Elektrophoretische Trennung von Proteinen

Die Trennung einzelner Proteine aus komplexen Proteinmischungen kann mittels Gelelektrophorese in Polyacrylamid-Gelelektrophorese, auch bekannt als PAGE, erreicht werden. Dabei wandern Proteine in einem elektrischen Feld durch Poren in der Gelmatrix. Die Kombination aus Porengröße des Gels sowie Ladung, Größe und Form des Proteins bestimmt die Migrationsgeschwindigkeit des Proteins. In diesem Video demonstrieren wir eine Methode zur elektrophoretischen Trennung von Proteinen.

Hallo, ich bin Dr. Bobul Chakravarti vom Proteomik-Zentrum des Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences. Heute werde ich Ihnen ein Verfahren zur Durchführung der eindimensionalen Gelelektrophorese zeigen. Beginnen wir also.

Beginnen Sie damit, das Glasplatten-Sandwich der Elektrophoreseapparatur gemäß den Herstelleranweisungen unter Verwendung von zwei sauberen Glasplatten und zwei 1,5 Millimeter Abstandshaltern zusammenzubauen. Befestigen Sie nun das Glasplatten-Sandwich an dem Gießständer. Bereiten Sie danach die Trenngellösung vor, die in aktuellen Protokollen beschrieben wurde.

Geben Sie die angegebene Menge 10 % Ammoniumpersulfat und TEMED zur Lösung hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Schwenken. Aufgrund der hohen Acrylamidkonzentration ist eine Entgasung nicht erforderlich. Tragen Sie die Trenngellösung mithilfe einer 10-Milliliter-Wegwerfplastikpipette unmittelbar entlang einer Kante eines der Abstandhalter auf das Sandwich auf, bis die Höhe der Lösung zwischen den Glasplatten etwa 11 Zentimeter beträgt.

Als Nächstes verwenden Sie eine andere Pipette, um die Oberseite des Gels langsam mit einer etwa einen Zentimeter dicken Schicht wassergesättigten Isobutylalkohols oder destilliertem Wasser zu bedecken. Gehen Sie hierfür vor, indem Sie das Wasser vorsichtig an der Kante des einen und anschließend des anderen Abstandshälters auftragen, und lassen Sie das Gel 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur polymerisieren. Die Überlagerung mit Wasser sorgt dafür, dass das Acrylamidgel sich zu einer geraden Linie verbindet.

Nachdem das Gel polymerisiert ist, können wir das sammelnde Gel aufgießen. Gießen Sie zunächst die Schicht aus destilliertem Wasser ab und spülen Sie mit 1× Tris-CL in SDS bei einem pH-Wert von 8,8 nach. Bereiten Sie nun die Lösung für das sammelnde Gel gemäß der aktuellen Protokolle vor.

Danach das Trägerschicht-Gel-Lösung mit einer Plastikpipette langsam entlang einer Kante eines der Abstandhalter in die Mitte des Sandwichs fließen lassen, bis die Höhe der Lösung im Sandwich etwa einen Zentimeter von der Oberkante der Platten entfernt ist. Dabei darauf achten, keine Luftblasen in das Trägerschicht-Gel einzubringen. Sobald das Gel gegossen ist, einen 0,75 Millimeter dicken Teflon-Kamm in die Schicht der Trägerschicht-Gel-Lösung einführen.

Lassen Sie die Stapelgel-Lösung 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur polymerisieren. Nun sind wir bereit, die Proteinproben vorzubereiten. Um mit der Vorbereitung der Proteinproben zu beginnen, verdünnen Sie einen Teil der zu analysierenden Proteinprobe im Verhältnis 1:1 mit zweifachem SDS-Probenpuffer.

Für verdünnte Proteinpufferlösungen sollte ein Verhältnis von fünf zu eins zwischen Protein und sechsfachem SDS-Puffer in Betracht gezogen werden. Falls es sich bei der Probe um ein präzipitiertes Proteinpellet handelt, lösen Sie das Protein in 50 bis 100 Mikrolitern eines 1× SDS-Puffers. Erhitzen Sie die Proben anschließend für drei bis fünf Minuten bei 100 Grad Celsius in einem verschlossenen Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubkappe in einem Wasserbad.

Als Nächstes entfernen Sie vorsichtig den Teflonkamm, ohne die Ränder der Polyacrylamid-Gele zu beschädigen. Nach dem Entfernen des Kamms spülen Sie die Vertiefungen mit 1× SDS-Elektrophoresepuffer aus. Füllen Sie anschließend die Vertiefungen mithilfe einer Pipette mit 1× SDS-Elektrophoresepuffer.

Nachdem die Vertiefungen gespült und mit Puffer gefüllt wurden, befestigen Sie das Gelsandwich am oberen Pufferbehälter. Füllen Sie gemäß den Herstelleranweisungen den unteren Pufferbehälter mit der empfohlenen Menge an 1× SDS-Elektrophoresepuffer. Bringen Sie anschließend das am oberen Pufferbehälter befestigte Sandwich in den unteren Pufferbehälter ein.

Füllen Sie die obere Pufferkammer nun vollständig mit XSDS-Elektrophoresepuffer, sodass die Probenmulden des Sammelgels mit Puffer bedeckt sind. Das Gel ist nun bereit zur Beladung. Verwenden Sie dazu einen 25- oder 100-Mikroliter-Autopipettierer mit Gel-Ladenspitzen und geben Sie die Proteinprobe(n) vorsichtig als dünne Schicht am Boden einer oder mehrerer Mulden ein. Beladen Sie die Kontrollmulden mit Molekulargewichtsstandards.

Fügen Sie außerdem ein gleiches Volumen eines XSDS-Probeladepuffers in alle leeren Vertiefungen hinzu, um eine Ausbreitung benachbarter Gelen zu verhindern. Nun können wir die Gelelektrophorese beginnen. Um das Gel laufen zu lassen, schließen Sie das Netzteil an die Elektrophoresekammer an und betreiben Sie es mit einem konstanten Strom von 30 Milliampere für ein 1,5 Millimeter dickes Plattengel.

Nachdem der blaue Markierungsfarbstoff Menthol die Unterseite des Trenngels erreicht hat, trennen Sie das Netzteil. Da das Gel nun durchgelaufen ist, entsorgen Sie den Elektrophoresepuffer und entfernen Sie die obere Pufferkammer mit dem daran befestigten Gelsandwich. Richten Sie das Gel so aus, dass die Reihenfolge der Probenmulden bekannt ist.

Entfernen Sie dann das Sandwich aus der oberen Pufferkammer und legen Sie es auf ein Blatt absorbierendes Papier oder Küchenpapier. Danach schieben Sie vorsichtig einen der Abstandshalter über die gesamte Länge hinweg zur Hälfte aus der Kante des Sandwichs heraus. Verwenden Sie den freigelegten Abstandshalter als Hebel, um die Glasplatte vorsichtig zu öffnen und so das Gel freizulegen.

Entfernen Sie das Gel von der unteren Platte. Schneiden Sie ein kleines Dreieck aus einer Ecke des Gels heraus, damit die Bandenorientierung während der Färbung und Trocknung nicht verloren geht. Das Verfahren der Gelelektrophorese ist nun abgeschlossen.

Das Gel kann nun mit verschiedenen Verfahren zur Proteindetektion weiterverarbeitet werden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie Proteine mithilfe der Gelelektrophorese getrennt werden. Damit ist alles gesagt.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.