Elektroporation von Mykobakterien

Mykobakterielle pathogene Strategien sind aufgrund der langsamen Wachstumsrate der meisten Arten nach wie vor wenig verstanden. Die Undurchdringlichkeit der Zellwand und die Gefahren bei der Arbeit mit Krankheitserregern erschweren die Untersuchung von Mykobakterien und sind weitgehend für unser mangelndes Verständnis dieser Organismen verantwortlich. In diesem Video zeigen wir die Technik der Elektroporation, bei der die Zellen einem kurzen und hohen elektrischen Impuls ausgesetzt werden, der den Eintritt der DNA ermöglicht.

Es ist die am weitesten verbreitete Methode zum Einbringen von DNA in mykobakterielle Zellen. Hallo, ich bin Ron Good vom Labor von Tanya Parish vom Center of Infectious Disease at the Bats und der London School of Medicine and Dentistry. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur elektrobetriebenen Mikrobakterien.

In unserem Labor untersuchen wir das Mikrobakterium tuberculosis, aber da es hochpathogen ist und eine C3-Eindämmung erfordert, zeigen wir Ihnen diese Technik im nicht-pathogenen Mikrobakterium m Mcma. Also lasst uns ein paar Bakterien elektrisch essen. Um Mykobakterien zu essen, müssen wir kompetente Zellen herstellen.

Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass pathogene Mykobakterien eine wichtige biologische Gefahr darstellen. Daher müssen alle Zucht- und Genmanipulationen in einem geeigneten Containment durchgeführt werden. Einrichtungen in einer Sicherheitswerkbank der ersten Klasse Die Risikobewertung muss den ersten Teil eines Experiments mit pathogenen Mykobakterien bilden.

Um diese herzustellen, beginnen wir mit der Kultur, die im Labor auf festen Medien wie Lemko, Schneckenimpfstoff, fünf mil Lemken mit Tween-Brühe und einer Schlaufe voller Mykobakterien aufbewahrt wurde. Da viele Mykobakterien relativ langsam wachsende Organismen sind, ist es äußerst wichtig, eine gute aseptische Technik aufrechtzuerhalten, um eine Kontamination dieser Kulturen mit Pilzbakterien zu verhindern, die schnell aus den Mykobakterien herauswachsen können. Es ist oft ratsam, doppelte Kulturen einzurichten, falls eine kontaminiert wird.

Mykobakterienzellen neigen aufgrund ihrer dicken wachsartigen Hülle dazu, in Kultur zu verklumpen. Das Vortexen und die Zugabe von nichtionischem Detergens wie Tween 82 Medium reduziert diese Verklumpung und sorgt für eine homogenere Suspension der Zellen. Nach der Inokulation inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie über Nacht bei hundert Umdrehungen pro Minute.

Nachdem die Starterkultur gewachsen ist, wird eine großmaßstäbliche Kultur mit etwa hundert mil Lemko tw in einen 250 mil konischen Kolben mit einer Verdünnung der Übernachtkultur von eins bis 100 beimpft. Die Inkubation bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für etwa 16 bis 24 Stunden fortsetzen, dann kann die optische Dichte mit dem Spektralphotometer überprüft werden. Wenn es 0,8 bis eins anzeigt, befinden sich die Zellen in ihrer optimalen logarithmischen Wachstumsphase.

Inkubieren Sie die Zellen anschließend vor der Ernte 1,5 Stunden lang auf Eis, was dazu beiträgt, die Transformationseffizienz um das Vierfache zu erhöhen. Länger. Inkubationen auf Eis führen zu einer verminderten Effizienz. Ernten Sie anschließend die Zellen, indem Sie die Kulturen in große Zentrifugationsröhrchen gießen.

Schleudern Sie bei 300 g für 10 Minuten nach der Zentrifugation, waschen Sie die Zellen dreimal in eiskaltem Zustand, 10% Glycerin reduzieren Sie jedes Mal das Volumen, so dass für ein Kulturvolumen von hundert Mahlzeiten 20 Mahlzeiten für die erste Wäsche, dann 10 mil und schließlich fünf mil für die letzte Wäsche verwendet werden. Nach den Waschungen werden die Zellen durch die Wiederbelebung in einem bis 10 bis einem bis hundert des ursprünglichen Eiskaltvolumens suspendiert. 10% Glycerin In diesem Stadium können die Zellen aliquotiert, eingefroren und bei minus 70 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung gelagert werden.

Die Umwandlungseffizienz steigt oft nach dem Einfrieren der Zellen an. Vor der Verwendung dieser kompetenten Zellen sollte es aufgetaut, durch Zentrifugation geerntet und vor der Verwendung in frischem, 10%igem Glycerin resuspendiert werden. Um eine Elektroparade durchzuführen, wird ein Elektro verwendet, bei dem es sich um ein Gerät handelt, das einen Hochspannungsimpuls von 2,5 abgeben kann.

Es wird Kilovolt verwendet. Bakterien und DNA werden in Elektroporation, Küvetten, gegeben. Und obwohl der Spalt oder die Weglänge in verschiedenen Küvetten gleich sein kann, variieren sie in Bezug auf das Volumen, das sie aufnehmen können.

Wir verwenden routinemäßig 200 Mikroliter Zellen in einem Durchmesser von 0,2 Zentimetern, um die Zellen zu essen. Bereiten Sie zunächst die DNA-Probe so vor, dass sie frei von Salzen und anderen Verunreinigungen ist. Dies ist wichtig, um die Wahrscheinlichkeit von Lichtbögen während der Elektroporation zu minimieren.

Bevor Sie Bakterien porieren, stellen Sie sicher, dass Ihre DNA-Proben von hoher Reinheit sind. Das Absorptionsverhältnis von zwei 60 zu zwei 80 sollte nahe bei 1,8 liegen. Geben Sie 0,5 bis fünf Mikrogramm der salzfreien DNA in nicht mehr als fünf Mikrolitern Volumen zu 200 Mikrolitern mikrobakterieller Suspension, Eine Kontrollelektroporation ohne DNA zur Überprüfung der Häufigkeit von Antibiotikaresistenzmutanten kann eingeschlossen werden.

Lassen Sie die Mischung dann 10 Minuten auf Eis. Dies reduziert das Vorhandensein von lebenden Zellen in der Probe und Salzen in der DNA-Lösung, wodurch Lichtbögen nach der Eisinkubation minimiert werden, die Zellen gründlich mit einer Pipette oder einem Wirbel vor dem Hochspannungsimpuls neu verteilt werden, um die Zellen wieder zu suspendieren und die Durchmischung der DNA sicherzustellen. Jede Verklumpung der Zellen führt zu Lichtbögen und verringert die Transformationseffizienz.

Als nächstes geben Sie die Mischung auf eine vorgekühlte 0,2 Zentimeter Elektrode gab qve. Achten Sie auch hier darauf, keine Blasen in die Mischung zu bringen. Auch zur Reduzierung von Lichtbögen.

Stellen Sie sicher, dass die Außenseite des qve vollständig trocken ist, bevor Sie ihn in die Pulskammer legen. Nachdem Sie den qve gründlich getrocknet und den Impulsreglerwiderstand auf tausend Ohm eingestellt haben, stellen Sie den qve in die Elektroporationskammer. Nachdem Sie die Spannung auf 2,5 Kilovolt eingestellt haben, legen Sie den Impuls an, bis ein Signalton ertönt, der anzeigt, dass sich der Kondensator im QVE entladen hat.

Eine Zeitkonstante von mehr als 10 zeigt eine erfolgreiche Elektroporation an. Eine erfolglose Elektroporation wird in der Regel durch Lichtbögen angezeigt, die einen Funken verursachen, der oft vermieden werden kann. Indem Sie den Widerstand am Impulsregler ändern, legen Sie den Q Vet wieder für 10 Minuten auf Eis.

Nach der Inkubation wird die Zellsuspension in eine sterile Universalflasche mit fünf mil Lemko-TW-Brühe überführt. Es ist wichtig, die Zellen unmittelbar nach dem Impuls mindestens zehnfach zu verdünnen, um den Zellen zu helfen, sich zu erholen und das Überleben der Transformanten zu erhöhen. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen zwei bis drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, und dann sind sie bereit, nach der Inkubation plattiert zu werden, und ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3000 G für 10 Minuten.

Nach dem Zentrifugieren die Suspension in Lemkenbrühe so verdünnen, dass jede Platte 30 bis 300 Kolonien erhält. Es ist wichtig sicherzustellen, dass resistente Kolonien aus einer einzelnen Zelle entstanden sind, also stellen Sie sicher, dass die Zellen vor dem Plattieren gründlich resuspendiert werden. Wenn die Zellen nicht verdünnt werden, kann es sehr schwierig sein, wirklich resistente Kolonien vor einem Hintergrund zu visualisieren. Rasen empfindlicher Zellen plattiert nun Zellen auf lemkischer Schnecke mit dem entsprechenden Antibiotikum aus.

Sie inkubieren die Platten bei 37 Grad Celsius, bis Kolonien sichtbar werden. Dies wird drei bis fünf Tage dauern, nachdem die Völker gewachsen sind. Zählen Sie die Transformanten.

Zur Berechnung der Transformationseffizienz. Mehrere Faktoren beeinflussen die Effizienz der Transformation. Dazu gehören die Wachstumsphase von Zellen bei der Gewinnung von Elektroporationsmedien sowie die Feldstärke und Zeitkonstante des abgegebenen Pulses.

Die Effizienz der Elektroporationstechnik hängt auch von der Wahl der DNA für die Transformation und manchmal von der Wahl des selektierbaren Markers ab. Wir erzielen routinemäßig Wirkungsgrade von 10 bis zur fünften, bis 10 bis zur sechsten Kolonie pro Mikrogramm DNA, indem wir Hygromycin- oder Streptomycin-Resistenz in ems-Magma verwenden. Um nun herauszuwachsen, streifen die Transformanten die elektroporierten Mykobakterien auf festes Medium plus Selektion aus.

Antibiotikum zwei bis drei Tage lang bei 37 Grad inkubieren. Nach der zwei- bis dreitägigen Inkubation können Sie die Transformatoren wie für die meisten Anwendungen erforderlich analysieren, wobei drei Transformatoren herausgestrichen und analysiert werden sollten. Es ist wichtig, die Identität des extrachromosomalen Plasmids nach der Transformation zu überprüfen.

Da Deletionen und Umlagerungen üblich sind, habe ich Ihnen gerade gezeigt, wie man das Magma von Mycobacterium elektrolyt. Wenn Sie dieses Verfahren mit pathogenen Mikrobakterien durchführen, denken Sie daran, geeignete Sicherheitsmaßnahmen zu ergreifen. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.