Die Färbung Proteine ​​in Gelen

In einem vorherigen Video mit dem Titel Elektrophoretische Trennung von Proteinen haben wir gezeigt, wie ein komplexes Gemisch von Proteinen mittels Gelelektrophorese getrennt werden kann. In diesem Video stellen wir Ihnen vier verschiedene Färbemethoden für Gele vor, mit denen die Position der Proteine im Gel sichtbar gemacht werden kann. Hallo, ich bin Sean Gallagher von UVP und arbeite mit dem Proteomik-Zentrum hier am KEG-Graduierteninstitut zusammen.

Heute werde ich Ihnen eine Reihe von Techniken zur Visualisierung von Proteinen nach der Elektrophorese vorstellen. Dazu gehören die Färbung mit Kamasi-Blau-Silber, Cyro-Orange und Cyro-Rubin. Beginnen wir also zunächst mit der Kamasi-Blau-Färbung.

Die Detektion von Proteinbändern in einem Gel durch Färbung mit Kamasi-Blau beruht auf der unspezifischen Bindung eines Farbstoffs, in diesem Fall Kamasi Brilliantblau G 250. Bei dieser Methode werden die in einem Polyacrylamid-Gel getrennten Proteine mit hochreinem Wasser gewaschen.

Die Lokalisation der Proteine erfolgt anschließend mit einer wasserbasierten Kamasi-Blau-Färbung. Die Nachweisgrenze liegt bei 0,3 bis einem Mikrogramm pro Proteinband. Beginnen Sie mit einem Polyacrylamidgel, in dem die Proteine mittels Elektrophorese getrennt wurden.

Unter langsamer Rührtätigkeit wird das Polyacrylamidgel in einen Plastikbehälter mit 300 Milliliter hochreinem Wasser gegeben. Fünf Minuten einwirken lassen. Nach der dritten Wäsche verwerfen und zweimal wiederholen.

Geben Sie das Wasser ab und bedecken Sie das Gel mit Kamasi-Blau-Färbeflösung für eine Stunde unter leichtem Schütteln. Nach einer Stunde Färbung gießen Sie die Färbeflösung ab. Spülen Sie das Gel kurz, indem Sie es etwa 30 Minuten in etwa 200 Milliliter Wasser geben. An diesem Punkt kann das Gel zur späteren Bildaufnahme in Wasser aufbewahrt werden.

Das Gel kann auch in diesem Stadium getrocknet werden, um eine dauerhafte Gel-Aufzeichnung zu erhalten. Dazu das Gel auf zwei Blätter Watman-Filterpapier der Dicke drei mm legen und die Oberseite mit Plastikfolie abdecken. Anschließend im handelsüblichen Gel-Trockner etwa eine bis zwei Stunden bei etwa 80 Grad Celsius trocknen.

Eine andere Protein-Färbemethode ist die Silberfärbung, die wir als Nächstes demonstrieren werden. Obwohl die Kamasi-Blau-Färbemethode einfacher und schneller ist, weist die Silberfärbung eine deutlich höhere Empfindlichkeit auf, mit einer Nachweisgrenze von 0,3 Nanogramm BSA. Der Nachweis von Proteinbanden in einem Gel mittels Silberfärbung beruht auf der Bindung von Silber an verschiedene chemische Gruppen im Protein.

Das folgende Protokoll basiert auf dem Silver Quest-Silberfärbekit von in Vitrogen. Das Protokoll leitet sich vom Schnellfärbeprotokoll ab, das ungefähr 30 Minuten dauert, und stellt eine der zahlreichen kitbasierten Chemikalien dar, die für die massenspektrometrie-kompatible Silberfärbung verwendet werden. In diesem Fall verwenden wir vor Beginn der Silberfärbung ein vorgefertigtes Mini-Gel von in Vitrogen.

Tragen Sie stets Handschuhe, um eine Kontamination durch Fingerabdrücke zu vermeiden. Legen Sie das Gel in eine mikrowellengeeignete Schale mit 100 Milliliter wasserfreiem Reagenzwasser. Spülen Sie es kurz an und gießen Sie das Wasser anschließend ab.

Fügen Sie anschließend 100 Milliliter Fixansatz, bestehend aus 40 % Ethanol, 10 % Essigsäure in hochreinem Wasser, hinzu und behandeln Sie ihn 30 Sekunden lang in der Mikrowelle. Der Mikrowellenprozess verkürzt die erforderlichen Inkubationsschritte, indem er die Bindung und Färbung beschleunigt. Danach stellen Sie das Gel auf einen Schüttler und schütteln es langsam fünf Minuten lang.

Nach fünf Minuten das Fixierungsmittel abgießen, 100 Milliliter 30 % Ethanol hinzufügen, um das Gel im Mikrowellenofen 30 Sekunden lang zu waschen und anschließend fünf Minuten lang auf einem Schüttler zu belassen. Nach fünf Minuten das Ethanol abgießen. Nun 100 Milliliter Sensibilisierungsreagenz hinzufügen, im Mikrowellenofen 30 Sekunden lang erhitzen und anschließend zwei Minuten lang auf einem Schüttler belassen.

Nach zwei Minuten das Sensibilisierungsmittel abgießen. 100 Milliliter wasserfreies Reinstwasser hinzufügen, 30 Sekunden im Mikrowellenofen erhitzen und anschließend zwei Minuten auf einem Schüttler behandeln. Abgießen und insgesamt zwei Waschzyklen durchführen.

Geben Sie nun 100 Milliliter Färbelösung hinzu, erwärmen Sie sie 30 Sekunden in der Mikrowelle und schütteln Sie langsam für fünf Minuten. Nach den fünf Minuten gießen Sie die Färbelösung ab. Geben Sie 100 Milliliter wasserfreies Reinstwasser hinzu, überspringen Sie die Mikrowelle und stellen Sie das Gefäß direkt auf einen Schüttler für 20 bis 60 Sekunden.

Entfernen Sie das Wasser und geben Sie sofort 100 Milliliter der Entwicklerlösung hinzu. Entwickeln Sie, bis die Proteinbanden sichtbar werden. Bei klarem Hintergrund dauert dies etwa fünf bis zehn Minuten. Geben Sie anschließend 10 Milliliter Stopplösung zum Entwickler, um die Entwicklung für optimale Ergebnisse zu beenden.

Fotografieren Sie das Gel so schnell wie möglich, da geringfügige Änderungen der Farbintensität sowie eine Zunahme unspezifischer Hintergrundstrukturen auftreten können. Mit der Zeit enthält das Gel, das Sie sehen, Restproteine. Trocknen Sie das Gel nach dem Elektroblotten, um eine dauerhafte Aufzeichnung zu erhalten, oder lagern Sie es in einer verschließbaren Plastiktüte. Als Nächstes demonstrieren wir eine Methode zur fluoreszenzbasierten Färbung von Gelen.

Fluoreszenzfarbstoffe weisen eine Reihe von Vorteilen gegenüber herkömmlichen Proteinfärbemethoden auf. Die hier beschriebenen Cipro-Orange-Proteingelfärbungen können ein bis zwei Nanogramm Protein pro Bande nachweisen. Dies ist empfindlicher als die Färbung mit Kamasi Brilliantblau und genauso empfindlich wie viele Silberfärbetechniken.

Die fluoreszenzmarkierte Färbung ist unkompliziert, erfordert weniger manuelle Bearbeitungszeit als typische Silberfärbeprotokolle und ist in weniger als einer Stunde abgeschlossen. Gefärbte Proteine können mit einem standardmäßigen UV-Transilluminiator bei 300 Nanometer oder einem Laserscanner sichtbar gemacht werden. In diesem Fall verwenden wir erneut ein vorgefertigtes Mini-Gel von In Vitrogen, um Proteine vorzubereiten und mittels SDS-Page aufzutrennen.

Verwenden Sie jedoch 0,05 % SDS im Laufpuffer anstelle des üblichen 0,1 % SDS, um die Hintergrundfluoreszenz zu verringern. Um mit der Färbung zu beginnen, geben Sie die orangerote fluoreszierende Färbelösung in eine kleine Kunststoffschale für ein oder zwei standardgroße Mini-Gele. Verwenden Sie etwa 50 Milliliter Färbelösung.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Färbeschalen vor der Verwendung gründlich gereinigt und ausgespült werden sollten, da jegliche Reinigungsmittel die Färbung stören würden. Geben Sie nun das Gel in die Färbelösung. Bedecken Sie das Gefäß mit Aluminiumfolie, um den Farbstoff vor hellem Licht zu schützen.

Schwenken Sie das Gel vorsichtig bei Raumtemperatur 40 bis 60 Minuten lang. Entsorgen Sie die Färbelösung und spülen Sie das Gel anschließend weniger als eine Minute lang mit 7,5 %iger Essigsäure, etwa 100 Milliliter, um überschüssige Färbelösung von der Geloberfläche zu entfernen. Lassen Sie das Gel über Nacht in 0,1 % Tween 20 inkubieren, um die Proteinbanden sichtbar zu machen und zu fotografieren. Legen Sie das fluoreszenzmarkierte Gel direkt auf einen Standard-Transilluminator mit 300 Nanometer oder einen Transilluminator mit Blaulicht.

Danach demonstrieren wir eine alternative fluoreszierende Färbemethode, die den fluoreszierenden Farbstoff Cipro Ruby verwendet. Die Cipro-Ruby-Färbemethode wurde ursprünglich speziell für die zweidimensionale Gelelektrophorese entwickelt, hat sich jedoch als empfindlichste Protein-Geleinfärbung für die standardmäßige eindimensionale SDS-Gelelektrophorese erwiesen. Überführen Sie zunächst das Gel in eine saubere Polypropylen- oder PVC-Schale geeigneter Größe.

Das Gel in der geeigneten Menge unverdünnter Cipro Ruby Protein Gel Färbung unter kontinuierlicher, sanfter Agitation auf einem orbitalen Schüttler bei 50 U/min inkubieren. Das Gel abdecken und mindestens drei Stunden inkubieren. Das Gel in eine saubere Färbeschale überführen und einmal mit einer Lösung aus 10 % Methanol, 7 % Essigsäure waschen, auffangen und das Gel für 30 Minuten zurück auf den Schüttler stellen.

Um die Hintergrundfluoreszenz zu verringern und die Empfindlichkeit zu erhöhen, kann das Gel nun betrachtet und fotografiert werden. Ich danke Ihnen, dass Sie sich heute unsere Protokolle angesehen haben. Wir haben Ihnen verschiedene Verfahren zur Sichtbarmachung von Proteinen nach der Elektrophorese gezeigt.

Einige sind sehr empfindlich, wie die fluoreszenzfarbende und die Silberfärbung, und andere sind routinemäßig, wie die Kamasi-Blau-Färbung. Es ist wichtig zu beachten, dass die Reinheit der Reagenzien entscheidend ist. Die Verwendung von ultrareinem Wasser ist ebenfalls sehr wichtig, ebenso wie die Einhaltung der jeweiligen Inkubationszeiten für jeden Schritt.

Sie müssen darauf genau achten, um ebenfalls reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Das war's, und viel Erfolg bei Ihren nächsten Experimenten.