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<ol>
	<li>Alberti S. Phase separation in biology. Curr Biol. 2017;27(20):R1097-102.</li>
	<li>Rabouille C, Alberti S. Cell adaptation upon stress: the emerging role of membrane-less compartments. Curr Opin Cell Biol. 2017;47:34-42.</li>
	<li>Boeynaems S, et al. Protein phase separation: a new phase in cell biology. Trends Cell Biol. 2018;28(6):420-35.</li>
	<li>Hyman AA, Weber CA, J&#252;licher F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 2014;30:39-58.</li>
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	<li>Emmanouilidis L, et al. NMR and EPR reveal a compaction of the RNA-binding protein FUS upon droplet formation. Nat Chem Biol. 2021;17(5):608-14.</li>
	<li>Kathe NC, Novakovic M, Allain FHT. Buffer choice and pH strongly influence phase separation of SARS-CoV-2 nucleocapsid with RNA. Mol Biol Cell. 2024;35(5):ar73.</li>
	<li>Novakovic M, Schmoll J, Emmanouilidis L, Allain FHT. Using solution NMR to characterize biomolecular condensates under biphasic conditions. J Vis Exp. 2026;(230):e70530.</li>
	<li>Novakovic M, et al. LLPS REDIFINE allows the biophysical characterization of multicomponent condensates without tags or labels. Nat Commun. 2025;16(1):4628.</li>
	<li>Emmanouilidis L, et al. A solid beta-sheet structure is formed at the surface of FUS droplets during aging. Nat Chem Biol. 2024;20(8):1044-52.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>jede Marke ist OK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18-Well Kammer-Slides</td><td>ibidi</td><td>81816</td><td>für STORM</td></tr><tr><td>Agarose, niedrige Geliertemperatur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Molekulare Biologie Qualität</td></tr><tr><td>Agarose, ultra rein&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Kanal-Slides</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>für Mikroskopie</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-Farbstoff, NHS-Chemie</td><td>Jena Biosciences</td><td>FP-201-CY5</td><td>zur Proteinmarkierung</td></tr><tr><td>D2O (Deuteriumoxid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>easyFRAP</td><td>Koulouras et al. 2018</td><td>N/A</td><td>https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/</td></tr><tr><td>Everspark 2.0 dSTORM Puffer</td><td>idylle</td><td>KMO|ETE+</td><td></td></tr><tr><td>FUS NTD Protein</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>rekombinant in unserem Labor exprimiert, wie in Ref 13 beschrieben (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)</td></tr><tr><td>Heizblock oder Wasserbad</td><td>jede Marke ist OK</td><td>N/A</td><td>jede Marke oder Modell ist ausreichend</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Bildanalyse-Software</td><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NMR-Spektrometer</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>750 MHz, PATXI Raumtemperatur-Probe, siehe Ref 13 für weitere Details (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)</td></tr><tr><td>NMR-Röhrchen</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>3 mm, Glas</td></tr><tr><td>P10, P20, P200 und P1000 Pipetten</td><td>jede Marke ist OK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pCp-Cy3-Farbstoff&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1706-CY3</td><td>zur Markierung von RNA</td></tr><tr><td>poly(A) RNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>im Labor in vitro transkribiert, Länge ca. 50 Nukleotide, wie in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024 beschrieben</td></tr><tr><td>s2m RNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>im Labor in vitro transkribiert, Länge 45 Nukleotide, Sequenz: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', wie in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024 beschrieben</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 Nucleokapsid-Protein</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>rekombinant im Labor exprimiert, wie in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024 beschrieben</td></tr><tr><td>Software für Plotting (z. B. R)</td><td>R-Project</td><td>Version 4.2.1</td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>STORM Mikroskop</td><td>Nikon N-STORM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ThunderSTORM Plugin</td><td>Ovesny et al. 2014</td><td>N/A</td><td>https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen für die verwendeten Pipetten</td><td>jede Marke ist OK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin</td><td>Bruker</td><td>Version 3.2 und 4.1</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr></tbody></table>

stabilisierende protein- und protein-rna-kondensate in niedrigschmelzenden agarose-hydrogelen für quantitative biophysikalische messungen

Stabilizing Protein and Protein&#8212;RNA Condensates in Low-Melting Agarose Hydrogels for Quantitative Biophysical Measurements

Stabilisierende Protein- und Protein-RNA-Kondensate in niedrigschmelzenden Agarose-Hydrogelen für quantitative biophysikalische Messungen

Biomolecular condensates formed by liquid&#8211;liquid phase separation are increasingly recognized as fundamental organizational units of the cell, with ...

Unsere Forschung konzentrierte sich daher auf die Entwicklung eines standardisierten Agarose-Einbettungsprotokolls, um biomolekulare Kondensate dreidimensional zu immobilisieren, während ihre dynamischen Eigenschaften erhalten bleiben. Kondensate neigen dazu, sich zu bewegen, miteinander zu verschmelzen oder an Oberflächen anzulagern, was bestimmte Messungen erschwert. Dieses Agarose-Einbettungsprotokoll behebt diese Einschränkungen.Wiegen Sie zunächst die geeignete Menge an Niedrigschmelzpunkt-Agarose oder gewöhnlicher Agarose ab und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das Tröpfchenpuffer enthält. Erhitzen Sie den Agarose-Stammlösung auf 80 bis 90 Grad Celsius in einem Heizblock oder Wasserbad und lösen Sie die Agarose vollständig durch Vortexen für etwa 10 Minuten auf. Puffern Sie die Agarose-Stammlösung auf 37 Grad Celsius bei Niedrigschmelzpunkt-Agarose oder auf 55 Grad Celsius bei gewöhnlicher Agarose im Heizblock oder Wasserbad an.Überprüfen Sie, ob die Lösung bei dieser Temperatur klar und flüssig bleibt. Kontrollieren Sie die Temperatur des Agarose-Lagerbestands mit einem Thermometer. Erwärmen Sie alle Materialien, die direkt mit der Agarose in Kontakt kommen, vorab auf etwa 37 Grad Celsius, indem Sie sie zwei bis drei Minuten lang auf einen Heizblock oder in einen Inkubator stellen.Sammeln Sie die erforderlichen Reagenzien zur Herstellung des Tröpfchenpuffers, der Phasentrennbestandteile und zusätzlicher Additive für die Proben. Stellen Sie alle zubereiteten Lösungen auf Raumtemperatur ein. Berechnen Sie die erforderlichen Volumina an Tröpfchenpuffer, Agarose-Stammlösung, Phasentrennbestandteilen und zusätzlichen Additiven für die Probe.Verwenden Sie als Ausgangswerte eine endgültige Agarosekonzentration von 0,3 bis 0,5 % Gewicht pro Volumen für Standard-Biophysikalische-Assays und von 0,8 bis 1,0 % Gewicht pro Volumen für Langzeit-Stabilisierungsexperimente. Geben Sie zuerst die berechneten Volumina an Puffer und Agarose in ein vorgewärmtes 1,5-Milliliter-Röhrchen, gefolgt von Zusatzstoffen und phasenseparierenden Komponenten.Halten Sie das Reagenzglas im Heizblock oder im Wasserbad und pipettieren Sie die Mischung mehrmals auf und ab, wobei Luftblasen vermieden werden sollen. Übertragen Sie die Probe mithilfe einer Pipette schnell auf den Mikroskopieobjektträger. Lassen Sie die Probe fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur erstarren und messen Sie sie anschließend gemäß dem standardisierten Mikroskopieprotokoll.Tropfen, die mit N-Protein und Poly-A in Gegenwart von 0,5 % (Gewicht pro Volumen) niedrig schmelzendem Agarose gebildet wurden, wiesen nach fünf Minuten bei Raumtemperatur etwa die gleiche Größe auf wie Tropfen, die ohne niedrig schmelzende Agarose gebildet wurden. Sechzig Minuten nach der Probenvorbereitung änderten sich die in Agarose eingebetteten Tropfen nicht in ihrer Größe, während die Kondensate ohne niedrig schmelzende Agarose aufgrund von Fusion und Oberflächenbenetzung eine drastische Zunahme der Größe zeigten. Die Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photo-Bleaching und die scheinbare Diffusion der Tropfen waren mit niedrig schmelzender Agarose und ohne niedrig schmelzende Agarose stark ähnlich.Daher ermöglicht dieses Protokoll Forschern, Tröpfchen über große Zeiträume hinweg abzubilden und zu quantifizieren, während ihr dynamisches Verhalten erhalten bleibt. Die größte Herausforderung bei der Durchführung dieses Protokolls besteht darin, sowohl die Agarosetemperatur als auch den Zeitpunkt der Einbettung korrekt zu wählen. Einmal eingebettet, können die Kondensate mit einer Vielzahl von Mikroskopietechniken oder anderen biophysikalischen Methoden, wie beispielsweise der NMR, untersucht werden.

stabilizing-protein-proteinrna-condensates-low-melting-agarose

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In diesem Video zeigen wir die experimentelle Techniken verwendet, um konform, extrazellulären Matrix (ECM) beschichtete Substrate für Zellkulturen herzustellen, und die durchaus in Zugkraft Mikroskopie und Beobachten Auswirkungen der ECM Steifigkeit auf das Verhalten der Zelle.

Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

Dieses Video zeigt eine denaturierende Polyacrylamid-basierte Trenntechnik für Proteine. Diese Technik hilft bei der vorläufigen Identifizierung von Proteinen anhand ihres Molekulargewichts.

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Proteinanalyse: Eine Technik zur Trennung und Visualisierung von Proteinen auf der Grundlage des Molekulargewichts

Dieses Video demonstriert die auf zweidimensionalen halbdenaturierenden Agarosegelelektrophoresen basierende Trennung von Amyloidfasern. Die Technik trennt die polymorphen Amyloid-Aggregate anhand ihrer heterogenen Größe.

Zweidimensionale semi-denaturierende Agarose-Gelelektrophorese: Eine Technik zur Trennung polymorpher Amyloidfasern basierend auf Größenheterogenität

In diesem Video demonstrieren wir eine zweidimensionale Gelelektrophorese-Methode, die einzelne Proteine aus einer komplexen Proteinmischung trennt, die aus Tumorgeweben des humanen nichtfunktionellen Hypophysenadenoms (NFPA) gewonnen wurde. Die Proteine werden in der ersten Dimension anhand ihrer elektrischen Ladung und in der zweiten Dimension anhand von Molekulargewichten weiter getrennt.

Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese: eine Trenntechnik zur Analyse von Proteinen in komplexen Proteingemischen basierend auf Ladung und Molekulargewicht

Traditionelle Techniken zur Herstellung Polyacrylamid (PA)-Gelen, die fluoreszierenden Sonden beinhalten, zwischen denen ein Gel zwischen einem haftenden Oberfläche und einem Glasträger. Hier zeigen wir, dass die Beschichtung diese Folie mit Poly-D-Lysin (PDL) und fluoreszierende Sonden lokalisiert die Sonden innerhalb von 1,6 um von der Geloberfläche.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

Ein Protokoll wird für die Produktion von tRNA (UUU) und die Analyse von tRNA (UUU) im Komplex mit dem Enzym TcdA durch Agarose-Gel-Retardierungs-Assays vorgestellt.

Protein-tRNA-Agarose-Gel-Retardations-Assays für die Analyse der<em&gt; N.</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosin TcdA-Funktion

Eine neue Kraft-Clamp Rheometrie-Technik wird verwendet, um die mechanischen Eigenschaften von geringem Volumen Protein-basierten Hydrogel Proben zwischen ein Voice-Coil-Motor und einen Kraftsensor angebunden zu untersuchen. Ein analoges Proportional-Integral-Derivat (PID) System ermöglicht das Spannen der Kraft erfahren, um das gewünschte Protokoll.

Kraft-Clamp Rheometrie zur Charakterisierung von Protein-basierten Hydrogele

Ein Protokoll wird präsentiert, um schnell die thermische Stabilität von Proteinen in einer Vielzahl von Bedingungen durch thermische Verschiebung Assays und Nano differential scanning Fluorimetry testen. Puffersysteme, Salze und Zusatzstoffe, zusammen sind bestehend aus drei einzigartige Stabilität Bildschirme mit Proteinen zu identifizieren geeignete Puffer für funktionelle und strukturelle Studien untersucht.

Wie Protein zu stabilisieren: Stabilität-Bildschirme für thermische Verschiebung Assays und Nano-Differential Scanning Fluorimetry in den Virus-X-Projekt

Es wurde gezeigt, dass viele intrinsisch ungeordnete Proteine an der Bildung hochdynamischer biomolekularer Kondensate beteiligt sind, ein Verhalten, das für zahlreiche zelluläre Prozesse wichtig ist. Hier stellen wir eine auf Einzelmolekül-Bildgebung basierende Methode zur Quantifizierung der Dynamik vor, mit der Proteine in biomolekularen Kondensaten in lebenden Zellen miteinander interagieren.

Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

Hier präsentieren wir Protokolle für NMR-Methoden, REstricted DIFfusion von INvisible-Species (REDIFINE) und CONdensate DEtectioN mittels SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT), die eine labelfreie, quantitative Charakterisierung biomolekularer Kondensate unter biphasischen Bedingungen ermöglichen, wodurch molekulare Partitionierung, Austauschdynamik, Kondensathydration und Tröpfchenstruktur ohne Sedimentation oder Markierung offenbart werden.

Verwendung von Lösungs-NMR zur Charakterisierung biomolekularer Kondensate unter biphasischen Bedingungen

Obwohl die Steifigkeit der extrazellulären Matrix (ECM) ein entscheidender Regulator des zellulären Verhaltens ist, bleiben die zugrunde liegenden Sensor- und Transduktionsmechanismen unklar. Um dem entgegenzuwirken, stellen wir Protokolle zur Herstellung von polyacrylamid- und silikonbasierten Substraten mit abstimmbarer Steifigkeit bereit, um unser Verständnis des Zell-ECM-Übersprechens zu vertiefen.

Erzeugung von Polyacrylamid- und Silikon-Extrazellmatrixsubstraten mit definierter Steifigkeit für Anwendungen in der Zellbiologie

ETH Zürich.  Hier präsentieren wir eine robuste Methode, um flüssig-flüssige, phasengetrennte Kondensate innerhalb einer porösen, niedrigschmelzenden Agarose-Hydrogelmatrix physisch zu immobilisieren, ohne deren interne Flüssigkeitsdynamik zu stören. Der Ansatz minimiert Tröpfchensedimentation, Koaleszenz und oberflächenbenetzende Artefakte und ermöglicht so reproduzierbare Bildgebung und quantitative biophysikalische Analyse über Stunden hi...

Stabilisierende Protein- und Protein-RNA-Kondensate in niedrigschmelzenden Agarose-Hydrogelen für quantitative biophysikalische Messungen

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