Einfriermedium vor, indem Sie 40 Milliliter Knock-out-Serumersatz oder KOSR und 10 Milliliter DMSO in einem 50-Milliliter-Konischgefäß kombinieren. Homogenisieren Sie das Einfriermedium durch zehnmaliges Auf- und Abpipettieren und lagern Sie die Lösung bei 4 Grad Celsius. Verdünnen Sie anschließend den Basalmembran-Extrakt oder BME in DMEM- und F12-Medium auf eine Endkonzentration von 80 Mikrogramm pro Milliliter. Geben Sie 1 Milliliter des verdünnten BME in jedes Loch einer sechswelligen Platte. Kippen Sie die Platte, um die Lösung gleichmäßig über die gesamte Oberfläche der Löcher zu verteilen, wobei sicherzustellen ist, dass keine unbeschichteten Bereiche verbleiben, und inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.Entfernen Sie mit einer aspirierenden Pipette das Medium aus

generation-gabaergic-neurons-from-human-induced-pluripotent-stem

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Stemgent Dox Inducible Maus TF Lentivirus Set kann embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs), um induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) neu zu programmieren. Hier haben wir das Protokoll für DOX-induzierbare Expression von Maus Umprogrammierung Transkriptionsfaktoren Oct4 zu demonstrieren, Sox2, Klf4 und c-Myc iPS Kolonien, die ausdrückliche gemeinsamen mES Pluripotenz Marker zu generieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Dieses Video zeigt den Prozess der Differenzierung von embryoiden Körpern (EBs) in neuroepitheliale Aggregate und deren anschließende Aufteilung in neuronale und gliale Zellen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Erzeugung von neuronalen und glialen Zellen in vitro, die als Testsysteme für Toxizitätstests sowie zur Bewertung verschiedener Signalwege dienen, die an der Neurotoxizität beteiligt sind.

Erzeugung von Neuronen und Gliazellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Embryoidkörpern

Dieses Video zeigt den Prozess der Induktion menschlicher pluripotenter Stammzellen zur Differenzierung in Neuronen durch Transfektion mit gentechnisch veränderten Lentiviren, die ein neurogenes Transkriptionsfaktor-Gen tragen, unter der Kontrolle eines Tetracyclin-responsiven Elements, gefolgt von einer Behandlung mit einem Tetracyclin-Derivat und einem Reifungsmedium.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in Neuronen mit gentechnisch veränderten Lentiviren

Dieses Verfahren ergibt telencephalen Neuronen durch Durchlaufen Kontrollpunkten, die ähnlich wie beim menschlichen Entwicklung beobachtet werden, sind. Die Zellen werden dürfen spontan zu differenzieren, sind Faktoren, die beide gegenüber der neuronalen Abstammungslinie schieben ausgesetzt, werden isoliert, und werden auf Deckgläschen ausplattiert, um die terminale Differenzierung und Reifung zu ermöglichen.

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Dieses Verfahren zeigt, wie Interneuronen im sich entwickelnden Maus-Vorderhirn mittels in utero-Elektroporation gezielt angegriffen werden können. Diese Technik war besonders effizient, um eine selektive Genexpression in Interneuronen-Subtypen zu erreichen, die für die oberflächlichen Schichten des Kortex bestimmt sind.

Subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Inter

Wir, basierend auf Erkenntnissen aus der Entwicklungsbiologie und veröffentlichten Forschungsergebnissen, haben ein optimiertes Protokoll entwickelt, um effizient A9-Mittelhirn-dopaminerge Neuronen sowohl aus menschlichen embryonalen Stammzellen als auch aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen zu erzeugen, was für die Krankheitsmodellierung und Zellersatztherapie bei der Parkinson-Krankheit nützlich wäre.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Die Modellierung der menschlichen Gehirnentwicklung wurde aufgrund der beispiellosen Komplexität des neuronalen Epithelgewebes behindert. In dieser Arbeit wird eine Methode zur robusten Generierung von Hirnorganoiden beschrieben, um frühe Ereignisse der menschlichen Gehirnentwicklung abzugrenzen und Mikrozephalie in vitro zu modellieren.

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von kortikalen Interneuron Stammväter und Post-mitotische Interneuron Vorstufen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit einer veränderten Embryoid Körper-Monolayer-Methode. Diese Vorfahren/Vorstufen können werden verwendet in-vitro- Eindringmittel sortiert und in Neugeborenen Neokortex für das Studium Schicksal Bestimmung verpflanzt oder in therapeutischen Anwendungen eingesetzt.

Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

Die Neuron-Glia-Interaktionen bei der Neurodegeneration sind aufgrund unzureichender Werkzeuge und Methoden nicht gut verstanden. Hier beschreiben wir optimierte Protokolle zur Gewinnung induzierter Neuronen, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Oligodendrozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen und geben Beispiele für die Werte dieser Methoden zum Verständnis zelltypspezifischer Beiträge bei der Alzheimer-Krankheit.

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

Die Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten GABAergen Neuronen, die durch neuronale Programmierung erzeugt werden, könnte ein möglicher Behandlungsansatz für neurologische Entwicklungsstörungen sein. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung und Transplantation von GABAergen neuronalen Vorläufern aus menschlichen Stammzellen in das Gehirn von neonatalen Mäusen, was eine Langzeituntersuchung transplantierter Neuronen und die Bewertung ihres therapeutischen Potenzials...

Transplantation von GABAergen Neuronen aus humanen Stammzellen in den frühen postnatalen Maushippocampus zur Linderung neurologischer Entwicklungsstörungen

Lernen Sie die effiziente Differenzierung von hiPSCs zu GABAergen Neuronen mittels doxycyclin-induzierbarer ASCL1/DLX2-Expression am AAVS1-Locus. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare neuronale Modellierung.

Erzeugung von GABAergen Neuronen aus vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mittels doxycyclin-induzierbarer ASCL1/DLX2-Expression bei AAVS1 (Video) | JoVE Journal

Erzeugung von GABAergen Neuronen aus vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mittels doxycyclin-induzierbarer ASCL1/DLX2-Expression bei AAVS1

Weitere Videos entdecken