In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

In vivo ist die Teratombildung der Goldstandard für die Bestimmung der Pluripotenz einer Zelle oder der Fähigkeit, alle drei Keimblätter zu bilden. Teratome sind auch ein großes Hindernis für die Stammzelltransplantation, und derzeit ist wenig über ihre Bildung in der Wachstumskinetik bekannt. Sobald undifferenzierte Zellen in die Wirtsumgebung implantiert wurden, hat die Entwicklung von biolumineszierenden Reportern, Gentransduktion und hochempfindlicher ladungsgekoppelter Bauelement- oder CCD-Fotografie eine nicht-invasive, repetitive Bewertung der Migration, Proliferation und Differenzierung von Zellorten in vivo ermöglicht.

In diesem Video zeigen wir ein detailliertes Protokoll zur effektiven Verfolgung der Proliferation transplantierter humaner embryonaler Stammzellen in einer lebenden Maus. Hallo, ich bin Kit Wilson aus dem Labor von Joseph Wu in den Abteilungen für Medizin und Radiologie der Stanford University. Heute zeigen wir Ihnen Verfahren zur Bildgebung menschlicher embryonaler Stammzellen, sowohl in vitro als auch nach der Transplantation in eine lebende Maus.

Diese Verfahren umfassen die folgenden Schritte: In-vitro-Biolumineszenzbildgebung von humanen embryonalen Stammzellen, Mauspräparation und Stammzellinjektion für die In-vivo-Bildgebung und In-vivo-Biolumineszenzbildgebung von transplantierten Zellen. Beginnen wir also damit, einige der Schlüsselkomponenten dieser Verfahren zu überprüfen. Um eine Biolumineszenz-Bildgebung von menschlichen embryonalen Stammzellen durchzuführen, müssen Sie zunächst Zellen erhalten, die stabil EL-Luziferase-Reportergene wie Glühwürmchen-Luziferase exprimieren, angetrieben von einem konstitutiven Promotor wie Ubiquitin oder eef one alpha-Kultur, Ihre EL-Luziferase-positiven menschlichen embryonalen Stammzellen unter feederfreien Bedingungen.

In der Regel folgen wir dem Standard-Y-Zellprotokoll und verwenden Sechs-Well-Platten, die mit Matrigel beschichtet sind, wobei entweder Konditionsmedien oder kommerzielle Feeder-freie Medien verwendet werden. Um die Luziferase-positiven Zellen zu erkennen, müssen Sie den Reporter Sonde d Lucifer haben, der bereits darauf vorbereitet ist, dies zu tun. Aliquot Lucifer in einem bis 1,5 Milliliter Präparaten in einer Endkonzentration von 45 Milligramm pro Milliliter.

Bewahren Sie die Aliquoten bei Nichtgebrauch bei minus 20 Grad Celsius auf und vermeiden Sie Lichteinwirkung, indem Sie sie bei Nichtlagerung mit einem Papiertuch abdecken. Um die Luciferase-positiven Zellen sichtbar zu machen, verwenden wir zwei verschiedene Bildgebungssysteme. Für das In-vitro-Verfahren verwenden wir ein steriles Bildsystem, den Xeno IVUS 50, und für das In-vivo-Verfahren gehen wir zum Stanford Center für die In-vivo-Bildgebung, um den Xeno IVUS 200 zu verwenden.

Dieses System umfaßt eine integrierte Isof-Lorrin-Apparatur und eine Induktionskammer für die vorübergehende Anästhesie von Kleintieren. Okay, ich habe mich selbst erwischt. Kommen wir zur In-vitro-Biolumineszenz-Bildgebung.

Für die In-vitro-Biolumineszenz-Bildgebung ist es wichtig, sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Daher sollte das Bildgebungssystem steril sein, vorzugsweise in einem Zellkulturraum. Entfernen Sie vor der Bildgebung das Zellmedium und fügen Sie gerade so viel PBS hinzu, dass die Zellen bedeckt sind.

Geben Sie beispielsweise einen Milliliter PBS in jede Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen, die Ihre menschlichen embryonalen Stammzellkulturen enthält. Das Verhältnis von Derin zu PBS sollte eins zu 100 sein. Geben Sie also 10 Mikroliter Tau-Derin in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte.

Denken Sie daran, das Derin zu filtern, bevor Sie es zu Ihren Kulturen hinzufügen. Nachdem Sie eine Minute gewartet haben, setzen Sie die Platte in die Kammer ein, nehmen Sie ein Bild mit einer Belichtungszeit von 10 Sekunden auf und stellen Sie die Belichtungszeit ein. Wenn das Signal gesättigt oder zu schwach ist, spiegelt das Biolumineszenzsignal die Zellzahl wider, so dass Quantifizierungsassays durchgeführt werden können, die das Signal mit unterschiedlichen Zellzahlen korrelieren.

Dabei handelt es sich um Bilder, die von einem typischen Quantifizierungsassay stammen. Oben links ist ein helles Feld einiger menschlicher embryonaler Stammzellkolonien zu sehen. Wir wissen, dass diese Zellen unser Reportergen tragen, da sie nachträglich grün fluoreszieren.

Das Sortieren der blauen Farbe ist eine saftige Färbung. Die untere Tafel zeigt Kulturbrunnen mit zunehmender Anzahl von Zellen. Die Zellzahlen korrelieren mit dem Biolumineszenzsignal, wie in dieser Grafik zu sehen ist.

Diese Korrelation gibt uns einen semiquantitativen Assay zur Verfolgung der Zellproliferation in vivo. Okay, das ist das In-vitro-Verfahren. Kommen wir nun zur In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung

Um die Teratombildung in vivo abzubilden, werden wir unsere humanen embryonalen Stammzellen, die das Glühwürmchen-Luciferase-Reportergen exprimieren, in den Rücken einer Skid-Maus injizieren und mit dem IVU-System biolumineszierende Bilder aufnehmen. Wenn Sie bereit sind, die Zellen zu transplantieren, verwenden Sie den Bandscheibenraum oder Kollagenase, um die Zellen zu lockern, waschen Sie sie mehrmals und suspendieren Sie sie in einer Eins-zu-Eins-Mischung aus Wachstumsfaktor, reduziertem Matrigel und dmm. In der Regel mischen wir die Zellen zuerst mit gekühltem DMM und fügen dann das Matrigel hinzu.

Für jede subkutane Stelle injizieren wir 200.000 Zellen, die in einem Volumen von 50 bis 100 Mikrolitern der Matrigel-DMM-Mischung suspendiert sind. Die Zellenanzahl kann je nach Anwendung angepasst werden. Denken Sie daran, vor der Injektion alles auf Eis zu legen.

Sobald die Zellen bereit sind, betäuben wir die Maus, indem wir sie in die Induktionsbox legen. Bei eingeschaltetem Iso-Fluor-Durchfluss. Nach etwa einer Minute ist die Maus narkotisiert und kann mit kontinuierlichem Iso-Fluor auf den Operationstisch gelegt werden.

Da bei natürlichen Autofluoreszenzen, die das biolumineszierende Bild verdecken können, müssen wir die Haare von der Rückseite der Maus entfernen. Der einfachste Weg, dies zu tun, ist die Verwendung eines Elektrorasierers, aber Sie können auch Haarentfernungsgele verwenden, die Sie mit Alkohol abwischen, um die Haut anschließend zu sterilisieren. Ziehen Sie als Nächstes Ihre hundert Mikroliter Zellsuspension in einer Spritze auf. 23 bis 27 Gauge Nadeln funktionieren am besten, da sie nicht mit den Zellen verstopfen.

Injizieren Sie nun die Zellen unter der Haut in den Rücken der Maus, da die Haut ziemlich locker ist. Kneifen und dehnen Sie mit Daumen und Zeigefinger den Bereich, den Sie injizieren möchten. Injizieren Sie direkt unter die Haut und achten Sie darauf, nicht zu tief einzustechen.

Versuchen Sie auch, zu verhindern, dass die Nadel aus der Injektionsstelle rutscht, während Sie den Kolben drücken. Dadurch wird verhindert, dass ein Loch in der Haut entsteht, durch das die Zellen austreten können. Wenn Sie versuchen, nach der Injektion der Zellen erneut zu injizieren, warten Sie einige Stunden, bis die Maus aufwacht und herumläuft, bevor Sie sie wieder in den Ruhezustand versetzen.

Bei der Biolumineszenz-Bildgebung wird auf diese Weise eine Isofluran-Toxizität vermieden. Okay, jetzt sind wir bereit, mit der In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung der injizierten Zellen fortzufahren. Für die folgenden bildgebenden Untersuchungen verwenden wir eine Maus, die bereits begonnen hat, die Bildung eines Teratoms für die Biolumineszenz-Bildgebung des ganzen Tieres zu zeigen.

Wir führen eine intraperitoneale Injektion von Lucifer mit 375 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht durch. Daher müssen wir das anästhesierte Tier wiegen, um die Dosierung zu berechnen, den Tatluzifer in das Bauchfell injizieren, direkt vor der Mittellinie, die Nadel zurückziehen und sicherstellen, dass kein Blut vorhanden ist, was ein Hinweis darauf wäre, dass Sie ein inneres Organ geschädigt haben. Wenn die Maus zu wachen beginnt, legen Sie sie einfach wieder in die Induktionskammer und warten Sie ein oder zwei Minuten.

Bereiten Sie sich auf die Bildgebung vor, indem Sie mattschwarzes Papier in die Bildgebungsbox legen, um das Licht zu absorbieren, das nicht von den menschlichen embryonalen Stammzellen emittiert wird. Bei Mäusen tritt das maximale Biolumineszenzsignal in der Regel 15 bis 40 Minuten nach der Injektion auf. Platzieren Sie die Maus also nach 10 bis 15 Minuten mit der Rückseite nach oben in der Bildgebungskammer mit Iso-Fluor.

Beginnen Sie mit einer Belichtungszeit von 10. Wenn das Signal gesättigt ist, versuchen Sie, die Belichtungszeit zu verringern. Wenn zu schwach, erhöhen Sie die Belichtung.

Sobald die Belichtungszeit des Signals für Ihre Maus optimiert wurde, beginnen Sie mit der minütlichen Aufnahme der Bilder, bis das Signal ein Maximum erreicht. Dies geschieht am besten, indem Sie die Bildgebungssoftware verwenden, um interessante Bereiche auszuwählen, die Ihre Injektionsstellen abdecken. Durch die Überwachung der Signalintensität in jedem interessierenden Bereich können Sie leicht feststellen, wann das Signal abnimmt, was darauf hinweist, dass die maximale Signalintensität erreicht ist.

Wir nehmen den Durchschnitt von drei aufeinanderfolgenden Bildern, die um das Maximum herum auftreten, und verwenden diesen als endgültigen Wert. Wenn Sie mit Ihren Bildern zufrieden sind, entfernen Sie die Maus von der Fluoris und lassen Sie sie in ihrem Käfig aufwachen. Normalerweise sollte die Maus innerhalb von 15 Minuten aufwachen.

Nach dem gewünschten Zeitverlauf werden Biolumineszenzbilder aufgenommen. Das Tier kann in Gewebeschnitten getötet werden, die für die Histologie verwendet werden. Okay, jetzt, da wir alle mit den In-vivo-Bildgebungsverfahren fertig sind, können wir uns unsere Ergebnisse genauer ansehen und uns auch einige frühere Studien aus unserem Labor ansehen.

Hier ist ein Biolumineszenzbild von drei Mäusen mit subkutanen Teratomen. Die Biolumineszenz-Signaldaten wurden mit einem Schwarz-Weiß-Foto der Mäuse überlagert, das von der Bildgebungssoftware automatisch für uns erstellt wurde. Dies ist ein Beispiel für die Art der longitudinalen Bildgebung, die mit Glühwürmchen-Luziferase möglich ist.

In diesem Fall haben wir nach der ersten Injektion humane embryonale Stammzellen direkt in das Herz injiziert. Die meisten Zellen sterben in der folgenden Woche ab, was sich in einer Abnahme der Biolumineszenz über dem Herzen zeigt. Beachten Sie den schwarzen Pfeil.

Die menschlichen embryonalen Stammzellen, die die Transplantation überleben, bilden schließlich ein Teratom im Herzen, das ab etwa dem 14. Tag als schnell ansteigendes Signal dargestellt werden kann. Sie werden feststellen, dass es am siebten Tag eine zweite Region der Biolumineszenz gibt, die durch den roten Pfeil gekennzeichnet ist, der ein zusätzliches kardiales Austreten menschlicher embryonaler Stammzellen in den Bauch zeigt. Dies ist sehr häufig.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Biolumineszenzbilder von menschlichen embryonalen Stammzellen aufnehmen können, die sowohl in vitro als auch nach der Transplantation auf eine lebende Maus stabil ein Luciferase-Reportergen exprimieren. Diese Methode ermöglicht die wiederholte Bildgebung und Überwachung der Zellproliferation, ohne dass eine große Anzahl von Tieren für die Histologie geopfert werden muss, die für die Zellquantifizierung von Natur aus ungenau sein kann. Wenn Sie dieses Verfahren mit einer Maus durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, die richtige Konzentration von Delucci zu verwenden und eine Sättigung des Biolumineszenzbildes mit zu langen Belichtungsintervallen zu vermeiden.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.