Elektrophoretische Trennung von Proteinen

Die Trennung einzelner Proteine aus komplexen Proteingemischen kann durch Gelelektrophorese in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese erreicht werden, die auch als Seitenproteine bezeichnet wird, die als Reaktion auf ein elektrisches Feld durch Poren in der Gelmatrix wandern. Die Kombination aus Gelporengröße und Proteinladungsgröße und -form bestimmt die Migrationsrate des Proteins. In diesem Video zeigen wir eine Methode zur elektrophoretischen Trennung von Proteinen.

Hallo, ich bin Dr. Bobul Chakravarti vom Proteomic Center des Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur Durchführung der 1D-Gelelektrophorese. Also lasst uns loslegen.

Montieren Sie zunächst das Glasplattensandwich des Elektrophoresegeräts gemäß den Anweisungen des Herstellers mit zwei sauberen Glasplatten und zwei 1,5-Millimeter-Abstandhaltern. Verriegeln Sie nun das Glasplattensandwich mit dem Gießstand. Bereiten Sie anschließend die Trenngellösung vor, die in den aktuellen Protokollen beschrieben wurde.

Geben Sie die angegebene Menge von 10% Ammonium pro Sulfat und Tees in die Lösung und rühren Sie vorsichtig um, um sie zu mischen. Aufgrund der hohen Konzentration an Acrylamid ist eine Entgasung nicht erforderlich. Tragen Sie mit einer 10-Milliliter-Einwegpipette aus Kunststoff die Trenngellösung sofort entlang einer Kante eines der Abstandshalter auf das Sandwich auf, bis die Höhe der Lösung zwischen den Glasplatten etwa 11 Zentimeter beträgt.

Bedecken Sie anschließend mit einer weiteren Pipette langsam die Oberseite des Gels mit einer etwa einen Zentimeter dicken Schicht aus Wasser, gesättigtem Isobutylalkohol oder destilliertem Wasser. Tun Sie dies, indem Sie das Wasser vorsichtig gegen den Rand des einen Schichten schichten und dann den anderen der Abstandshalter das Gel 30 bis 60 Minuten polymerisieren lassen. Bei Raumtemperatur sorgt die Wasserauflage dafür, dass das Acrylamidgel zu einer geraden Linie polymerisiert.

Sobald das Gel polymerisiert ist, sind wir bereit, das Stapelgel zu gießen, um das Stapelgel zu gießen. Zuerst die Schicht mit destilliertem Wasser abgießen, dann mit einem x tris CL in SDS bei einem pH-Wert von 8,8 spülen. Bereiten Sie nun die Stapelgellösung vor, wie in den aktuellen Protokollen angegeben.

Lassen Sie dann mit einer Plastikpipette die Stapelgellösung langsam entlang einer Kante eines der Abstandshalter in die Mitte des Sandwiches rieseln, bis die Höhe der Lösung im Sandwich etwa einen Zentimeter von der Oberseite der Platten entfernt ist. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in das Stapelgel gelangen. Sobald das Gel gegossen ist, führen Sie einen 0,75 Millimeter Teflonkamm in die Schicht der Stapelgellösung ein.

Lassen Sie die Stapelgellösung 30 bis 45 Minuten polymerisieren. Bei Raumtemperatur sind wir nun bereit, die Proteinproben vorzubereiten. Um mit der Vorbereitung der Proteinprobe zu beginnen. Verdünnen Sie einen Teil der zu analysierenden Proteinprobe im Verhältnis eins zu eins mit zwei XSDS-Probenpuffern.

Für verdünnte Proteinlösungen sollten Sie eine Mischung aus fünf- bis eins-Protein bis zum Sechsfachen des SDS-Probenpuffers verwenden. Wenn es sich bei der Probe um ein gefälltes Proteinpellet handelt, lösen Sie das Protein in 50 bis 100 Mikrolitern eines XSDS-Probenpuffers auf. Erhitzen Sie nun die Proben für drei bis fünf Minuten bei 100 Grad Celsius in einem verschlossenen Schraubverschluss, Mikrozentrifugenröhrchen im Wasserbad.

Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Teflonkamm, ohne die Ränder der Polyacrylamid-Vertiefungen abzureißen. Nachdem der Kamm entfernt wurde, spülen Sie die Vertiefungen mit einem XSDS-Elektrophoresepuffer aus. Füllen Sie dann die Vertiefungen mit einer Pipette mit einem XSDS-Elektrophoresepuffer.

Sobald die Vertiefungen gespült und mit Puffer gefüllt sind, befestigen Sie das Gelsandwich an der oberen Pufferkammer. Füllen Sie die untere Pufferkammer gemäß den Anweisungen des Herstellers mit der empfohlenen Menge eines XSDS-Elektrophoresepuffers. Legen Sie dann das an der oberen Pufferkammer befestigte Sandwich in die untere Pufferkammer.

Füllen Sie nun die obere Pufferkammer vollständig mit einem XSDS-Elektrophoresepuffer, so dass die Probenvertiefungen des Stapelgels mit Puffer gefüllt sind. Das Gel kann nun mit einer 25- oder 100-Mikroliter-Autopipette mit Gelladespitzen geladen werden. Laden Sie die Proteinprobe in eine oder mehrere Vertiefungen, indem Sie die Probe vorsichtig als dünne Schicht auf den Boden der Vertiefungen auftragen. Beladungskontrollwells mit Molekulargewichtsstandards.

Fügen Sie außerdem ein gleiches Volumen eines XSDS-Probenpuffers zu allen leeren Vertiefungen hinzu, um eine Ausbreitung benachbarter Fahrspuren zu verhindern. Jetzt sind wir bereit, mit der Gelelektrophorese zu beginnen. Um das Gel zu betreiben, schließen Sie das Netzteil an die Zelle an und betreiben Sie es mit 30 Millipiers konstantem Strom für ein 1,5 Millimeter dickes Plattengel.

Nachdem der mentholblaue Tracking-Farbstoff den Boden des Trenngels erreicht hat, trennen Sie die Stromversorgung. Nachdem das Gel fertig gelaufen ist, entsorgen Sie den Elektrophoresepuffer und entfernen Sie die obere Pufferkammer mit dem beigefügten Gelsandwich. Richten Sie das Gel so aus, dass die Reihenfolge der Probenvertiefungen bekannt ist.

Nehmen Sie dann das Sandwich aus der oberen Pufferkammer und legen Sie das Sandwich auf ein Blatt saugfähiges Papier oder Papiertücher. Schieben Sie dann vorsichtig einen der Abstandshalter halb vom Rand des Sandwiches über die gesamte Länge. Verwenden Sie den freiliegenden Abstandshalter als Hebel, um die Glasplatte aufzuhebeln und das Gel vorsichtig freizulegen.

Entferne das Gel von der unteren Platte. Schneiden Sie ein kleines Dreieck von einer Ecke des Gels ab, damit die Ausrichtung der Bahn beim Färben und Trocknen nicht verloren geht. Das Verfahren der Gelelektrophorese ist nun abgeschlossen.

Das Gel kann nun mit verschiedenen Proteinnachweisverfahren aufbereitet werden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Proteine mittels Gelelektrophorese trennen können. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihrem Experiment.