Name: Elektroporation von Mykobakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Lernen Sie die Elektroporation von Mykobakterien für genetische Transformationen mit optimierten Protokollen. Diese Methode ermöglicht effiziente DNA-Einführung trotz der robusten Zellwand von Mycobacterium smegmatis.

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elektroporation von mykobakterien

Electroporation of Mycobacteria

Hoher Wirkungsgrad Transformation ist eine große Einschränkung in der Studie von Mykobakterien. Die Gattung Mycobacterium kann schwierig sein, zu verwandeln, das ist vor allem durch die dicken und wachsartigen Zellwand verursacht, sondern wird durch die Tatsache, dass die meisten molekularen Techniken entfernt-verwandte Arten wie Escherichia coli und Bacillus subtilis wurden entwickelt, verschärft. Trotz dieser Hindernisse haben mykobakterielle Plasmide identifiziert worden und DNA-Transformation vieler Mykobakterien Arten sind inzwischen beschrieben. Die erfolgreichste Methode zur Einführung von DNA in Mykobakterien ist die Elektroporation. Viele Parameter tragen zur erfolgreichen Transformation, dazu gehören die Art / Stamm, die Art der Umwandlung von DNA, die Selektionsmarker verwendet, das Nährmedium und die Bedingungen für die Elektroporation Puls. Optimierte Methoden zur Transformation der beiden Zeitlupen-und Winzer sind hier aufgeführt. Transformation Wirkungsgrade für verschiedene Mykobakterien Arten und mit verschiedenen Selektionsmarker gemeldet werden.

Mycobacterial pathogenen Strategien noch schwer abzuschätzen. Das langsame Wachstum der meisten Arten, die undurchdringliche Natur der Zellwand, und die Gefahren bei der Arbeit mit Erregern machen Mykobakterien schwer zu untersuchen und sind weitgehend verantwortlich für unsere armen Verständnis dieser Organismen. In diesem Video zeigen wir Ihnen die Technik der Elektroporation, die Unterwerfung Zellen beinhaltet einen kurzen hohen elektrischen Impuls, um den Eintrag von DNA ermöglichen. Es ist die am weitesten verbreitete Methode für die Einführung von DNA in Zellen Mykobakterien.

Elektroporation von Mykobakterien

Die hocheffiziente Transformation stellt eine wesentliche Einschränkung bei der Untersuchung von Mykobakterien dar. Die Gattung Mycobacterium lässt sich nur schwer transformieren; dies liegt hauptsächlich ...

Die pathogenen Strategien von Mykobakterien sind aufgrund der langsamen Wachstumsrate der meisten Arten nur unzureichend verstanden. Die undurchdringliche Beschaffenheit der Zellwand und die Gefahren bei der Arbeit mit Krankheitserregern machen Mykobakterien schwer untersuchbar und sind maßgeblich für das geringe Verständnis dieser Organismen verantwortlich. In diesem Video werden wir die Technik der Elektroporation demonstrieren, bei der Zellen einem kurzen, starken elektrischen Impuls ausgesetzt werden, wodurch die Aufnahme von DNA ermöglicht wird.Es ist die am weitesten verbreitete Methode zur Einführung von DNA in mykobakterielle Zellen. Hallo, ich bin Ron Good aus dem Labor von Tanya Parish vom Zentrum für Infektionskrankheiten an den Bats und der London School of Medicine and Dentistry. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur Elektrotransformation von Mykobakterien zeigen.In unserem Labor untersuchen wir Microbacterium tuberculosis, aber da es hochgradig pathogen ist und eine BSL-3-Containment-Einrichtung erfordert, werden wir Ihnen diese Technik an dem nicht-pathogenen Microbacterium m Mcma zeigen. Also lasst uns einige Bakterien elektroporieren. Um Mykobakterien zu elektroporieren, müssen wir kompetente Zellen herstellen.Es ist wichtig zu bedenken, dass pathogene Mykobakterien eine bedeutende biologische Gefährdung darstellen. Daher müssen alle Kultivierungs- und genetischen Manipulationsschritte in einer geeigneten Sicherheitsvorrichtung durchgeführt werden. Die Arbeit muss innerhalb eines Sicherheitswerkschrankes der Klasse eins erfolgen. Die Risikobewertung muss den ersten Teil jedes Experiments mit pathogenen Mykobakterien bilden.Um diese herzustellen, beginnen wir mit der Kultur, die im Labor auf festen Nährmedien wie Lemko gehalten wurde, indem man mit einem Schleifhaken Mykobakterien in fünf Milliliter Lemko-Brühe, die Tween enthält, animpft. Da viele Mykobakterien vergleichsweise langsam wachsende Organismen sind, ist es äußerst wichtig, eine gute aseptische Technik anzuwenden, um eine Kontamination dieser Kulturen mit Bakterien oder Pilzen zu verhindern, die die Mykobakterien schnell überwuchern können. Es ist oft ratsam, Doppelkulturen anzulegen, falls eine davon kontaminiert wird.Mycobacterienzellen neigen aufgrund ihrer dicken wachsartigen Hülle in der Kultur dazu, zusammenzuklumpen. Durch Vortexen und Zugabe eines nichtionischen Detergens wie Tween 82 Medium lässt sich dieses Verklumpen verringern und eine homogenere Zellsuspension erreichen. Nach der Inokulation inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit hundert Umdrehungen pro Minute.Nachdem die Anreinkultur gewachsen ist, impfen Sie eine Großkultur von etwa hundert Milliliter Lemko-TW in einem 250-Milliliter-Konikalfläschchen mit einer 1:100-Verdünnung der Übernachtkultur an. Fahren Sie mit der Inkubation bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für etwa 16 bis 24 Stunden fort, wobei die optische Dichte dann mit dem Spektrophotometer überprüft werden kann. Liegt der Wert zwischen 0,8 und 1, befinden sich die Zellen in ihrer optimalen log-Phase des Wachstums.Anschließend inkubieren Sie die Zellen vor der Gewinnung 1,5 Stunden auf Eis, was dazu beiträgt, die Transformations­effizienz um das Vierfache zu erhöhen. Längere Inkubationen auf Eis führen zu einer verminderten Effizienz. Danach gewinnen Sie die Zellen, indem Sie die Kulturen in große Zentrif­röhren umgießen.Zentrifugieren Sie bei 300 G für 10 Minuten; waschen Sie die Zellen danach dreimal in eiskaltem 10 % Glycerin und reduzieren Sie jedes Mal das Volumen, sodass für ein Kulturvolumen von hundert Milliliter 20 Milliliter für die erste Wäsche verwendet werden, dann 10 Milliliter und schließlich 5 Milliliter für die letzte Wäsche. Nach den Wäschen resuspendieren Sie die Zellen in einem Volumen von einem zu 10 bis einem zu 100 des ursprünglichen Volumens an eiskaltem 10 % Glycerin. Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen portioniert, eingefroren und bei minus 70 Grad Celsius für die spätere Verwendung gelagert werden.Die Transformations-Effizienz steigt oft nach dem Einfrieren der Zellen an. Vor der Verwendung dieser kompetenten Zellen sollten diese aufgetaut, durch Zentrifugation gewonnen und vor der Anwendung in frischem, 10 % Glycerin resuspendiert werden. Um elektroporiert zu werden, benötigt man ein Elektro, welches ein Gerät ist, das einen Hochspannungsimpuls von 2,5 liefern kann.Kilovolt wird verwendet. Bakterien und DNA werden in Elektroporationsküvetten gegeben. Obwohl die Spaltbreite oder Weglänge in verschiedenen Küvetten identisch sein kann, unterscheiden sie sich hinsichtlich des Volumens, das sie aufnehmen können.Wir verwenden routinemäßig 200 Mikroliter Zellen in einer 0,2 cm-Küvette, um die Zellen zu elektroporieren. Bereiten Sie zunächst die DNA-Probe so vor, dass sie frei von Salzen und anderen Verunreinigungen ist. Dies ist wichtig, um die Wahrscheinlichkeit von Lichtbögen während der Elektroporation zu minimieren.Bevor Sie die Bakterien gießen, stellen Sie sicher, dass Ihre DNA-Proben von hoher Reinheit sind. Das Verhältnis der Absorption bei 60 bis 80 sollte nahe bei 1,8 liegen. Geben Sie 0,5 bis fünf Mikrogramm der salzfreien DNA in einem Volumen von maximal fünf Mikrolitern zu 200 Mikrolitern Mikrobensuspension hinzu. Eine Kontrollelektroporation ohne DNA, um die Häufigkeit von Antibiotikaresistenzmutanten zu überprüfen, kann durchgeführt werden.Anschließend die Mischung 10 Minuten auf Eis stehen lassen. Dadurch wird die Anzahl lebender Zellen in der Probe und die Salzkonzentration in der DNA-Lösung verringert, was nach der Eisinzubation Entladungen minimiert. Vor dem Hochspannungsimpuls die Zellen gründlich mit einer Pipette oder einem Vortex-Mischer resuspendieren, um eine gleichmäßige Verteilung und Vermischung der DNA sicherzustellen. Jegliche Zellagglomeration führt zu Entladungen und vermindert die Transformations-Effizienz.Als Nächstes überführen Sie das Gemisch in eine vorher gekühlte Küvette mit 0,2 cm Elektrodenabstand. Achten Sie erneut darauf, keine Blasen in das Gemisch einzubringen, um zudem Lichtbogenbildung zu vermindern.Stellen Sie sicher, dass das Äußere der QVE vollständig trocken ist, bevor Sie sie in die Puls-Kammer geben. Nachdem die QVE gründlich getrocknet wurde und der Widerstand des Puls-Controllers auf tausend Ohm eingestellt ist, platzieren Sie die QVE in der Elektroporationskammer. Stellen Sie danach die Spannung auf 2,5 Kilovolt ein und geben Sie den Puls ab, bis ein Piepton zu hören ist, was anzeigt, dass der Kondensator in der QVE entladen wurde.Eine Zeitkonstante von mehr als 10 weist auf eine erfolgreiche Elektroporation hin. Eine erfolglose Elektroporation wird gewöhnlich durch Lichtbogenbildung angezeigt, die einen Funken verursacht, was jedoch oft vermieden werden kann. Ändern Sie den Widerstand am Impulsregler und stellen Sie den Q vet danach für 10 Minuten zurück auf Eis.Nach der Inkubation die Zellsuspension in eine sterile Universalflasche mit fünf Milliliter Lemko-TW-Brühe überführen. Es ist wichtig, die Zellen unmittelbar nach dem Puls mindestens zehnfach zu verdünnen, um die Zellerholung zu unterstützen und die Überlebensrate der transformierten Zellen zu erhöhen. Anschließend die Zellen zwei bis drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation sind die Zellen bereit zum Aufplattieren; gewinnen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3000 ×g für 10 Minuten.Nach der Zentrifugation eine geeignete Verdünnung des Suspensionsansatzes in Lemko-Bouillon herstellen, sodass jede Platte 30 bis 300 Kolonien erhält. Es ist wichtig sicherzustellen, dass resistente Kolonien aus einer einzigen Zelle hervorgegangen sind; daher muss gewährleistet sein, dass die Zellen vor der Ausplattierung gründlich resuspendiert wurden. Falls die Zellen nicht verdünnt werden, kann es sehr schwierig sein, tatsächlich resistente Kolonien vor einem Hintergrundrasen empfindlicher Zellen zu erkennen. Nun die Zellen auf Lemko-Agar mit dem jeweils geeigneten Antibiotikum ausplattieren.Sie inkubieren die Platten bei 37 Grad Celsius, bis Kolonien sichtbar werden. Dies dauert drei bis fünf Tage, nachdem die Kolonien gewachsen sind. Zählen Sie die Transformanten.Zur Berechnung der Transformations­effizienz. Mehrere Faktoren beeinflussen die Effizienz der Transformation. Dazu gehören die Wachstumsphase der Zellen zum Zeitpunkt der Ernte, das Elektroporationsmedium sowie die Feldstärke und die Zeitkonstante des applizierten Impulses.Die Effizienz der Elektroporations-Technik hängt ebenfalls von der Wahl der DNA für die Transformation sowie manchmal von der Wahl des selektierbaren Markers ab. Üblicherweise erzielen wir Effizienzen von 10 hoch fünf bis 10 hoch sechs Kolonien pro Mikrogramm DNA unter Verwendung von Hygromycin- oder Streptomycinresistenz in ems magma. Um nun die Transformanten zu kultivieren, streichen Sie die elektroporierten Mykobakterien auf festes Medium mit Selektionsmittel aus.Antibiotikum bei 37 Grad für zwei bis drei Tage inkubieren. Nach der zweitägigen bis dreitägigen Inkubation können die Transformanten je nach Anforderung der jeweiligen Anwendung analysiert werden; dabei sollten drei Transformanten ausgestrichen und analysiert werden. Es ist wichtig, die Identität des extrachromosomalen Plasmids nach der Transformation zu überprüfen.Da Deletionen und Umbauten häufig sind, habe ich Ihnen gerade gezeigt, wie man Mycobacterium s magma elektrolysiert. Wenn Sie dieses Verfahren mit pathogenen Mikrobakterien durchführen, denken Sie daran, geeignete Sicherheitsmaßnahmen anzuwenden. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Stefan, A., et al., Die vielfältigen Vorteile der Protein-Co-expression in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Transformation von Escherichia coli mit einem Plasmid, das ein Antibiotikaresistenzgen trägt, einschließlich Zellvorbereitung, Elektroporation, Wiederherstellung und Auswahl von Transformanten.

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Elektroporation ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Einführung von DNA in Bakterien in einem als Transformation bekannt. Traditionellen Protokolle zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen sind zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Dieser Artikel beschreibt eine alternative, schnelle und effiziente Methode zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen derzeit von einigen Labors eingesetzt.

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Lernen Sie die Elektroporation von Mykobakterien für genetische Transformationen mit optimierten Protokollen. Diese Methode ermöglicht effiziente DNA-Einführung trotz der robusten Zellwand von Mycobacterium smegmatis.

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