Die Färbung Proteine ​​in Gelen

In einem früheren Video mit dem Titel "Elektrophoretische Trennung von Proteinen" haben wir gezeigt, wie ein komplexes Gemisch von Proteinen mithilfe der Gelelektrophorese getrennt werden kann. In diesem Video zeigen wir Ihnen vier verschiedene Gelfärbemethoden, mit denen Sie die Position der Proteine im Gel sichtbar machen können. Hallo, ich bin Sean Gallagher von UVP und arbeite mit dem Proteomics Center hier am KEG Graduate Institute zusammen.

Heute zeige ich Ihnen eine Reihe von Techniken, um Proteine nach der Trennung durch Elektrophorese sichtbar zu machen. Dazu gehören Kamasi-Blau-Silber-Färbung, Cyro-Orange und Cyro-Rubin. Fangen wir also zuerst mit Kamasi blue an.

Der Nachweis von Proteinbannen in einem Gel durch Kamasi-Blau-Färbung hängt von der unspezifischen Bindung eines Farbstoffs ab. In diesem Fall Kamasi Brillantblau G zwei 50. Bei dieser Methode werden Proteine, die in einem Polyacrylamid-Gel getrennt sind, mit hochreinem Wasser gewaschen.

Die Position der Proteine wird dann mit Hilfe einer Kamasi-Blau-Färbung auf Wasserbasis nachgewiesen. Die Nachweisgrenze liegt bei 0,3 bis einem Mikrogramm pro Proteinbande. Beginnen Sie mit einem Polyacrylamid-Gel, in dem Proteine durch Elektrophorese getrennt wurden.

Geben Sie das Polyacrylamid-Gel unter langsamem Rühren in einen Kunststoffbehälter, der mit 300 Millilitern hochreinem Wasser gefüllt ist. Fünf Minuten einwirken lassen. Entsorgen und nach der dritten Wäsche noch zwei weitere Male wiederholen.

Gießen Sie das Wasser aus und bedecken Sie das Gel eine Stunde lang mit Kamasi blauer Färbelösung, während Sie nach einer Stunde des Färbens langsam rühren und die Färbelösung ausgießen. Spülen Sie das Gel kurz aus, indem Sie es 30 Minuten lang in etwa 200 Milliliter Wasser geben. Zu diesem Zeitpunkt kann das Gel für zukünftige Bildgebungen in Wasser aufbewahrt werden.

Das Gel kann in diesem Stadium auch getrocknet werden, um eine dauerhafte Gelaufzeichnung zu erhalten. Legen Sie dazu das Gel auf zwei Blätter Watman drei mm Filterpapier und decken Sie die Oberseite mit Frischhaltefolie ab. Anschließend in einem herkömmlichen Geltrockner ein bis zwei Stunden bei etwa 80 Grad Celsius trocknen.

Eine weitere Methode zur Proteinfärbung ist die Silberfärbung, die wir als nächstes demonstrieren werden. Obwohl die Kamasi-Blau-Färbemethode einfacher und schneller ist, ist die Silberfärbung mit einer Nachweisgrenze von 0,3 Nanogramm BSA deutlich empfindlicher. Der Nachweis von Proteinbanden in einem Gel durch Silberfärbung hängt von der Bindung von Silber an verschiedene chemische Gruppen im Protein ab.

Das folgende Protokoll basiert auf dem Silver Quest Silberfärbekit von in Vitrogen. Das Protokoll leitet sich vom Schnellfärbeprotokoll ab, das ca. 30 Minuten dauert, und stellt eine der vielen Kit-basierten Chemikalien dar, die für die Silberfärbung verwendet werden, die mit der Massenspektrometrie kompatibel ist. In diesem Fall verwenden wir ein in vitrogen vorgefertigtes Mini-Gel, bevor wir mit der Silberfärbung beginnen.

Achten Sie darauf, immer Handschuhe zu tragen, um eine Kontamination durch Fingerabdrücke zu vermeiden. Legen Sie das Gel in eine mikrowellengeeignete Schale mit 100 Millilitern Wasser in Reagenzqualität. Kurz ausspülen und dann das Wasser abgießen.

Als nächstes fügen Sie 100 Milliliter Fixiermittel hinzu, bestehend aus 40% Ethanol, 10% Essigsäure in hochreinem Wasser und Mikrowelle für 30 Sekunden. Das Mikrowellenverfahren verkürzt die notwendigen Inkubationsschritte, indem es die Bindung und Färbung beschleunigt. Geben Sie das Gel zu diesem Zeitpunkt auf einen Shaker und schaukeln Sie fünf Minuten lang langsam.

Gießen Sie nach fünf Minuten das Fixiermittel ab, fügen Sie 100 Milliliter und 30 % Ethanol hinzu, um das Gel 30 Sekunden lang in der Mikrowelle zu waschen, und legen Sie das Gel dann fünf Minuten lang auf einen Shaker. Gießen Sie nach fünf Minuten das Ethanol ab. Geben Sie nun 100 Milliliter sensibilisierendes Reagenz für 30 Sekunden in die Mikrowelle und legen Sie es dann für zwei Minuten auf einen Shaker.

Gießen Sie nach den zwei Minuten das sensibilisierende Reagenz ab. 100 Milliliter Reagenzwasser für 30 Sekunden in die Mikrowelle geben und zwei Minuten lang auf einen Shaker stellen. Abgießen und für insgesamt zwei Waschgänge wiederholen.

Nun 100 Milliliter Färbelösung hinzufügen, 30 Sekunden in der Mikrowelle erhitzen und fünf Minuten lang langsam rühren. Gießen Sie nach den fünf Minuten die Färbelösung ab. Fügen Sie 100 Milliliter Wasser in Reagenzqualität hinzu, überspringen Sie die Mikrowelle, treten Sie in die Mikrowelle und stellen Sie sie direkt auf einen Shaker für 20 bis 60 Sekunden.

Entsorgen Sie das Wasser und fügen Sie sofort 100 Milliliter der Entwicklungslösung hinzu und entwickeln Sie, bis Proteinbanden sichtbar werden. Wenn der Hintergrund klar bleibt, dauert dies etwa fünf bis 10 Minuten. Geben Sie an dieser Stelle 10 Milliliter Stopfenlösung in den Entwickler, um die Entwicklung zu stoppen und die besten Ergebnisse zu erzielen.

Fotografieren Sie das Gel so schnell wie möglich, da es zu leichten Änderungen der Farbintensität und einer Zunahme unspezifischer Hintergrundelemente kommen kann. Im Laufe der Zeit enthält das Gel, das Sie sehen, Restproteine Nach dem Elektroblotting trocknen Sie das Gel, um eine dauerhafte Aufzeichnung zu erhalten, oder bewahren Sie es in einer verschließbaren Plastiktüte auf. Als nächstes demonstrieren wir eine Methode zur fluoreszierenden Färbung von Gelen.

Fluoreszierende Farbstoffe haben eine Reihe von Vorteilen gegenüber herkömmlichen Proteinfärbungen. Cipro-Orange-Protein-Gel-Färbungen, die wir hier skizzieren werden, können ein bis zwei Nanogramm Protein pro Bande nachweisen. Dies ist empfindlicher als Kamasi-Brillantblau-Färbungen und so empfindlich wie viele Silberfärbetechniken.

Die Fluoreszenzfärbung ist unkompliziert und erfordert weniger Zeit als typische Silberfärbeprotokolle und ist in weniger als einer Stunde abgeschlossen. Gefärbte Proteine können mit einem Standard-300-Nanometer-UV-Transluminator oder einem Laserscanner sichtbar gemacht werden. In diesem Fall werden wir wieder ein in vitrogen vorgefertigtes Mini-Gel verwenden, um mit der Vorbereitung und Trennung von Proteinen unter Verwendung der SDS-Seite zu beginnen.

Verwenden Sie jedoch 0,05 % SDS im laufenden Puffer anstelle der üblichen 0,1 % SDS, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Um mit dem Färbevorgang zu beginnen, gießen Sie die fluoreszierende Färbelösung Cipro Orange in eine kleine Plastikschale für ein oder zwei Mini-Gele in Standardgröße. Verwenden Sie etwa 50 Milliliter Färbelösung.

Es ist wichtig zu beachten, dass fleckiges Geschirr vor dem Gebrauch gut gereinigt und gespült werden sollte, da Reinigungsmittel die Fleckenbildung beeinträchtigen. Geben Sie nun das Gel in die Färbelösung. Decken Sie den Behälter mit Alufolie ab, um den Farbstoff vor hellem Licht zu schützen.

Rühren Sie das Gel bei Raumtemperatur 40 bis 60 Minuten lang vorsichtig auf. Verwerfen Sie die Färbelösung und spülen Sie das Gel dann weniger als eine Minute lang mit 7,5 % Essigsäure, etwa 100 Milliliter, um den überschüssigen Fleck von der Geloberfläche zu entfernen, halten Sie das Gel zurück, indem Sie es über Nacht in 0,1 % zwischen 20 inkubieren, um Proteinbanden sichtbar zu machen und zu fotografieren. Platzieren Sie das fluoreszenzmarkierte Gel direkt auf einem Standard-300-Nanometer-Transluminator oder einem Blaulicht-Transluminator.

Als nächstes werden wir eine alternative Fluoreszenzfärbemethode demonstrieren, bei der der Cipro-Rubin-Fluoreszenzfarbstoff verwendet wird. Die Cipro-Rubin-Färbemethode wurde speziell für die Verwendung in zweidimensionalen Seiten entwickelt, hat sich jedoch als die empfindlichste Proteingelfärbung für eindimensionale Standard-SDS-Seiten erwiesen. Zu Beginn geben Sie das Gel in eine saubere Polypropylen- oder PVC-Schale geeigneter Größe.

Inkubieren Sie das Gel in der entsprechenden Menge unverdünnter Cipro-Rubin-Protein-Gelfärbung unter kontinuierlichem, sanftem Rühren auf einem Orbitalschüttler bei 50 U/min. Decken Sie das Gel ab und inkubieren Sie es mindestens drei Stunden lang. Übertragen Sie das Gel in eine saubere Färbeschale und waschen Sie es einmal in einer Lösung von 10 % Methanol und 7 % Essigsäure, holen Sie es zurück und legen Sie das Gel für 30 Minuten wieder auf die Wippe.

Um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren und die Empfindlichkeit zu erhöhen, kann das Gel nun betrachtet und fotografiert werden. Ich möchte Ihnen dafür danken, dass Sie sich die heutigen Protokolle angesehen haben. Wir haben Ihnen eine Reihe verschiedener Verfahren zur Visualisierung von Proteinen nach der Elektrophorese gezeigt.

Einige sind sehr empfindlich, wie die Fluoreszenzfärbung und die Silberfärbung, und andere sind Routine, wie die Kamasi-Blau-Färbung. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Reinheit der Reagenzien entscheidend ist. Die Verwendung von ultrareinem Wasser ist ebenfalls sehr wichtig, ebenso wie das Timing bei jedem einzelnen Schritt.

Darauf müssen Sie genau achten, um auch reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Das war's und viel Glück bei Ihren nächsten Experimenten.