Name: Messung der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen mittels des DR-white-Assays in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Lernen Sie den DR-white-Assay zur Messung von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur in Drosophila melanogaster. Diese Methode unterscheidet zwischen HR, NHEJ und SSA und ermöglicht phänotypische sowie molekulare Analysen in vivo.

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Diese Methode wurde entwickelt, während J.R.L. ein Stipendiat des AFAR Research Grant der American Federation for Aging Research war.&#160;Diese Arbeit wurde außerdem vom National Institute of General Medical Sciences (1R15GM110454 und 1R15GM129628) für J.R.L. unterstützt. Die Abbildungen wurden mit Unterstützung von BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026 erstellt.

1. DR-white-Test
<ol>
	<li>Genetische Kreuzungen (Abbildung 3A) 
	ANMERKUNG: Für Standardprotokolle zur Kultivierung und Genetik von Drosophila siehe &#34;Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics&#34; von Ralph J. Greenspan17. Informationen zu den Genotypen der Stämme finden sich in der Tabelle der Materialien.
	<ol>
		<li>Halten Sie die Fliegen bei 25 °C mit 12-Stunden-Licht-/Dunkelwechsel auf standardisiertem Drosophila-Nährboden, der mit aktiver Hefe bestreut ist.</li>
		<li>Richten Sie fünf Hitzeschockgefäße ein, indem Sie jeweils 8–10 DR-white-weibliche Jungfliegen mit 3–5 Männchen, die ein I-SceI-Transgen tragen, kreuzen (Kreuzung 1, Abbildung 3A). 
		ANMERKUNG: Abhängig von der Anwendung können verschiedene I-SceI-Transgene verwendet werden. In diesem Protokoll wurde das hsp70-I-SceI-Transgen zur Hitzeschockinduktion verwendet11. Um eine unerwünschte Expression von I-SceI in früheren Generationen zu verhindern, ist es wichtig sicherzustellen, dass die DR-white- und I-SceI-Transgene erst in dieser Generation in derselben Fliege kombiniert werden.</li>
		<li>Richten Sie am selben Tag Erweiterungsgefäße eines y w-Stamms ein. Diese dienen als Testfliegen. Drei Erweiterungsgefäße reichen für etwa 60–80 Testkreuzungen aus.</li>
		<li>Kultivieren Sie die Hitzeschockgefäße und die y w-Erweiterungsgefäße 3 Tage lang bei 25 °C.</li>
		<li>Am dritten Tag überführen Sie die Hitzeschockgefäße und die y w-Erweiterungsgefäße auf frischen Nährboden, um eine Reservegruppe anzulegen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hitzeschock/DSB-Induktion 
	ANMERKUNG: Wenn kein hitzeschockinduzierbares I-SceI-Transgen verwendet wird, fahren Sie mit Schritt 1.2.5 fort, der gewöhnlich 3 Tage nach Schritt 1.1.5 durchgeführt wird.
	<ol>
		<li>Alteren Sie die Hitzeschockgefäße 3 Stunden lang bei 25 °C, um sicherzustellen, dass alle Nachkommen die maternale-zygotische Übergangsphase durchlaufen haben.</li>
		<li>Setzen Sie die ursprünglichen Gefäße 1 Stunde lang einem Hitzeschock in einem 38 °C warmen Wasserbad aus. Stellen Sie sicher, dass der Wasserstand mindestens auf Höhe des unteren Endes des Wattepfropfens ist, damit die Larven nicht über die Wasserlinie klettern können.</li>
		<li>Überwachen Sie die Temperatur des Wasserbads alle 15 Minuten und halten Sie sie innerhalb von 38 ± 0,5 °C, da Induktions- und Reparaturergebnisse von Dauer und Temperatur des Hitzeschocks abhängen.</li>
		<li>Stellen Sie die Gefäße wieder auf 25 °C.</li>
		<li>Am folgenden Tag geben Sie ein Drittel eines gefalteten Labor-Tuchs in den Nährboden, um überschüssige Feuchtigkeit aufzunehmen. Falls der Nährboden trocken ist, geben Sie etwa 100 µL Wasser auf das Labor-Tuch. Fügen Sie einen Wattepfropfen zu den y w-Erweiterungsgefäßen hinzu.</li>
		<li>Kultivieren Sie die hitzebehandelten Gefäße weitere 6 Tage bei 25 °C oder bis die Fliegen mit dem Ausschlüpfen beginnen.</li>
		<li>Leeren Sie die Reservengefäße und Erweiterungsgefäße 3 Tage nach dem Umsetzen. Fügen Sie etwa 4 Tage nach dem Leeren einen Wattepfropfen zu den Reserven der y w-Erweiterungsgefäßen hinzu. 
		ANMERKUNG: Falls erforderlich, können die Reservengefäße wie in den Schritten 1.2.1 bis 1.2.6 beschrieben einem Hitzeschock unterzogen und anschließend wie unten beschrieben weiterverarbeitet werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testkreuzungen
	<ol>
		<li>Sammeln Sie 4–5 Tage nach Beginn des Ausschlüpfens die hitzebehandelten Fliegen, die die DR-white- und I-SceI-Transgene tragen, um eine Verzerrung durch den Entwicklungsstadium zu vermeiden. 
		ANMERKUNG: Erfolgreich hitzebehandelte Fliegen, die die DR-white- und I-SceI-Transgene tragen, weisen mosaikartige Augen auf, die durch Reparaturereignisse in Embryo- und Larvenstadien entstehen, die sich in adulten Geweben manifestieren. Der Grad der Mosaikbildung korreliert nicht immer mit Keimbahnreparaturereignissen und sollte daher kein ausschlaggebender Faktor bei der Auswahl der Versuchsfliegen für Testkreuzungen (Schritt 1.3.3) sein.</li>
		<li>Sammeln Sie y w-weibliche Jungfliegen über einen Zeitraum von 5 Tagen. Sammeln Sie 5 weibliche Jungfliegen pro erwarteter Anzahl an Proben. Sammeln Sie aus den Reserven der Erweiterungsgefäße, sobald diese mit dem Ausschlüpfen beginnen.</li>
		<li>Richten Sie Testgefäße ein, indem Sie jeweils einen hitzebehandelten Männchen mit 4–5 y w-weiblichen Jungfliegen kreuzen (Kreuzung 2; Abbildung 3A). Wählen Sie die Männchen zufällig aus der gesammelten Gruppe aus Schritt 1.3.1, um eine Verzerrung durch den Entwicklungsstadium zu vermeiden. Kultivieren Sie die Testkreuzungen bei 25 °C. 
		ANMERKUNG: Um einen Crossing-over zwischen DR-white und I-SceI zu vermeiden, werden gewöhnlich männliche Keimbahnen analysiert; jedoch können auch weibliche Nachkommen untersucht werden. Falls weibliche Nachkommen analysiert werden, werden die Testgefäße der Kreuzung 2 im Verhältnis 2:5 (Weiblich:y w-Männchen) eingerichtet und 5–6 Tage (nächster Schritt) kultiviert, um die Produktivität sicherzustellen.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Produktivität 4 Tage nach dem Einrichten der Testgefäße, um festzustellen, wann diese geleert werden sollten. 
		ANMERKUNG: Stellen Sie sicher, dass genügend Eier abgelegt wurden, um mindestens 20 bewertbare Nachkommen zu erhalten, aber vermeiden Sie eine Überpopulation, da die Fliegen sonst im Nährboden stecken bleiben könnten.</li>
		<li>Wenn die Testgefäße bereit sind (bis zu 4–5 Tage nach dem Einrichten der Testkreuzungen), entsorgen Sie die Fliegen und geben Sie ein Drittel eines gefalteten Labor-Tuchs in den Nährboden, um überschüssige Feuchtigkeit aufzunehmen. 
		ANMERKUNG: Die Männchen können zu diesem Zeitpunkt gesammelt werden, falls weitere Analysen (z. B. molekulare Genotypisierung) erforderlich sind.</li>
		<li>Kultivieren Sie die Testgefäße weitere 5–6 Tage bei 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Auswertung 
	ANMERKUNG: Für jede Bedingung jedes genetischen Experiments (z. B. homozygote Mutanten und heterozygote Kontrollen) werden etwa 25 Testgefäße eingerichtet. Jedes genetische Experiment wird 2–3 Mal wiederholt, und die Daten einzelner Gefäße werden zusammengefasst.
	<ol>
		<li>Bewerten Sie die Nachkommen der Kreuzung 2 (Abbildung 3A) etwa 9 Tage lang, nachdem die ersten Fliegen mit dem Ausschlüpfen begonnen haben.</li>
		<li>Betäuben Sie die Fliegen mittels CO2 oder indem Sie sie in ein leeres Gefäß ohne Nährboden überführen und bei -20 °C mindestens 30 Minuten lang einfrieren. 
		ANMERKUNG: Falls die Fliegen eingefroren werden, können sie bis zu mehrere Tage später bewertet werden.</li>
		<li>Legen Sie die Fliegen auf eine Fliegenunterlage und bewerten Sie die entsprechenden Phänotypen (Abbildung 3A). Berücksichtigen Sie nur Gefäße mit mindestens 20 bewerteten Fliegen im Datensatz.
		<ol>
			<li>Sortieren Sie zur Bewertung zunächst die Fliegen, die die DR-white-Kassette tragen (unter Verwendung von rot fluoreszierendem Protein-positiver [RFP+] Fluoreszenz als Marker), und bewerten Sie anschließend Augen- und Körperfarbe.</li>
			<li>Das mit der DR-white-Kassette verknüpfte y+-Transgen führt zu einer intermediären braunen Körperfarbe, die nicht vollständig dem Wildtyp entspricht. Um zwischen Kein DSB/NHEJ (brauner Körper;&#160;y+&#160;w-) und SSA (gelber Körper;&#160;y-&#160;w-) zu unterscheiden, vergleichen Sie die Fliegen mit y w-Nachkommen, die das DR-white-Chromosom nicht tragen (RFP-). SSA-Ereignisse weisen dieselbe gelbe Färbung wie diese Fliegen auf. Bewerten Sie Fliegen, die dunkler (brauner) als diese sind, als Kein DSB/NHEJ. 
			ANMERKUNG: Abweichungen von den in Abbildung 3A&#160;beschriebenen Phänotypen könnten auf Kontamination hindeuten, und das Gefäß sollte nicht bewertet werden. Obwohl tote Fliegen vollständig bewertet werden können, sollten beschädigte Fliegen verworfen werden, wenn die Phänotypen nicht sicher bestimmt werden können.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. TIDE-Analyse (Abbildung 4)
<ol>
	<li>Extraktion von genomischer DNA (gDNA)18
	<ol>
		<li>Sammeln Sie hitzeschockierte Fliegen (oder Larven), die sowohl das DR-white- als auch das I-SceI-Transgen tragen, wie bei den Nachkommen aus Kreuzung 1 (Abbildung 3A).</li>
		<li>Platzieren Sie jeweils eine einzelne Fliege in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen und schocken Sie kurz (z. B. in einem Trockeneis/Ethanol-Bad oder flüssigem Stickstoff). 
		ACHTUNG: Trockeneis, flüssigen Stickstoff, Ethanol, Isopropanol und andere Chemikalien stets unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und gemäß den Sicherheitsvorschriften der Institution handhaben. 
		PAUSEPUNKT:&#160; Die Proben können bei -80 °C gelagert und später verarbeitet werden, falls erforderlich. Bei der Analyse von Fliegen oder Larven verwenden Sie jeweils eine einzelne Fliege oder Larve pro Probe. Bei der Analyse kleinerer Gewebe (z. B. Gehirne, Imaginalanlagen) sollten Proben gepoolt werden, um die DNA-Ausbeute zu erhöhen.</li>
		<li>Homogenisieren Sie jede Probe in 50 µL Puffer A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5; 100 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]; 100 mM Natriumchlorid; 0,5 % Natriumlaurylsulfat [SDS]) mithilfe eines elektrischen Homogenisators.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Proben 30 min lang in einem Wasserbad bei 65 °C.</li>
		<li>Geben Sie 100 µL Puffer B (1,4 M Kaliumacetat, 4,3 M Lithiumchlorid) zu jeder Probe hinzu und mischen Sie kurz durch Vorsichtiges Umstülpen der Röhrchen. 
		HINWEIS: Bei Verwendung ganzer Fliegen können höhere Volumina erforderlich sein, um die Proben vollständig zu homogenisieren. In diesem Fall sollte das volumetrische Verhältnis von Puffer A zu Puffer B 1:2 betragen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Proben mindestens 30 min lang auf Eis.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben etwa 15 min lang bei 16.000 x g und 4 °C.</li>
		<li>Überführen Sie 125 µL des klaren Überstandes in neue 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Vermeiden Sie dabei jegliches Präzipitat.</li>
		<li>Geben Sie pro 125 µL Überstand 100 µL 100 %igen Isopropanol bei Raumtemperatur hinzu und mischen Sie kurz durch Vorsichtiges Umstülpen der Röhrchen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben etwa 10 min lang bei 16.000 x g und Raumtemperatur.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand, wobei Sie vorsichtig sein sollten, um den DNA-Pellet nicht zu stören. 
		HINWEIS: Der DNA-Pellet ist in diesem Stadium möglicherweise nicht sichtbar. Notieren Sie sich die Ausrichtung der Röhrchen beim Einlegen in die Mikrozentrifuge und aspirieren Sie auf der gegenüberliegenden Seite, wo der Pellet erwartet wird.</li>
		<li>Waschen Sie die Pellets mit 250 µL eiskaltem 70 %igen Ethanol und mischen Sie kurz durch vorsichtiges Umstülpen der Röhrchen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben etwa 5 min lang bei 16.000 x g und 4 °C.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand, wobei Sie vorsichtig sein sollten, um den Pellet nicht zu stören. 
		HINWEIS: Der Pellet ist nach der Ethanolwäsche möglicherweise deutlicher sichtbar. Falls nicht, siehe Hinweis zu Schritt 2.1.11.</li>
		<li>Lassen Sie die Röhrchen ungekapselt bei Raumtemperatur stehen, um restliches Ethanol verdunsten zu lassen. Vermeiden Sie eine Überentwässerung des Pellets, da es sonst möglicherweise nicht vollständig resuspendiert werden kann.</li>
		<li>Geben Sie 20 µL nukleasefreies Wasser hinzu und lassen Sie die Pellets über Nacht bei 4 °C resuspendieren. 
		PAUSEPUNKT: Falls der DNA-Pellet nicht vollständig gelöst ist, kann zusätzliches Wasser hinzugefügt werden.</li>
		<li>Am folgenden Tag drehen Sie die Röhrchen vorsichtig um und messen die DNA-Konzentration. Lagern Sie die Proben bei -20 °C, falls sie nicht sofort verarbeitet werden. 
		HINWEIS: Bei der Extraktion einzelner Fliegen liegt die Ausbeute typischerweise bei etwa 100 ng/µL. Hochwertige Proben sind wichtig. Das Absorptionsverhältnis A260/A280 sollte zwischen 1,7 und 2,0 liegen. Werte außerhalb dieses Bereichs deuten auf Kontaminationen wie Proteine hin. A260/A230 sollte zwischen 2,0 und 2,2 liegen. Werte außerhalb dieses Bereichs weisen auf Kontaminationen wie Ethanol oder Puffer-Salze hin. Proben mit geringerer Ausbeute und schlechter Qualität können zu einer unzureichenden PCR-Amplifikation führen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR (Polymerase-Kettenreaktion)
	<ol>
		<li>Amplifizieren Sie mittels PCR über Sce.white unter Verwendung von 100 ng gDNA und den Primern DR-white_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) und DR-white_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC) gemäß den Herstelleranweisungen. Fügen Sie eine Kontrollprobe mit DR-white-Fliege hinzu (d. h. DR-white-Elternstamm ohne vorhandenes I-SceI-Transgen). Verwenden Sie folgende Zyklenbedingungen: 94 °C für 3 min; {94 °C für 30 s; Touchdown bei 66 °C (-0,5 °C/Zyklus) für 30 s; 72 °C für 30 s} x 16 Zyklen; {94 °C für 30 s; 58 °C für 30 s; 72 °C für 30 s} x 20 Zyklen; 72 °C für 5 min; anschließend bei 12 °C gehalten. 
		HINWEIS: Falls ein anderes Reagenz verwendet wird, müssen die Zyklenbedingungen möglicherweise angepasst werden.</li>
		<li>Laufen Sie etwa 2 µL des PCR-Produkts auf einem 1 %igen Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Agarose-Diagnosegel, um die Amplifikation von Sce.white zu bestätigen. Die erwartete Amplikonlänge beträgt etwa 1,7 kb.</li>
		<li>Reinigen Sie die Sce.white-Amplikone mittels PCR-Reinigung und bestimmen Sie die DNA-Konzentration.</li>
		<li>Sequenzieren Sie das gereinigte PCR-Produkt unter Verwendung des Primers DR-white_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC). 
		HINWEIS: Üblicherweise sequenzieren wir 40 ng gereinigtes PCR-Produkt, dies kann jedoch je nach Anweisungen des Sequenzierungsdienstes variieren.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TIDE-Analyse 
	HINWEIS: Die meisten Fehler bei der Verwendung des TIDE-R-Skripts resultieren aus falscher Codeformatierung.
	<ol>
		<li>Laden Sie die erforderlichen R-Pakete (d. h. sangerseqR und Biostrings) von Bioconductor.org herunter. Verwenden Sie die Suchleiste, um die jeweils aktuellste Version jedes Pakets zu finden.</li>
		<li>Analysieren Sie die Sequenzchromatogramme, um sicherzustellen, dass sie von guter Qualität sind. Analysieren Sie nur Chromatogramme mit geringem bis keinem Hintergrund vor der Bruchstelle.</li>
		<li>Laden Sie die Sequenz-Spurdateien (mit der Dateierweiterung .ab1) herunter und legen Sie alle Sequenzdateien in einem einzigen Ordner auf dem Computer ab. Vereinfachen Sie die Dateinamen so weit wie möglich (z. B. F1, Het2, Hom3), um die Bearbeitung des Skripts in den folgenden Schritten zu erleichtern.</li>
		<li>Öffnen Sie das TIDE-R-Skript (ergänzende Datei 1) in der integrierten Entwicklungsumgebung RStudio (IDE; siehe Tabelle der Materialien). Suchen Sie im Quellcodefenster die Zeile, die mit Control &#60;- beginnt (ergänzende Datei 2A), und geben Sie den exakten Dateinamen der Kontrollsequenz einschließlich der .ab1-Endung in Anführungszeichen ein. 
		HINWEIS: Die „Kontrollsequenz“ ist die Sequenz der PCR aus dem elterlichen DR-white-Stamm ohne I-SceI-Transgen oder Induktion.</li>
		<li>Suchen Sie die Zeile, die mit samplename &#60;- c( beginnt, und geben Sie jeden Dateinamen der Probensequenzen innerhalb der Klammern ein (ergänzende Datei 2A). Fügen Sie die .ab1-Endung hinzu, setzen Sie jeden Dateinamen in eigene Anführungszeichen und trennen Sie die Dateinamen durch Kommas.</li>
		<li>Speichern Sie die bearbeitete TIDE-R-Skriptdatei im selben Ordner wie die zu analysierenden Sequenzen. Halten Sie den Dateinamen einfach, um Fehler in den folgenden Schritten zu vermeiden.</li>
		<li>Navigieren Sie in der IDE über den Reiter „Dateien“ im Ausgabefenster zum TIDE-Ordner (ergänzende Datei 2B).</li>
		<li>Klicken Sie auf das Dropdown-Menü Mehr und wählen Sie Neues Terminal hier öffnen (ergänzende Datei 2C). Ein neues Terminal öffnet sich im Konsolenfenster (unten links).</li>
		<li>Geben Sie im neu geöffneten Terminal „R“ ein und drücken Sie Eingabe (ergänzende Datei 2D).</li>
		<li>Sobald R im Terminal läuft, führen Sie das TIDE-R-Skript aus, indem Sie source(&#34;TIDE_analysis.R&#34;) eingeben und Eingabe drücken (ergänzende Datei 2E). Das Terminal führt das Skript aus und erzeugt eine grafische Darstellung (ergänzende Datei 2F) sowie eine .csv-Datei mit den Rohdaten für jede Probe (ergänzende Datei 2G und ergänzende Datei 3). Die Ausgabedateien werden im selben Ordner wie das R-Skript und die Sequenzdateien gespeichert. 
		HINWEIS: Wird dasselbe R-Skript erneut ausgeführt, überschreiben neu generierte .csv-Dateien ältere. Bei mehreren Analysen derselben Dateien sollte eine Kopie des Ordners angelegt werden.</li>
		<li>Analysieren Sie die Daten, indem Sie jede .csv-Datei öffnen.
		<ol>
			<li>Interpretieren Sie die Rohdaten als Anteile von Indels in der Probensequenz. Die homologe Rekombination durch Genkonversion von der I-SceI-Erkennungssequenz zur wildtypischen SacI-Sequenz führt zur kanonischen 23-bp-Deletion; das Skript gibt diesen HR-Wert in einer separaten Zeile am Ende der Ausgabe an (ergänzende Datei 2G). Der 0-Indel-Wert steht für keine Doppelstrangbruch (DSB) oder NHEJ ohne Indels. Summieren Sie alle anderen Indel-Werte, um NHEJ mit Prozessierung zu erhalten. Die Summe aus NHEJ mit Prozessierung und HR ergibt die Gesamtanzahl der nachweisbaren DSB-Reparaturereignisse.</li>
			<li>Berechnen Sie die Anteile der Reparaturwege unter den nachweisbaren DSB-Reparaturereignissen mithilfe folgender Gleichungen: 
			Anteil NHEJ mit Prozessierung = (NHEJ mit Prozessierung) / (NHEJ mit Prozessierung + HR) 
			Anteil HR = (HR) / (NHEJ mit Prozessierung + HR) 
			HINWEIS: Pro genetisches Experiment (z. B. homozygote Mutanten und heterozygote Kontrollen) werden etwa 10–15 Proben pro Bedingung verwendet. Jedes genetische Experiment wird 2–3 Mal wiederholt, und die individuellen Daten werden zusammengefasst.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen oder nichtfinanziellen Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Vielseitigkeit des DR-white-Systems ist ein entscheidender Faktor für seine bisherige und zukünftige Bedeutung im Bereich der DNA-Reparatur. Erstens ermöglicht die attB-Integrationssequenz im DR-white-Reporterkonstrukt den Forschern, den Reporter an zahlreiche Stellen im Drosophila-Genom21 zu integrieren, wobei bereits mehrere gezielt generierte Linien verfügbar sind22. Zweitens bietet die Verfügbarkeit unterschiedlicher I-SceI-Transgene – wie beispielsweise die Hitzeschock-induzierte Expression über den hsp70-Promotor (vorliegende Studie), die konstitutive Expression über den ubiquitin-Promotor23 oder die prämeiotische Keimbahnexpression über den Bam-Promotor24 – zahlreiche entwicklungs- und gewebespezifische Kontexte zur Untersuchung der Doppelstrangbruch-Reparatur. Unabhängig vom verwendeten &#160;I-SceI-Transgen müssen genetische Kreuzungen sorgfältig geplant werden, um sicherzustellen, dass das I-SceI-Transgen erst im letzten Kreuzungsschritt eingeführt wird, um eine korrekte Induktion der Doppelstrangbrüche zu gewährleisten. Es ist wichtig zu beachten, dass sich die Reparaturhäufigkeiten je nach genomischer Position des DR-white-Reporters und/oder dem verwendeten I-SceI&#160;-Transgen erheblich unterscheiden können. Zukünftige Experimente könnten genomische Positionen und I-SceI-Transgene systematisch vergleichen, um zu ermitteln, ob der genomische Kontext oder die Gewebespezifität die Doppelstrangbruch-Reparatur beeinflusst.
Ein besonderer Vorteil des DR-white-Assays und seiner Derivate besteht darin, dass sie die Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSBs) über homologe Rekombination, NHEJ mit Prozessierung und in den meisten Fällen auch SSA nachweisen können. Obwohl das System ursprünglich zur phänotypischen Detektion von Keimbahnreparaturereignissen konzipiert wurde, ermöglicht es auch die Analyse somatischer Gewebe mittels algorithmischer TIDE-Analyse. Trotz dieser Vorteile gibt es einige Einschränkungen dieses Assays, die berücksichtigt werden müssen. Insbesondere kann der DR-white-Assay die Häufigkeiten von HR unterschätzen. Wie bei anderen genetischen Reportergen-Assays, die nukleaseinduzierte DSBs nutzen, ist eine Reparatur über homologe Rekombination von einer Schwesterchromatide (Intersister-HR) nicht von einem Ereignis ohne DSB oder von NHEJ ohne Prozessierung zu unterscheiden. Daher könnten zumindest einige Ereignisse der Klasse „Kein DSB/NHEJ“ tatsächlich HR-Ereignisse sein. Angesichts dieser Einschränkung sollten Ergebnisse, die genetische Faktoren (wie Mutantenlinien) vergleichen, mit Vorsicht interpretiert werden. Weitere Limitationen des Assays umfassen die Unfähigkeit, prämeiotische Ereignisse zu quantifizieren, die keine lebensfähige Nachkommenschaft hervorbringen. Beispielsweise werden DSB-Ereignisse, die möglicherweise nicht repariert wurden und zum Zelltod führten, in der Nachkommenschaft nicht erfasst. Obwohl die Gesamtfertilität als qualitative Messgröße für Keimbahnzellsterben dienen könnte, sind zellbasierte Assays (wie TUNEL) möglicherweise erforderlich. Außerdem liefert die TIDE-R-Skript-Analyse lediglich den Anteil nachweisbarer Ereignisse in einer Zellpopulation. Um spezifische Indel-Sequenzergebnisse zu bestimmen, ist die Sequenzierung einzelner Reparaturereignisse mittels multiplexer DNA-Sequenzierung notwendig.
Der DR-white-Test hat bereits eine tiefgreifende Wirkung auf die Untersuchung der DSB-Reparatur ausgeübt. Seine Anwendung hat Faktoren identifiziert, die zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen in vielzelligen Organismen beitragen, darunter Alter25, Geschlecht26, DSB-Lokalisation22,26, Lage der Donorsequenz15, Zellzyklus und Gewebetyp26. Zusätzlich haben wir den Test eingesetzt, um mehrere Proteine zu identifizieren, die ebenfalls die Wahl des Reparaturwegs und/oder die Reparatur divergierender Sequenzen in Drosophila beeinflussen, darunter Msh627, Blm28, Rif116 und CtIP16,29. Tatsächlich bietet die gut etablierte Verwendung von Drosophila als genetisches Modellorganismus mit konservierten DNA-Reparaturproteinen ein einfaches, vielzelliges System, um genetische, zelluläre und organismische Faktoren zu untersuchen, die in komplexen biologischen Kontexten zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen beitragen.

Die genomische Integrität wird häufig durch DNA-Schäden gefährdet, wobei Doppelstrangbrüche (DSBs) besonders toxisch sind. Wenn diese Brüche nicht repariert werden, können sie zum Verlust genetischer Information, zu chromosomalen Umstrukturierungen und zum Zelltod führen.1. Zellen haben daher mehrere Signalwege zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSBs) entwickelt. Die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) ligiert direkt die beiden Enden des DSBs, wodurch an der Bruchstelle möglicherweise Insertionen und Deletionen (Indels) entstehen; Einzelstrang&#160;die annealing (SSA) nutzt komplementäre Sequenzen, die die Bruchstelle flankieren, zur Reparatur, was zu Deletionen an der Bruchstelle führt; während die homologe Rekombination (HR) eine homologe Sequenz als Vorlage für die Reparatur verwendet2,3.
Historisch waren Untersuchungen zur DSB-Reparatur auf biochemische Assays4 oder Einzelzell-Systeme wie Bakterien5,6, Hefe7,8 und Kulturen von Säugetierzellen9,10 beschränkt. Obwohl diese Modelle entscheidend zur Identifizierung zentraler Reparaturproteine und ihrer Mechanismen beigetragen haben, fehlt ihnen die biologische Komplexität eines vielzelligen Organismus. Drosophila melanogaster hat sich zu einem verbreiteten vielzelligen Modellsystem für die Untersuchung der DNA-Reparatur entwickelt. Viele der derzeitigen Assays sind jedoch auf spezifische Reparaturwege zugeschnitten11, verwenden große chromosomale Aberrationen wie die P-Element-Ausschaltung12 oder erfordern zeitaufwändige molekularbiologische Analysen13. Das DR-white-Assay behebt diese Einschränkungen, indem es einen einfachen, genetischen Reporter für die DNA-Reparatur in Drosophila14 bereitstellt. Diese Studie stellt einen vollständigen, praktischen und detaillierten Schritt-für-Schritt-Workflow zur Durchführung genetischer und molekularer Analysen zur Messung der DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur mittels des etablierten DR-white-Assays bereit.
Der Test verwendet zwei direkte Wiederholungen des Drosophila white (w)-Gens, das die rotäugige Wildtyp-Farbe verleiht (Abbildung 1). Beide Kopien sind funktionsunfähig: Die erste, Sce.white, enthält eine Insertion mit der Erkennungssequenz der I-SceI-Meganuklease an einer wildtypischen SacI-Stelle und führt einen vorzeitigen Stoppcodon ein; die zweite, iwhite, ist an beiden Enden, dem 5’- und 3’-Ende, abgekürzt und dient als Vorlage für die HR-Reparatur. Zwischen den beiden white-Wiederholungen befindet sich ein Drosophila yellow-Transgen (y+), das die braune Körperfärbung des Wildtyps verursacht. Da die DR-white-Kassette in einen y w-Mutantenhintergrund integriert ist, weisen DR-white-Fliegen phänotypisch einen braunen Körper des Wildtyps und weiße Augen als Mutante auf.
DSBs können an Sce.white induziert werden, indem DR-white-Fliegen mit Fliegen gekreuzt werden, die ein I-SceI-Transgen tragen. Die Reparatur von DSBs in der prämeiotischen Keimbahn kann durch Auswertung der Nachkommen eines Testkreuzes gemessen werden. Die Reparatur mittels NHEJ führt zum elterlichen Phänotyp mit braunem Körper und weißen Augen (Abbildung 1A), während die Reparatur mittels HR die Wildtyp-white-Sequenz wiederherstellt und Nachkommen mit braunem Körper und roten Augen ergibt (Abbildung 1B). Die SSA-Reparatur des DSB oder ein mitotischer Crossover führt zum Verlust des dazwischenliegenden yellow-Transgens, wodurch Fliegen mit gelbem Körper und weißen Augen entstehen (Abbildung 1C). Um Reparaturereignisse in somatischen Zellen zu analysieren, haben wir den Algorithmus „Tracking Indels by DEcomposition“ (TIDE) angepasst, um gezielt NHEJ mit Prozessierung und HR-Reparatur im DR-white-Assay nachzuweisen15,16.
Der DR-white-Test bietet mehrere Vorteile gegenüber zuvor etablierten DNA-Reparaturtests in Drosophila. Da Brüche in der Keimbahn erzeugt und dort repariert werden, können die Reparaturergebnisse leicht durch phänotypische Analyse erfasst werden. Gleichzeitig ist der Test äußerst vielseitig. Obwohl der Test hauptsächlich zur Messung der HR-Reparatur konzipiert ist, kann er alle drei Reparaturwege nachweisen. Wir haben außerdem zwei zusätzliche funktionelle Reparaturvorlagen entwickelt (Abbildung 2). Die Vorlage iwhite.mu enthält 28 stille Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) und erzeugt ebenfalls Nachkommen mit roten Augen (Abbildung 2A), was Untersuchungen der Länge von Genkonversionsstrecken (GCT) und der HR-Reparatur zwischen divergierenden Sequenzen erleichtert14.&#160; Die Vorlage iwhiteΔ9 weist eine neun Basenpaare lange Deletion an der wildtypischen SacI-Stelle auf und führt zu Nachkommen mit orangefarbenen Augen (Abbildung 2B). Diese Eigenschaft ermöglicht es Forschern, die HR-Reparatur aus unterschiedlichen Vorlagen zu verfolgen, ein Merkmal, das ausschließlich dem DR-white-Test eigen ist15.

<table><tbody><tr><td>0,5 mL RNAse/DNAse-freie Stößel</td><td>Fisher Scientific</td><td>12141363</td><td>Zur Homogenisierung von Proben für die gDNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Baumwollbäusche</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>für die Standardzucht von Drosophila</td></tr><tr><td>Drosophila-Peltier-Kühl-Inkubator</td><td>Shel Lab</td><td>SRI6PF</td><td>für die Standardzucht von Drosophila</td></tr><tr><td>Drosophila-Stamm: y[1] w[1]</td><td>Bloomington Drosophila&amp;nbsp; Stock Center</td><td>RRID:BDSC 1495</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila-Stamm: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+}&amp;nbsp;</td><td>LaRocque-Labor</td><td>N/V</td><td>vom LaRocque-Labor durch Standardrekombination des Stammes RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) des Bloomington Drosophila Stock Center erstellt; erhältlich auf Anfrage beim korrespondierenden Autor</td></tr><tr><td>Drosophila-Stamm: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque-Labor</td><td>N/V</td><td>DR-white-Assay in den Stamm RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C) integriert; erhältlich auf Anfrage beim korrespondierenden Autor</td></tr><tr><td>Drosophila-Stamm: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque-Labor</td><td>N/V</td><td>DR-white.mu-Assay in den Stamm RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C) integriert; erhältlich auf Anfrage beim korrespondierenden Autor</td></tr><tr><td>Drosophila-Stamm: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]</td><td>LaRocque-Labor</td><td>N/V</td><td>iwhite&amp;Delta;9-Donor in den Stamm RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C) integriert; erhältlich auf Anfrage beim korrespondierenden Autor</td></tr><tr><td>Flugs Drosophila-Flaschendeckel</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-100</td><td>für die Standardzucht von Drosophila</td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Stereomikroskop (RFP)</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1-FL</td><td>für das übliche Sortieren und Umsiedeln von Drosophila&quot;Fliegen&quot; basierend auf Fluoreszenz</td></tr><tr><td>FlyStuff Drosophila-Fliegenkissen</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td>für das übliche Umsiedeln von Drosophila&quot;Fliegen&quot;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clarke</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>MyBath 4L-Wasserbad</td><td>Midwest Scientific</td><td>MB-2000-4</td><td>für&amp;nbsp; Hitzeschock</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518LY</td><td>für die DNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>Nutri-fly Bloomington Formulierungsmedium</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>für die Standardzucht von Drosophila</td></tr><tr><td>Pellet-Pestle-kabelloser Motorhomogenisator</td><td>DWK Life Sciences</td><td>K749540-0000</td><td>Zur Homogenisierung von Proben für die gDNA-Extraktion</td></tr><tr><td>PP-Flaschen</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td>für die Standardzucht von Drosophila</td></tr><tr><td>Polystyrolgefäße</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td>für die Standardzucht von Drosophila, einschließlich Hitzeschock</td></tr><tr><td>Primer/Oligonukleotid DR-white_8f</td><td>N/V; jeder Oligonukleotid-Synthese-Service ist ausreichend</td><td>N/V</td><td>5'GTGGATCAGGTGATCCAGG</td></tr><tr><td>Primer/Oligonukleotid DR-white_8a</td><td>N/V; jeder Oligonukleotid-Synthese-Service ist ausreichend</td><td>N/V</td><td>5&amp;rsquo;-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC</td></tr><tr><td>Primer/Oligonukleotid DR-white_9f</td><td>N/V; jeder Oligonukleotid-Synthese-Service ist ausreichend</td><td>N/V</td><td>5&amp;rsquo;-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC</td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Posit</td><td>Version 2023.06.1+524</td><td>Kostenlos herunterladbare Version; jede Version von R Studio ist akzeptabel, obwohl die präsentierten Daten mit&amp;nbsp; Version 2023.06.1+524 analysiert wurden</td></tr><tr><td>R Studio-Pakete: Biostrings</td><td>Bioconductor.org (Version 3.24)</td><td>Version 2.76.0</td><td>Das R-Skript fordert den Benutzer zur Installation dieses Pakets auf</td></tr><tr><td>R Studio-Pakete: sangerseqR</td><td>Bioconductor.org (Version 3.24)</td><td>Version 1.44.0</td><td>Das R-Skript fordert den Benutzer zur Installation dieses Pakets auf</td></tr><tr><td>SapphireAMP Fast PCR</td><td>Takara</td><td>RR350B</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>für das übliche Umsiedeln von Drosophila&quot;Fliegen&quot;</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel- und PCR-Reinigung&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr></tbody></table>

messung der reparatur von dna-doppelstrangbrüchen mittels des dr-white-assays in drosophila melanogaster

Measuring DNA Double-Strand Break Repair Using the DR-white Assay in Drosophila melanogaster

Traditionelle Studien zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) beschränken sich häufig auf biochemische Untersuchungen oder einzellige Systeme (z. B. Zellen, Hefe). Um die Untersuchung der DSB-Reparatur in einem vielzelligen Organismus zu ermöglichen, verwenden wir den DR-white-Test in Drosophila melanogaster. Der DR-white-Test ist ein einfacher, aber vielseitiger Reporterassay zur DSB-Reparatur, der eine einzelne I-SceI-Erkennungssequenz enthält, die durch die Expression der I-SceI-Meganuklease gespalten werden kann. Die Expression von I-SceI kann konstitutiv, über Hitzeschock oder unter anderen Promotoren induziert werden, wodurch Untersuchungen der gewebe- oder entwicklungsbedingt spezifischen Reparatur ermöglicht werden. Ein wesentlicher Vorteil des Assays besteht darin, dass er Reparaturereignisse unterscheiden kann, die homologe Rekombination (HR), nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder Einzelstrang-Annealing (SSA) beinhalten. Dieser Artikel stellt eine detaillierte Anleitung für den etablierten DR-white-Assay bereit, einschließlich eines schrittweisen Arbeitsablaufs zur Induktion von DSBs in der prämeiotischen Keimbahn und zur phänotypischen Analyse der Reparaturereignisse durch Auswertung der Nachkommen. Außerdem werden molekulare Analysen der Reparaturereignisse mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Sequenzierung und dem Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE)-R-Skript beschrieben. Diese Anleitung stellt ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der genetischen und molekularen Mechanismen der DNA-Reparatur in einem organismischen Modell dar.

Drosophila-Rad51-Anforderung für die Reparatur durch homologe Rekombination
Erfolgreiche Keimbahnexperimente ergeben die erwarteten phänotypischen Klassen, die in Abbildung 3A gezeigt werden, sowie mindestens 20 bewertbare Nachkommen pro Kolben. Unerwartete Phänotypen oder weniger als 20 bewertbare Nachkommen weisen auf Kontamination oder unzureichende Produktivität hin und sollten gemäß Schritt 1.4.3 ausgeschlossen werden. Für die TIDE-Analyse liefern erfolgreiche Proben ein etwa 1,7 kb großes Amplikon sowie Chromatogramme mit geringem Hintergrund vor der Bruchstelle; DNA mit geringer Ausbeute oder Kontamination sowie verrauschte Chromatogramme sind suboptimal und sollten nicht analysiert werden.
Bei Verwendung des DR-white-Assays mit einer durch Hitzeschock induzierbaren I-SceI-Quelle beträgt die Häufigkeit der HR-Reparatur in Wildtyp-Fliegen 38,5 ± 1,2 % (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts), während SSA etwa 3,2 ± 0,35 % auftritt (Abbildung 3B&#160;und ergänzende Datei 4). Rad51 (codiert durch das Homolog spnA in Drosophila) ist für den Stranginvasions-Schritt der homologen Rekombination erforderlich14,19. Daher sollte der Verlust von Rad51 zu einer ineffizienten HR führen. Tatsächlich wird die HR-Reparatur im DmRad51-/--Hintergrund auf 1,3 ± 0,4 % reduziert, begleitet von einer gleichzeitigen Zunahme der SSA-Reparatur (34,5 ± 1,8 %; Abbildung 3B&#160;und ergänzende Datei 4)14. Dies liegt höchstwahrscheinlich daran, dass Reparaturereignisse, die für die homologe Rekombination vorgesehen sind, alternativ durch Einzelstrang-Annealing der white-Wiederholungssequenzen repariert werden.
Drosophila-CtIP-Beitrag zur effizienten HR-Reparatur in somatischen Geweben
Der TIDE-Algorithmus ermöglicht die Messung der Reparaturwegwahl in somatischen Zellen. In einem nicht-mutierten Hintergrund tritt NHEJ mit Prozessierung in 59,0 % der nachweisbaren Reparaturereignisse auf, und HR tritt in 41,0 % auf (Abbildung 4B&#160;und ergänzende Datei 4). CtIP spielt eine wichtige Rolle bei der Initiation der HR-Reparatur, indem es die DNA-Endresektion fördert20. Entsprechend ist die Wahl des HR-Reparaturwegs im DmCtIP-/--Hintergrund in somatischen Zellen deutlich reduziert, und zwar von 41,0 % bei heterozygoten Kontrollen auf 10,9 % bei homozygoten Mutanten (Abbildung 4B und ergänzende Datei 4)16. Dies legt nahe, dass CtIP bei Drosophila zur HR-Reparatur beiträgt, aber nicht essentiell dafür ist.
<img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig1.jpg" /> 
Abbildung 1: DR-white-DSB-Reporter-Assay und Reparaturergebnisse. Der Direkte Wiederholungs-white-Assay enthält zwei nichtfunktionelle Kopien des white-Gens: Sce.white (mit einer 23-bp-Einfügung, die die I-SceI-Erkennungsstelle enthält und einen vorzeitigen Stoppcodon einführt) und iwhite (5′- und 3′-abgekürzte Donorsequenz). Die Kreuzung von Fliegen, die DR-white und ein I-SceI-Transgen enthalten, erzeugt einen ortsspezifischen Doppelstrangbruch, der phänotypisch oder molekular analysiert werden kann. Die resultierenden Phänotypen sind (A) weißäugige Nachkommen (y+ w−), was auf keinen DSB, Intersister-HR oder NHEJ hinweist; (B) rotäugige Nachkommen (y+ w+), was auf intrachromosomale HR hinweist, die die Wildtyp-SacI-Sequenz aus der iwhite-Donorsequenz wiederherstellt; und (C) gelbkörpige, weißäugige Nachkommen (y− w−), was auf SSA oder einen mitotischen CO hinweist. Abbildung modifiziert nach Do et al.14. Abkürzungen: CO = Crossover; DR-white = Direkte Wiederholung von white; DSB = Doppelstrangbruch; HR = homologe Rekombination; NHEJ = nicht-homologe Endverknüpfung; SSA = Einzelstrang-Annealing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig2.jpg" /> 
Abbildung 2: Abgeleitete Formen des DR-white-Assays. (A) Der DR-white.mu-Assay enthält 28 stille SNPs in der iwhite.mu-Donorsequenz, was zu einer Sequenzdivergenz von 1,4 % zwischen den direkten Wiederholungen führt. Die Genkonversion einzelner Polymorphismen variiert zwischen den HR-Ereignissen und kann durch Sequenzierung bestimmt werden. (B) DR-white mit dem iwhiteΔ9-Donor unterscheidet Interhomolog-Rekombination von intrachromosomaler Rekombination. Eine HR aus dem intrachromosomalen iwhite-Donor stellt die Wildtyp-SacI-Sequenz wieder her und erzeugt Nachkommen mit roten Augen. Eine HR aus dem interhomologen iwhiteΔ9-Donor erzeugt Nachkommen mit orangefarbenen Augen, da die 9-bp-Deletion die Expression von white verringert. Die Abbildung wurde angepasst nach Do et al.14 und Fernandez et al.15. Abkürzungen: DSB = Doppelstrangbruch; HR = homologe Rekombination; SNP = Einzelnukleotid-Polymorphismus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig3.jpg" /> 
Abbildung 3: Experimenteller Arbeitsablauf zur Detektion von DSB-Reparaturereignissen in der prämeiotischen Keimbahn. (A) Kreuzung 1 kombiniert den DR-white-Reporter (oder einen Derivat) mit einem I-SceI-Transgen (in diesem Beispiel auf dem zweiten Chromosom). Nachkommen, die sowohl den DR-white-Test als auch das I-SceI-Transgen tragen, behalten Reparaturereignisse in ihrer Keimbahn und somatischen Geweben. Um einzelne Reparaturereignisse in der prämeiotischen Keimbahn zu analysieren, werden Nachkommen, die beide Transgene tragen, mit y w-Testfliegen gekreuzt (Kreuzung 2), und die Nachkommen werden wie in Abbildung 1 beschrieben ausgewertet. (B) Einzelne Keimbahn-DSB-Reparaturereignisse in Wildtyp-Fliegen (n = 106 Keimbahnen) und DmRad51-homozygoten Mutanten (n = 46 Keimbahnen). **P &#60; 0,01; ****P &#60; 0,0001 nach zweifaktorieller ANOVA, gefolgt vom Sidak’schen Test für multiple Vergleiche. Die Balken stellen Mittelwerte dar; die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Die Daten wurden erneut analysiert aus Do et al.14. Abkürzungen: ANOVA = Varianzanalyse; CO = Crossover; DSB = Doppelstrangbruch; HR = homologe Rekombination; NHEJ = nicht-homologe Endverknüpfung; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; SSA = Einzelstrang-Annealing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig4v2.jpg" /> 
Abbildung 4: Experimenteller Arbeitsablauf zur Detektion von DSB-Reparaturereignissen mittels Tracking of Indels by DEcomposition. (A) Fliegen, die DR-white und ein induziertes I-SceI-Transgen tragen, werden durch Extraktion von gDNA, PCR-Amplifikation über die DSB-Stelle, Sanger-Sequenzierung und TIDE-Analyse mit dem R-Skript analysiert. (B) Repräsentative Daten aus DmCtIP-/-&#160;Mutanten (n = 23) und DmCtIP+/-&#160;heterozygoten Kontrollen (n = 31). Nachweisbare Reparaturereignisse werden als HR plus NHEJ mit Prozessierung berechnet, wobei keine DSB/NHEJ ohne Indels ausgeschlossen werden. ****P &#60; 0,0001 nach zweifaktorieller ANOVA, gefolgt von Sidaks Test für multiple Vergleiche. Die Balken zeigen die Mittelwerte; Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Die Daten wurden erneut analysiert aus Thomas et al.16. Abkürzungen: ANOVA = Varianzanalyse; DSB = Doppelstrangbruch; gDNA = genomische DNA; HR = homologe Rekombination; NHEJ = nicht-homologe Endverknüpfung; PCR = Polymerase-Kettenreaktion; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; TIDE = Tracking of Indels by DEcomposition. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig4largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Zusatzdatei 1: TIDE-R-Skript zur Identifizierung von Insertionen und Deletionen in Sequenzchromatogrammen im Vergleich zu einer Kontrolle ohne DSB. Der vom Benutzer bearbeitbare Kontroll-Dateiname, die Probendateinamen und die I-SceI-Zielsequenz sind nahe dem Ende des Skripts markiert. Erforderliche Eingaben, Ausgabedateien und deren Interpretation werden in Abschnitt 2.3 beschrieben. Die Pakete sangerseqR und Biostrings werden benötigt.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 1.R" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Zusatzdatei 2: Schritt-für-Schritt-Screenshot-Anleitung zum TIDE-R-Skript-Workflow. Die Abbildungen veranschaulichen die in Abschnitt 2.3 beschriebenen Software-Schritte.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 2 (1).pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Zusatzdatei 3: Beispielhafte TIDE-Ausgabe und Berechnungen der Reparaturereignisse. Der Wert „0-Indel“ steht für kein DSB oder NHEJ ohne Indels; die separate Zeile HR repräsentiert das kanonische 23-bp-Löschungsprodukt; und alle verbleibenden Indel-Prozentsätze werden als NHEJ mit Verarbeitung zusammengefasst. Die gesamte nachweisbare Reparatur wird als Summe aus HR und NHEJ mit Verarbeitung berechnet.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 3.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Zusatzdatei 4: Rohdaten zugrundelegend Abbildung 3B und Abbildung 4B, organisiert in separaten bearbeitbaren Arbeitsblättern. Diese Daten wurden erneut aus den zuvor veröffentlichten Studien analysiert, die in den entsprechenden Abbildungserklärungen zitiert sind.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File S4_R1_v2.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Der DR-white-Test ist ein vielseitiger genetischer Reportertest zur Detektion von Reparaturereignissen bei DNA-Doppelstrangbrüchen im vielzelligen Organismus Drosophila melanogaster.

Messung der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen mittels des DR-white-Assays in Drosophila melanogaster

Traditionelle Studien zur Reparatur von DNA-Doppelstrandbrüchen (DSB) beschränken sich häufig auf biochemische Untersuchungen oder einzellige Systeme (z. B. Zellen, ...

Unser Labor beschäftigt sich mit dem Bereich der Genomintegrität und konzentriert sich darauf, wie Zellen DNA-Doppelstrangbrüche reparieren. Im Gegensatz zu anderen DNA-Reparatur-Assays misst der Drosophila DR-white-Assay die Reparatur von Doppelstrangbrüchen in multizellulären Kontexten, einschließlich somatischer und Keimbahnzellen.Nach Abschluss der genetischen Kreuzungen und der Induktion von Doppelstrangbrüchen lassen Sie den Nachwuchs der Testkreuzung nahe beieinander aufwachsen. Beginnend mit dem Schlüpfen der ersten Fliegen bewerten Sie den Nachwuchs über einen Zeitraum von etwa neun Tagen. Betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid oder überführen Sie sie in ein leeres Röhrchen ohne Nahrung und frieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei -20 Grad Celsius ein. Legen Sie die Fliegen auf ein Fliegenkissen. Zur Auswertung identifizieren Sie die Fliegen, die die direkte Wiederholung des white-Gens oder die DR-white-Kassette tragen, anhand der RFP-Fluoreszenz. Bewerten Sie die Augen- und Körperfarbe. Das mit der DR-white-Kassette verknüpfte y-plus-Transgen erzeugt eine intermediäre braune Körperfarbe, die nicht vollständig dem Wildtyp entspricht. Vergleichen Sie diese Fliegen mit RFP-negativen yellow-white-Nachkommen, die das DR-white-Chromosom fehlen haben, um zwischen fehlender Doppelstrangbruch-Bildung oder nicht-homologer Endverknüpfung einerseits und Einzelstrang-Annealing andererseits zu unterscheiden. Klassifizieren Sie Fliegen mit dunklerer, bräunlicher Körperfarbe als ohne Doppelstrangbruch oder mit nicht-homologer Endverknüpfung. Berücksichtigen Sie nur Röhrchen mit mindestens 20 ausgewerteten Fliegen im Datensatz.Für die molekulare Analyse der Reparaturereignisse sammeln Sie die hitzebehandelten Fliegen, die sowohl das DR-white- als auch das I-SceI-Transgen tragen, wie im Nachkommen der Kreuzung 1. Geben Sie einzelne Fliegen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und schocken Sie die Proben kurz in einem Trockeneis-Ethanol-Bad. Homogenisieren Sie jede Probe in 50 Mikroliter Puffer A unter Verwendung eines elektrischen Homogenisators. Inkubieren Sie anschließend die Proben 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 65 Grad Celsius. Geben Sie 100 Mikroliter Puffer B zu jeder Probe hinzu und mischen Sie kurz durch Vorsichtiges Umstülpen der Röhrchen. Inkubieren Sie die Proben mindestens 30 Minuten lang auf Eis, danach zentrifugieren Sie sie etwa 15 Minuten bei 16.000 g und 4 Grad Celsius. Überführen Sie 125 Mikroliter des geklärten Überstandes in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, wobei Sie jegliches Präzipitat vermeiden. Fügen Sie 100 Mikroliter Isopropanol hinzu und mischen Sie kurz durch Umstülpen des Röhrchens. Zentrifugieren Sie die Proben etwa 10 Minuten bei 16.000 g und Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand, wobei Sie darauf achten, den DNA-Pellet nicht aufzuwirbeln. Waschen Sie den Pellet mit 250 Mikroliter eiskaltem 70 %igem Ethanol und mischen Sie vorsichtig durch Umstülpen des Röhrchens. Zentrifugieren Sie die Proben erneut etwa fünf Minuten bei 16.000 g und 4 Grad Celsius und aspirieren Sie den Überstand erneut. Lassen Sie das Röhrchen ungekapt bei Raumtemperatur stehen, um den restlichen Ethanol zu verdunsten, ohne den Pellet zu stark auszutrocknen. Geben Sie danach 20 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu und lassen Sie den Pellet über Nacht bei 4 Grad Celsius resuspendieren. Am folgenden Tag klopfen Sie das Röhrchen vorsichtig an, um die Probe zu mischen, und messen Sie die DNA-Konzentration.Amplifizieren Sie mittels PCR über die Sce.white-Region unter Verwendung von 100 Nanogramm genomischer DNA und den DR-white-Vorwärts- und Rückwärtsprimern. Fügen Sie die genomische DNA einer DR-white-Kontrollfliege hinzu, der das I-SceI-Transgen fehlt, und führen Sie die Reaktion unter geeigneten Zyklenbedingungen durch. Geben Sie etwa 2 Mikroliter des PCR-Produkts auf ein 1 %iges Tris-Acetat-EDTA-Gel, um die Amplifikation von Sce.white zu bestätigen. Überprüfen Sie, ob das Amplikon etwa 1,7 Kilobasen beträgt, und reinigen Sie anschließend die Sce.white-Amplikone. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration und sequenzieren Sie das gereinigte PCR-Produkt unter Verwendung des DR-white-Sequenzierungsprimers.Nachdem die erforderlichen R-Pakete heruntergeladen wurden, untersuchen Sie die Sequenzchromatogramme und wählen Sie nur solche mit geringem bis keinem Hintergrund vor der Bruchstelle für die Analyse aus. Laden Sie die Sequenzspurdateien mit der Endung .ab1 herunter. Speichern Sie alle Dateien in einem einzigen Ordner auf dem Computer und vereinfachen Sie die Sequenzdateinamen so weit wie möglich. Öffnen Sie das Tracking of Indels by DEcomposition oder TIED-R-Skript in der integrierten Entwicklungsumgebung RStudio. Suchen Sie im Quellcodebereich die Zeile, die mit „control“ beginnt, und geben Sie den Namen der Kontrollsequenzdatei exakt so ein, wie sie gespeichert ist, einschließlich der Endung in Anführungszeichen. Suchen Sie die Zeile, die mit „sample name“ beginnt, und geben Sie jeden Namen der Proben-Sequenzdatei innerhalb der runden Klammern ein, wobei jeder Dateiname in separaten Anführungszeichen steht und durch Kommas getrennt ist. Speichern Sie anschließend das bearbeitete TIED-R-Skript im selben Ordner wie die zu analysierenden Sequenzen. Navigieren Sie in der integrierten Entwicklungsumgebung über den Reiter „Files“ im Ausgabebereich zum TIED-Ordner. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü „More“ und wählen Sie „Open New Terminal Here“. Geben Sie im neu geöffneten Terminal „R“ ein und drücken Sie die Eingabetaste. Sobald R läuft, führen Sie das TIED-R-Skript aus, indem Sie den source-Befehl mit dem Skriptdateinamen eingeben und die Eingabetaste drücken. Das Skript erzeugt eine grafische Darstellung sowie eine durch Kommas getrennte Wertedatei (CSV), die die Rohdaten für jede Probe enthält. Öffnen Sie jede CSV-Datei und interpretieren Sie die Rohdaten als die Anteile von Indels in der Sequenzprobe. Identifizieren Sie abschließend die kanonische 23-Basenpaar-Deletion, die separat am Ende der Ausgabe als Homologe-Rekombinations-Wert angegeben ist. Interpretieren Sie den Wert „0 Indel“ als kein Doppelstrangbruch oder nicht-homologe Endverknüpfung ohne Indels, und summieren Sie die verbleibenden Indel-Werte, um die nicht-homologe Endverknüpfung mit Prozessierung zu bestimmen.Erfolgreiche Keimbahnexperimente ergaben die erwarteten phänotypischen Klassen und mindestens 20 bewertbare Nachkommen pro Röhrchen. Bei Wildtyp-Fliegen, die den wärmeschockinduzierbaren I-SceI exprimierten, trat homologe Rekombination in etwa 38,5 % der Nachkommen auf, verglichen mit 3,2 % für die Einzelstrang-Annealing-Reparatur. In einem homozygoten DmRad51-Mutantenhintergrund wurde die Reparatur durch homologe Rekombination auf etwa 1,3 % reduziert, während gleichzeitig die Reparatur durch Einzelstrang-Annealing auf etwa 34,5 % anstieg. In somatischen Zellen eines nicht-mutierten Hintergrunds entfielen etwa 59 % der nachweisbaren Reparaturereignisse auf die fehlerhafte Endverknüpfung mit Prozessierung und 41 % auf homologe Rekombination. In einem homozygoten DmCtIP-Mutantenhintergrund verringerte sich die Wahl des Weges der homologen Rekombination auf 10,9 %.Dieses Protokoll kann auf verschiedene Gewebe, Entwicklungsstadien und genomische Lokalisationen angewendet werden, um Faktoren zu bestimmen, die die Reparatur beeinflussen. Zusätzlich wurde dieser Test angepasst, um Reparaturergebnisse wie Längen von Genkonversionsstrecken und die Präferenz für Reparaturvorlagen zu messen. Dieser DNA-Reparaturtest kann verwendet werden, um verschiedene an der Reparatur beteiligte Faktoren mithilfe genetischer Mutanten in Drosophila zu bestimmen.

measuring-dna-double-strand-break-repair-using-dr-white-assay

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieser Artikel beschreibt, GFP-basierte...

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik zum Nachweis spezifischer DNA-Schadensreaktionsproteine, die an den Stellen von DNA-Doppelstrangbrüchen in menschlichen mononukleären Zellen lokalisiert sind. Die Proteine werden von spezifischen Primärantikörpern erkannt, die wiederum an Fluorophor-markierte Sekundärantikörper binden, die während der mikroskopischen Visualisierung fluoreszieren, was die Visualisierung der Proteine als unterschiedliche Fluoreszenzherde...

Immunfluoreszenzmikroskopie zur Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen

Die embryonalen Epidermis der sehr späten Stadium Drosophila-Embryonen stellt eine in vivo-System für die schnelle Stichwunde Response-Analyse und kann mit genetischen Manipulationen oder chemische Mikroinjektion Behandlungen kombiniert, um Studien in der Wundheilung für die Übersetzung in Säugetier-Modelle voranzubringen.

Mikroinjektion Wound Assay und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Lokalisierung von Epidermal Wundreaktion Reporter in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos.

Reparatur von Doppel-Strang DNA-Brüchen ist ein dynamischer Prozess, erfordern nicht nur Bildung von Reparatur-komplexen in den Pausen, sondern auch deren Auflösung nach die Läsion gerichtet ist. Hier verwenden wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie für vorübergehende und dauerhafte Doppelstrang-Brüche als Werkzeug dieses Genom-Wartung-Mechanismus zu sezieren.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Wir präsentieren ein Protokoll mit einem vorwärts genetischen Ansatz, um Mutanten zu überprüfen, die Neurodegeneration in Drosophila melanogasterzeigen. Es beinhaltet einen Klettertest, histologische Analysen, Genkartierung und DNA-Sequenzierung, um letztendlich neue Gene im Zusammenhang mit dem Prozess des Neuroprotektions zu identifizieren.

In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster

Dieses Protokoll soll die Lebensfähigkeit von Drosophila in jeder Entwicklungsphase vom Embryo bis zum Erwachsenen bewerten. Die Methode kann verwendet werden, um die Lebensfähigkeit verschiedener Genotypen oder Wachstumsbedingungen zu bestimmen und zu vergleichen.

Eine direkte und einfache Methode zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von Drosophila melanogastervom Embryo zum Erwachsenen

Blut - Hirn-Schranke Integrität ist entscheidend für die Funktion des Nervensystems. Bei Drosophila melanogasterwird die Blut-Hirn-Schranke bei der späten Embryogenese durch Gliazellen gebildet. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Bildung und Erhaltung von Blut-Hirn-Barrieren bei D. melanogaster Embryonen und dritten Instarlarven.

Assay für Blut - Hirn-Barriere Integrität in Drosophila melanogaster

Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir, wie die DNA-Doppelstrang-Endsektion während der S/G2-Phase des Zellzyklus mit einer immunfluoreszenzbasierten Methode visualisiert werden kann.

Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging

Dieses Protokoll beschreibt einen extrachromosomalen nicht-homologen Endverbindungs-Assay (NHEJ) und einen homologen Rekombinations-Assay (HR), um die Effizienz von NHEJ und HR in HEK-293T-Zellen zu quantifizieren.

Analyse der nicht-homologen Endverknüpfung und der homologen Rekombinationseffizienz in HEK-293T-Zellen unter Verwendung von GFP-basierten Reportersystemen

Wir präsentieren Protokolle zur Bewertung der Kompetenz des Doppelstrangbruch-Reparaturwegs in Zellen unter Verwendung einer Reihe von lumineszenzbasierten extrachromosomalen Reportersubstraten.

Bewertung der Reparaturaktivität von DNA-Doppelstrangbrüchen mit Hilfe von Hochdurchsatz- und quantitativen Lumineszenz-basierten Reporter-Assays

Lernen Sie den DR-white-Assay zur Messung von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur in Drosophila melanogaster. Diese Methode unterscheidet zwischen HR, NHEJ und SSA und ermöglicht phänotypische sowie molekulare Analysen in vivo.

Messung der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen mittels des DR-white-Assays in Drosophila melanogaster

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