Name: Eine mikrofluidische Plattform zur Untersuchung der Rolle mechanischer Kompression bei Tumor-Immunzell-Interaktionen in einer extrazellulären 3D-Matrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Erfahren Sie, wie eine mikrofluidische Plattform mechanische Kompression bei Tumor-Immunzell-Interaktionen in 3D-Matrix untersucht. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbildgebung von NK-Zell-vermittelter Tumorabtötung unter kontrolliertem mechanischem Stress.

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Diese Arbeit wurde durch eine Förderung des National Cancer Institute (Förderkennzeichen R01CA221346), durch das Lance R. Collins-Stipendium des College of Engineering der Cornell University an FM sowie durch das Cornell Provost’s Fund for Research Resilience an FM unterstützt. Ein Teil dieser Arbeit wurde am Cornell NanoScale Facility durchgeführt, einem Mitglied der National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI), das durch die National Science Foundation (Förderkennzeichen NNCI-2025233) unterstützt wird.

1. Vorbereitung der Gerätekomponenten
<ol>
	<li>Oberflächenaktivierung der Probenladekammer
	<ol>
		<li>Platzieren Sie eine Maske über der Probenladekammer (Schicht 1, L1), sodass nur die Vertiefungen freiliegen.</li>
		<li>Exponieren Sie die freigelegte Schicht 1 für 15 s Sauerstoff-Plasma unter Verwendung der Hochleistungseinstellung (45 W).</li>
		<li>Legen Sie Schicht 1 in eine Petrischale und führen Sie die folgenden Schritte in einem Sicherheitswerkbank durch.</li>
		<li>Behandeln Sie jede Vertiefung mit 10 &#181;L von 1 % Polyethylenimin (PEI) für 10 min</li>
		<li>Entfernen Sie das PEI durch Vakuumabsaugung von den vier Ecken jedes Wells, um Kratzer auf der Glasoberfläche zu vermeiden.</li>
		<li>Waschen Sie die Vertiefungen mit 10 &#181;L von gepufferter Kochsalzlösung (PBS), anschließend die Waschung durch Vakuumabsaugung von der Seite entfernen.</li>
		<li>Behandeln Sie die Vertiefungen mit 10 &#181;L 30 min mit 0,1 % Glutaraldehyd, anschließend den Glutaraldehyd durch Vakuumabsaugung an den Ecken entfernen.</li>
		<li>Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit PBS, wobei nach jedem Spülgang die Flüssigkeit aus den Ecken entfernt wird.</li>
		<li>Wickeln Sie die Petrischale mit Schicht 1 in Aluminiumfolie ein und lassen Sie sie über Nacht im Sicherheitswerkbank.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sterilisation des Metallrahmens
	<ol>
		<li>Tauchen Sie die 38 mm &#215; 88-mm-Metallrahmen und die zwölf M2,5-Schrauben mit Flachkopf über Nacht in 70 %igem Ethanol.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Priming des Druckregelgeräts
	<ol>
		<li>Setzen Sie die Druckregelungseinheit 30 s lang einer Sauerstoff-Plasma-Behandlung im Hochleistungsmodus (45 W) aus.</li>
		<li>Tauchen Sie die Druckregelungseinheit mit den Merkmalen nach unten in entionisiertes (DI) Wasser ein und lassen Sie sie über Nacht stehen, um die Kanäle und Kammern der Druckregelungseinheit mit Wasser zu füllen.</li>
		<li>Am nächsten Tag das Druckregelgerät aus dem entionisierten Wasser, in dem es eingetaucht war, entfernen.</li>
		<li>Füllen Sie ein Mikrofluidik-Reservoir mit 50 mL entionisiertem Wasser. 
		HINWEIS: Das mikrofluidische Reservoir besteht aus einem 50 mL konischen Reagenzglas mit einem speziell angefertigten Deckel, der zwei Schlauchanschlüsse enthält: eine pneumatische Schlauchleitung und eine Fluidzufuhrleitung.</li>
		<li>Verbinden Sie eine mit Luft gefüllte Spritze mit der pneumatischen Schlauchleitung.</li>
		<li>Drücken Sie den Spritzenkolben langsam herunter, um das Reservoir unter Druck zu setzen und destilliertes Wasser durch die Fluidzufuhrleitung zu leiten, bis die Leitung gefüllt ist und Wasser anfängt, aus der Röhre zu tropfen.</li>
		<li>Schließen Sie den vorgefüllten, tropfenden Flüssigkeitszufuhrschlauch über das Polycarbonat-Manifold an den 1,5-mm-Anschluss an der Rückseite der Druckregelungseinheit an.</li>
		<li>Lassen Sie die Druckregelungseinheit und die Verteileranordnung 2 h an der Luft trocknen. Sobald sie vollständig trocken sind, sind die Druckregelungseinheit und die Verteileranordnung bereit für den nächsten Schritt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zusammenbau des Geräts
<ol>
	<li>Herstellung von kollagenen Zellverbänden
	<ol>
		<li>Entfernen und trocknen Sie den Metallrahmen und die Schrauben aus der 70%igen Ethanol-Lösung.</li>
		<li>In der Sicherheitswerkbank drei 600 &#181;L Mikroröhrchen auf Eis. Beschriften Sie die Röhrchen wie folgt: &#34;N&#34; (Neutralisation) &#34;sp&#34; (MCF-7-Sphäroide) und &#34;sp+NK&#34; (MCF-7-Sphäroide mit NK-Zellen)</li>
		<li>Bereiten Sie die Neutralisationsmischung zu, indem Sie 10&#215; das erforderliche Volumen von Medium 199 (M199) und Natriumhydroxid (NaOH) zu dem &#34;N&#34; Röhrchen</li>
		<li>Übertragen Sie das geeignete Volumen der M199:NaOH-Mischung in die &#34;sp&#34; und &#34;sp+NK&#34; Röhrchen, um eine endgültige 1 zu erreichen&#215; Konzentration.</li>
		<li>Tumorsphäroide gewinnen und bei 141 × g zentrifugieren &#215; g für 3 min, um den Sphäroiden Zeit zu geben, sich am Boden des Röhrchens abzusetzen. 
		HINWEIS: Tumorsphäroide von ungefähr 200 &#181;m mit Durchmesser wurden unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Agarose-Mikrotröpfchen-Plattform erzeugt16. Kurz gesagt, 3 &#215; 106 MCF-7-Zellen wurden in eine 36 &#215; 36-Agarose-Mikrobrunnenanordnung, bestehend aus Brunnen 200 &#181;m im Durchmesser und 200 &#181;m in die Tiefe und anschließend sieben Tage lang kultiviert, um die in den Experimenten verwendeten Tumorsphäroide zu erzeugen.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Sphäroide in 200 &#181;L von 50:50 MCF-7/NK komplettem Medium (Tabelle 1 und Tabelle 2).</li>
		<li>Sammeln Sie die NK-Zellen in einem 50-mL-Kegelrohr, zentrifugieren Sie bei 141 &#215; g 4 min lang und zählen Sie die Zellen. 
		HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der NK-Zellen sollte betragen &#62;85 % am Tag des Experiments.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das resultierende Pellet in 200 &#181;L des vollständigen NK-Mediums.</li>
		<li>Geben Sie das entsprechende Volumen der Kollagen-Stammlösung in jedes Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Geben Sie das geeignete Volumen der Zellsuspension zu jedem Reagenzglas hinzu, um ein Endvolumen von 200 &#181;L mit 1,5 mg/mL Kollagen 
		HINWEIS: Die &#34;sp&#34; Suspension enthält nur Tumorsphäroide, während die &#34;sp+NK&#34; Suspension enthält Tumorsphäroide und 1,5 &#215; 106 NK-Zellen</li>
		<li>Vorsichtig durch Pipettieren mischen, um eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und Kollagen zu gewährleisten und die Bildung von Blasen zu minimieren.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gerätezusammenbau und Zellbeladung
	<ol>
		<li>Legen Sie Schicht 1 in den getrockneten Metallrahmen.</li>
		<li>Laden Sie 9&#160;&#181;L der Kollagenmischung in jede Vertiefung.</li>
		<li>Richten Sie die Druckregelungseinheit und die Verteileranordnung mit den Zellkammern in Schicht 1 unter Verwendung eines Mikroskops aus.</li>
		<li>Setzen Sie die getrockneten Schrauben durch das Verteilerstück und in den Metallrahmen ein, um die Druckregelungseinheit und Schicht 1 zwischen dem Verteilerstück und dem Metallrahmen zu befestigen.</li>
		<li>Platzieren Sie das zusammengebaute Gerät in einem 37 &#176;C, 5 % CO₂&#8322; Inkubator für 45 min, um die Kollagenpolymerisation zu ermöglichen.</li>
		<li>Geben Sie 50:50 MCF-7/NK vollständiges Zellkulturmedium über die vier Medienanschlüsse hinzu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Bildgebung von Tumor-Immun-Interaktionen
<ol>
	<li>Platzieren Sie das montierte Gerät im auf einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop befestigten Objekttisch-Inkubator für die Live-Cell-Bildgebung. 
	ANMERKUNG: Der Objekttisch-Inkubator hält während der gesamten Bildgebung eine Temperatur von 37 °C und eine Luftfeuchtigkeit von etwa 50 % aufrecht.</li>
	<li>Platzieren Sie eine sekundäre Gehäusebox über das montierte Gerät, um die innere Umgebung während des gesamten Bildgebungszeitraums bei 37 °C, 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO₂ zu halten.</li>
	<li>Verbinden Sie das Gerät mithilfe des pneumatischen Schlauchs mit dem Druckregler.</li>
	<li>Nehmen Sie Hellfeld- und GFP-Bilder der Tumorsphäroide vor der Kompression auf, um eine Beurteilung der Sphäroid-Deformation nach der Kompression zu ermöglichen.</li>
	<li>Wenden Sie während des gesamten Bildgebungszeitraums einen konstanten Druck von 120 mbar an. 
	ANMERKUNG: Die Software des Druckreglers ermöglicht es dem Benutzer, das Druckprofil und die während des Experiments angewendete Druckstärke festzulegen. Ergänzende Abbildung 1 enthält ein Schema des Druckregelungssystems.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Zeitrafferaufnahme, indem Sie alle 10 Minuten über einen Zeitraum von 18 Stunden Hellfeld- und GFP-Bilder aufnehmen. 
	ANMERKUNG: Die Bilder wurden in der mittleren Z-Ebene jedes Tumorsphäroids mithilfe eines 20×-Objektivs an einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Hellfeld- und GFP-Fluoreszenzbilder wurden mit Belichtungszeiten von 200,1 ms bzw. 298,9 ms aufgenommen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cao J-Z, Zhao W, Xia X-J. Cell-based cancer immunotherapy: milestones, mechanistic insights, and emerging therapeutic directions. Acta Pharmacol Sin. 2026:https://doi.org/10.1038/s41401-026-01811-y.</li>
	<li>Yang R, Yang Y, Liu R, et al. Advances in CAR-NK cell therapy for hematological malignancies. Front Immunol. 2024;15:1414264.</li>
	<li>Neelapu SS, et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2017;377(26):2531-44.</li>
	<li>Sheykhhasan M, Manoochehri H, Dama P. Use of CAR T-cell for acute lymphoblastic leukemia (ALL) treatment: a review study. Cancer Gene Ther. 2022;29(8-9):1080-96.</li>
	<li>Tan S, Li D, Zhu X. Cancer immunotherapy: Pros, cons and beyond. Biomed Pharmacother. 2020;124:109821.</li>
	<li>Chen T, Wang M, Chen Y, Liu Y. Current challenges and therapeutic advances of CAR-T cell therapy for solid tumors. Cancer Cell Int. 2024;24(1):133.</li>
	<li>Peng L, et al. CAR-T and CAR-NK as cellular cancer immunotherapy for solid tumors. Cell Mol Immunol. 2024;21(10):1089-108.</li>
	<li>Basu R, et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 2016;165(1):100-10.</li>
	<li>Dolega ME, et al. Cell-like pressure sensors reveal increase of mechanical stress towards the core of multicellular spheroids under compression. Nat Commun. 2017;8(1):14056.</li>
	<li>Linke JA, Munn LL, Jain RK. Compressive stresses in cancer: characterization and implications for tumour progression and treatment. Nat Rev Cancer. 2024;24(11):768-91.</li>
	<li>Luo M, Cai G, Ho KKY, et al. Compression enhances invasive phenotype and matrix degradation of breast cancer cells via Piezo1 activation. BMC Mol Cell Biol. 2022;23(1):1.</li>
	<li>Ren T, Sun L, Zheng Y, et al. Mechanical forces and immune cells in the tumor microenvironment: from regulation mechanisms to therapeutic strategies. Int J Surg. 2025;111(8):5420-34.</li>
	<li>Helmlinger G, Netti PA, Lichtenbeld HC, Melder RJ, Jain RK. Solid stress inhibits the growth of multicellular tumor spheroids. Nat Biotechnol. 1997;15(8):778-83.</li>
	<li>Pandey M, et al. Mechanical compression regulates tumor spheroid invasion into a 3D collagen matrix. Phys Biol. 2024;21(3):036003.</li>
	<li>Suh YJ, et al. A microfluidic rheometer for tumor mechanics and invasion studies. Lab Chip. 2025;25(22):6018-32.</li>
	<li>Song W, et al. Dynamic self-organization of microwell-aggregated cellular mixtures. Soft Matter. 2016;12(26):5739-46.</li>
	<li>Pandey M, et al. Viscoelastic properties of tumor spheroids revealed by a microfluidic compression device and a modified power law model. Soft Matter. 2026;22(7):1618-29.</li>
	<li>Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-43.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Offenlegungspflichten.

Diese Methode beschreibt die Verwendung einer mikrofluidischen Kompressionsvorrichtung, um die Auswirkungen von Druckspannung auf Tumor-Immun-Interaktionen zu untersuchen. Mit diesem System lässt sich gezielter mechanischer Druck auf Tumorsphäroide ausüben, die in einer dreidimensionalen Kollagenmatrix eingebettet sind. Das Glas-Substrat, das die Basis der Zellkammer (L1) bildet, ermöglicht hochauflösende Live-Cell-Bildgebung und macht die Plattform somit besonders geeignet für Studien, die darauf abzielen, die Motilität...

Die zellbasierte Krebsimmuntherapie ist ein therapeutischer Ansatz, der Immunzellen nutzt, um Krebszellen gezielt anzugreifen1. Dieser Ansatz hat bei der Behandlung von Blutkrebserkrankungen bemerkenswerte Erfolge gezeigt2,3,4. Bei soliden Tumoren konnte dieser Erfolg bisher jedoch noch nicht in gleichem Maße erreicht werden5,6,7. Ein wesentlicher Grund für diese Einschränkung ist das immunsuppressive Tumormikromilieu (TME), das typisch für solide Tumore ist.
Das TME zeichnet sich durch spezifische mechanische Reize aus, die das zelluläre Verhalten regulieren können. Eine effektive Abtötung von Tumorzellen durch Immunzellen erfordert, dass diese Kräfte auf Zielzellen ausüben und eine immunologische Synapse bilden, über die zytotoxische Moleküle abgegeben werden8. Daher könnte das Verständnis darüber, wie mechanische Kräfte die Funktion von Immunzellen beeinflussen, neue therapeutische Ansätze erschließen, um die Wirksamkeit zellbasierter Immuntherapien gegen solide Tumore zu verbessern.
Ein charakteristisches mechanisches Merkmal des festen Tumormikroumfelds (TME) ist die Druckspannung, die das Tumormikroumfeld auf den wachsenden Tumor ausübt9,10. Bisher haben sich die meisten Untersuchungen zur Kompression auf die Auswirkungen auf das Verhalten von Tumorzellen konzentriert10,11. Erst kürzlich hat sich das Interesse darauf verlagert, wie die Kompression Immunzellen innerhalb des TME beeinflusst12. Folglich sind die Mechanismen, durch die Druckspannungen die Migration natürlicher Killerzellen (NK-Zellen), die Bildung des immunologischen Synapses sowie die zytotoxische Aktivität beeinflussen, bislang nur unzureichend verstanden und quantifiziert. Diese Wissenslücke stellt eine wesentliche Einschränkung beim Verständnis dessen dar, wie mechanische Signale im TME genutzt werden können, um die Immunerkennung von soliden Tumoren zu verbessern.
Eine wesentliche Hürde bei der Beantwortung dieser Frage ist das Fehlen experimenteller Plattformen, die kontrollierte und quantifizierbare Kompression in physiologisch relevanten 3D-Mikroumgebungen anwenden können, während gleichzeitig die Echtzeit-Bildgebung von Tumor-Immun-Interaktionen ermöglicht wird. Frühe experimentelle Ansätze zur Untersuchung kompressiver Spannungen bestanden darin, Sphäroide in Agarosegelen einzubetten13. Obwohl diese Methode die physikalische Einschränkung wirksam erfasste, eliminierte sie native Wechselwirkungen zwischen extrazellulärer Matrix (ECM) und Zellen. Dolega et al. wandten osmotischen Druck an, um kompressive Spannungen hervorzurufen; die Sphäroide befanden sich jedoch in Kulturmedium und wiesen daher weiterhin keinen ECM-Zellkontakt auf9. Pandey et al. nutzten einen Transwell-Einsatz und Gewichte, um Sphäroide, die in Kollagen eingebettet waren, zu komprimieren, wodurch die ECM-Zell-Wechselwirkungen erhalten blieben, jedoch die hochauflösende Bildgebung eingeschränkt wurde, die zur Quantifizierung der Beweglichkeit und zytotoxischen Aktivität von Immunzellen erforderlich ist14. Insgesamt verdeutlichen diese Einschränkungen die Notwendigkeit experimenteller Plattformen, die die Echtzeit-Bildgebung der morphologischen Reaktionen von Zellen auf Kompression innerhalb der Tumor-Mikroumgebung (TME) ermöglichen.
Hier stellen wir ein Protokoll für eine mikrofluidische Kompressionsvorrichtung15 vor, die eine gezielte Anwendung von Druckspannung ermöglicht, wobei physiologisch relevante Wechselwirkungen zwischen extrazellulärer Matrix und Zellen erhalten bleiben und hochauflösende Live-Cell-Bildgebung von Immun-Tumor-Dynamiken unterstützt wird. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung der Gerätekomponenten (Abschnitt 1), den Zusammenbau des Geräts (Abschnitt 2) sowie die Bildgebung von Tumor-Immun-Wechselwirkungen (Abschnitt 3). Wir demonstrieren den Arbeitsablauf anhand eines NK-Zell-Killings-Assays an grün fluoreszierendem Protein (GFP)-markierten Tumorsphäroiden. Über diese Anwendung hinaus kann die Plattform leicht angepasst werden, um die Auswirkungen mechanischer Kräfte auf eine breite Palette von Zelltypen und zellulären Interaktionen in dreidimensionalen Mikroumgebungen zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79724</td><td>7 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>10&amp;times; M199-Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td>200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher</td><td>313500100</td><td></td></tr><tr><td>Luftkompressor</td><td>Elveflow</td><td>Jun-Air Model 3 Compressor</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierte X-Y-Mikroskopbühne</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>GeminiBio</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fluidzufuhrschläuche</td><td>Elveflow</td><td>PTFE-Schlauch-Ersatzrolle</td><td>1/16 Zoll Außendurchmesser</td></tr><tr><td>Fluoreszenzlichtquelle</td><td>Excelitas Technologies&amp;nbsp;</td><td>X-Cite series 120 PC unit</td><td></td></tr><tr><td>Folsäure</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>EM Sciences&amp;nbsp;</td><td>16019</td><td>0,10 %</td></tr><tr><td>Harrick-Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td>Einstellung auf hohe Leistung (45 W)</td></tr><tr><td>Pferdeserum (HS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Invertiertes Epi-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>20x-Objektiv (NA = 0,25), betrieben mit der Olympus-CellSens-Software</td></tr><tr><td>Maske</td><td>Artus</td><td>10 Blatt Aluminium-Zwischenlage</td><td>Stärke beträgt 0,0125 Zoll (0,75 mm)</td></tr><tr><td>MCF-7/GFP (Puromycin)-stabile Zelllinie</td><td>GenTarget Inc</td><td>SC050-G</td><td></td></tr><tr><td>Metallrahmen</td><td>Individuell angefertigt&amp;nbsp;</td><td>Individuell angefertigt&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofluidik-Reservoir</td><td>Elveflow</td><td>50 mL Mikrofluidik-Reservoir&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>4x-Objektiv&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (NA = 0,1)</td></tr><tr><td>Myo-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I7508</td><td></td></tr><tr><td>NK-92 MI</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatischer Schlauch</td><td>Elveflow</td><td>Klare Eingangsleitung aus PUR-Polyether</td><td>4 mm Außendurchmesser</td></tr><tr><td>Polyethylenimin (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>1 %</td></tr><tr><td>Druckregler</td><td>Elveflow</td><td>OB1 NK4</td><td>Betrieben mit der Elveflow Smart Interface-Software</td></tr><tr><td>Rattenschwanz-Kollagen Typ I&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354249</td><td>31,3 &amp;micro;L einer 9,6 mg/mL-Stammlösung aus Kollagen</td></tr><tr><td>Schrauben</td><td>Phillips</td><td>M2,5 Pan-Kopf</td><td>12 Schrauben</td></tr><tr><td>Stufeninkubator</td><td>Precision Plastic</td><td>Individuell angefertigt</td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>303134</td><td>In Kombination mit einem männlichen Luer-Integralverschluss mit 3/32 Zoll Außendurchmesser-Buchse von Elveflow</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM-Medien</td><td>ThermoFisher</td><td>12561056</td><td></td></tr></tbody></table>

eine mikrofluidische plattform zur untersuchung der rolle mechanischer kompression bei tumor-immunzell-interaktionen in einer extrazellulären 3d-matrix

A Microfluidic Platform for Studying Roles of Mechanical Compression in Tumor-Immune Cell Interactions in a 3D Extracellular Matrix

Mechanische Kräfte beeinflussen in erheblichem Maße die Fähigkeit von Immunzellen, Tumorzellen im Rahmen der zellbasierten Immuntherapie abzutöten. Um Tumorzellen zu eliminieren, müssen Immunzellen Kräfte auf die Zielzelle ausüben und einen immunologischen Synapsenkontakt bilden, über den zytotoxische Moleküle – einschließlich Granzym B – abgegeben werden. Trotz ihrer Bedeutung ist bisher nur unzureichend verstanden, wie mechanische Signale genutzt werden können, um die immunvermittelte Zerstörung von Tumorzellen zu verstärken. Diese Wissenslücke resultiert teilweise aus dem Mangel an geeigneten Werkzeugen, die in der Lage sind, Zellkulturen unter physiologisch realistischen Bedingungen gezielt mechanischen Belastungen auszusetzen. Hier beschreiben wir eine mikrofluidische Kompressionsvorrichtung, die statische oder dynamische Kompression auf in extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettete Tumorsphäroide ausüben kann und gleichzeitig die Echtzeit-Bildgebung von Tumor-Immun-Interaktionen mittels optischer Mikroskopie ermöglicht.
Die mikrofluidische Plattform besteht aus 12 Kammern (6 Kontroll- und 6 funktionelle). Jede Kammer enthält eine Zellkammer, die sich direkt unterhalb der Druckregelungseinheit befindet. Sphäroide, die in der ECM eingebettet sind, werden in der Zellkammer platziert. Mithilfe dieser Plattform untersuchten wir die Abtötungseffizienz natürlicher Killerzellen (NK-Zellen) gegenüber Brusttumorsphäroiden (MCF-7) unter definiertem mechanischem Druck. Die Ergebnisse zeigten, dass NK-Zellen unabhängig von mechanischem Druck in 1,5 mg/mL Kollagen die primären Verursacher des Zelltods in den Tumorsphäroiden blieben.&#160;Daher lässt sich vermuten, dass NK-Zellen ihre anti-tumorale Aktivität unter kompressiven Spannungen beibehalten können. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Nützlichkeit dieser Plattform zur Untersuchung der Rolle mechanischer Kräfte bei Tumor-Immun-Interaktionen. Laufende Studien zielen darauf ab, die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die es Immunzellen ermöglichen, sich an kompressive Spannungen anzupassen. Die Erkenntnisse aus diesen Studien könnten einen aussichtsreichen therapeutischen Ansatz aufzeigen.

Für die folgenden Experimente wurde ein mikrofluidisches Kompressionsgerät15 verwendet, um Tumor-Immun-Interaktionen in einer physiologisch relevanten 3D-Mikroumgebung zu modellieren und gleichzeitig statische sowie dynamische Kompressionen auf Tumorsphäroide auszuüben (Abbildung 1). Die Bauteile des Geräts (Abbildung 1A1) und deren Montagereihenfolge (Abbildung 1A2) sind in ...

Wir stellen ein Protokoll zur Verwendung einer mikrofluidischen Plattform vor, um Tumor-Immun-Interaktionen in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung zu modellieren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass natürliche Killerzellen (NK-Zellen) ihre anti-tumorale Aktivität unter mechanischer Kompression beibehielten.

Eine mikrofluidische Plattform zur Untersuchung der Rolle mechanischer Kompression bei Tumor-Immunzell-Interaktionen in einer extrazellulären 3D-Matrix

Mechanische Kräfte beeinflussen maßgeblich die Fähigkeit von Immunzellen, Tumorzellen im Kontext der zellbasierten Immuntherapie abzutöten. Um Tumorzellen abzutöten, ...

Unser Ziel ist es, mechanische Signale zu nutzen, um die Fähigkeit von Immunzellen zu verbessern, Tumorzellen effektiv abzutöten. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um die durch Kompressionsstress vermittelte Regulation der Immunzell-vermittelten Zerstörung in verschiedenen Immunzelltypen und Zielzellmodellen zu untersuchen.Platzieren Sie zunächst eine Maske über der Probenladekammer, sodass nur die Vertiefungen freiliegen. Exponieren Sie die maskierte Schicht 1 für 15 Sekunden gegenüber Sauerstoffplasma bei hoher Leistung. Danach legen Sie Schicht 1 in eine Petrischale. Behandeln Sie jede Vertiefung mit 10 Mikrolitern 1 % Polyethylenimin. Nach 10 Minuten entfernen Sie das Polyethylenimin mittels Vakuumabsaugung von den vier Ecken jeder Vertiefung, um ein Kratzen der Glasoberfläche zu vermeiden. Spülen Sie die Vertiefungen mit 10 Mikrolitern PBS und entfernen Sie die Spülflüssigkeit durch Absaugen an der Seite. Anschließend behandeln Sie die Vertiefungen 30 Minuten lang mit 10 Mikrolitern 0,1 % Glutaraldehyd. Entfernen Sie das Glutaraldehyd mittels Vakuumabsaugung von den Ecken. Danach spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit PBS, wobei Sie nach jedem Spülschritt die Flüssigke

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Protokoll, zeigen wir die Herstellung eines Mikroaktor Reihe von vertikal versetzt zum Thema, die die Technologie basiert, und wie diese Basistechnologie können modifiziert werden, um High-Throughput-mechanisch dynamischen Zellkultur in beiden zweidimensionalen und dreidimensionalen Kultur durchzuführen Paradigmen.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

Wir präsentieren, das Verfahren für die Herstellung und den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die heterogene Tumor Mikroumgebungen...

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung<em&gt; In Vitro</em

Interstitielle Fluidstrom wird in soliden Tumoren erhöht und modulieren kann Tumorzellinvasion. Hier beschreiben wir eine Technik, um interstitielle Flüssigkeit fließen, um Zellen in einer Matrix eingebettet zu bringen und dann die seine Auswirkungen auf Zellinvasion. Diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Systeme zu studieren.

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Partikel-Tracking Mikrorheologie können zerstörungs quantifizieren und räumlich zuordnen Veränderungen in der extrazellulären Matrix mechanische Eigenschaften im 3D-Tumormodelle verwendet werden.

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

Die mechanischen Eigenschaften und die Mikrostruktur der extrazellulären Matrix stark beeinflussen 3D Migration von Zellen. In vitro-Verfahren, um die Raumzeit-Zellmigrationsverhalten in biophysikalisch variable Umgebungen sowohl Bevölkerung und einzelnen Zellebenen zu studieren, wird beschrieben.

Concentric Gel-System, um die biophysikalische Rolle der Matrix Mikromilieu auf 3D-Zellmigration Studieren

Kollagen ist eine Kernkomponente des ECM und liefert wichtige Hinweise für verschiedene zelluläre Prozesse im Bereich von Migration auf die Differenzierung und Proliferation. Vorausgesetzt, hier ist ein Protokoll für die Zellen in 3D-Kollagen-Hydrogele und eine fortgeschrittene Technik zur Erzeugung von randomisierten oder ausgerichteten Kollagenmatrizes mit PDMS Mikro einbetten.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Kultivierung einer Bluthirnschranke metastasierenden Tumor Mikro-Umgebung und dann quantifizieren seinen Zustand mit konfokaler Bildgebung und künstliche Intelligenz (Machine Learning).

Quantifizierung der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mit einem Organ-On-A-Chip-3D-Modell, maschinellem Lernen und konfokaler Tomographie

Im Zeitalter der Immuntherapie und des genomischen Profilings von Einzelzellen erfordert die Krebsbiologie neuartige In-vitro- und Computerwerkzeuge, um die Tumor-Immun-Schnittstelle in einem geeigneten raumzeitlichen Kontext zu untersuchen. Wir beschreiben Protokolle zur Nutzung von mikrofluidischen Kokulturen des Tumor-Immunsystems in 2D- und 3D-Umgebungen, die mit einer dynamischen, multiparametrischen Überwachung zellulärer Funktionen kompatibel sind.

Mikrofluidische Co-Kulturmodelle zur Analyse der Immunantwort in in vitro Tumormikroumgebungen

In diesem Protokoll wird ein biomimetischer Mikrofluid-Assay, der eine physiologisch relevante mikrovaskuläre Umgebung reproduzieren und die gesamte Leukozyten-Adhäsions-/Migrationskaskade reproduzieren kann, eingesetzt, um Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen bei entzündlichen Erkrankungen zu untersuchen.

Ein mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion während einer Entzündung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um die Interaktion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen mit einem Tumorsphäroid in einer dreidimensionalen (3D) Kollagen-I-Matrix zu untersuchen, mit der Möglichkeit, den Einfluss löslicher und physikalischer Eigenschaften der Mikroumgebung auf die Zellinvasion zu vergleichen.

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Erfahren Sie, wie eine mikrofluidische Plattform mechanische Kompression bei Tumor-Immunzell-Interaktionen in 3D-Matrix untersucht. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbildgebung von NK-Zell-vermittelter Tumorabtötung unter kontrolliertem mechanischem Stress.

Eine mikrofluidische Plattform zur Untersuchung der Rolle mechanischer Kompression bei Tumor-Immunzell-Interaktionen in einer extrazellulären 3D-Matrix (Video) | JoVE Journal

Eine mikrofluidische Plattform zur Untersuchung der Rolle mechanischer Kompression bei Tumor-Immunzell-Interaktionen in einer extrazellulären 3D-Matrix

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