Maus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Kulturen

Hallo, ich bin Maya Sibu Bloom vom Institut für Humangenetik und vom Northeast England Stem Cell Institute der Newcastle University. Und dies stammt vom Medical College of Wisconsin. Heute werden wir Ihnen unser Verfahren zur Herstellung von Al-Explanten aus viskoösen Follikeln von Mäusen zeigen.

B-Explan sind das Ausgangsgewebe zur Herstellung von epidermalen Neuralleisten-Stammzellkulturen. Dieses Verfahren umfasst die Dissektion des Vibrissenfeldes und die mikrochirurgische Dissektion der Haarfollikel sowie danach die Isolierung der BULs und deren Einbringen in eine Kulturschale. Beginnen wir also.

Dieses Verfahren beginnt mit der Dissektion der Bulge aus adulten Maus-Schnurrhaaren. Üblicherweise verwenden wir Mäuse im Alter von zwei bis sechs Monaten; jüngere Mäuse liefern jedoch tendenziell mehr Stammzellen. Die Tiere werden betäubt und vollständig für etwa drei Minuten in eine 1:1-Mischung aus Betadine und Wasserstoffperoxid zur Desinfektion eingetaucht, anschließend wird die gesamte Maus, insbesondere der Gesichtsbereich, mit 75 %igem Ethanol besprüht und zur Auflichtmikroskopie gebracht.

Im laminarer Luftstromwerkbank die WHI-Polster vorsichtig dissezieren, wobei darauf zu achten ist, die Haarzwiebeln nicht anzuschneiden, und in hängende Kochsalzlösung bei Raumtemperatur geben. Um WHI-Follikel zu dissezieren, die Haut neben dem Follikel mit einer Pinzette festhalten und dann mit einer geraden Schere rund um den Follikel schneiden. Tief schneiden.

Um die Haarbalgen nicht zu verletzen, heben Sie den Vibrissenfollikel aus dem Vibrissenpolster heraus und legen Sie ihn in eine neue Platte. Spülen Sie die Follikel in derselben Platte mit frischem HBSS nach. Fixieren Sie einen Haarfollikel mit geschärften Pinzetten und Nadeln auf einer mit Seide beschichteten Glas-Petri-Schale, die HBSS enthält.

Spülen Sie loses Fettgewebe und Hautgewebe mit Pufferstößen, bis der Schnurrhaarfollikel sauber ist. Falls erforderlich, schneiden Sie den Nerv zum Schnurrhaarfollikel durch und entfernen Sie anhaftendes Gewebe durch Abkratzen und wiederholtes Spülen mit HBSS. Schneiden Sie den visko-Follikel mit einem Mikromesser längs durch.

Vermeiden Sie es, zu tief zu schneiden, da dies die Ausbuchtung verletzen würde. Entfernen Sie jegliches Blut durch wiederholtes Spülen mit HBSS, bis es vollständig beseitigt ist. Das Auftreten von Blut ist ein guter Hinweis darauf, dass der Schnitt tief genug war.

Als Nächstes führen Sie einen Querschnitt oberhalb der Ebene des Conus sinustis und anschließend einen zweiten Querschnitt auf der Ebene des Ring sinustis, unmittelbar unter der Haut, im isolierten Follikelstück durch. Nun wird die Ausbuchtung innerhalb der Kapsel sichtbar. Sehen Sie, da ist sie.

Nehmen Sie ein Ende der Kapsel mit der Pinzette und entfernen Sie die Ausbuchtung. Nun sehen Sie die leere Kapsel und den isolierten Ausbuchtungs-Pool. Legen Sie die isolierten Ausbuchtungen in eine separate Kulturplatte in HBSS bei Raumtemperatur.

Stellen Sie sicher, dass kein anderes Gewebe die gesammelten Bulgen verunreinigt. Zu diesem Zeitpunkt können Bulgenpflanzen vor der Kultur in Bul-Pflanzen kultiviert werden. 35-Millimeter-Kulturplatten werden mit Kollagen beschichtet, indem Tropfen aus 50 Mikroliter Kollagen und 10 Mikroliter steril

6 % Salzlösung nebeneinander. Gut mit einer doppelt gebogenen Pasteurpipette mischen und zum Rand der Kulturplatte schieben. Über Nacht in einer sauberen Umgebung inkubieren, aber nicht austrocknen lassen. Zu diesem Zweck verwenden wir einen Exsikkator mit einer Wasserplatte am Boden.

Am nächsten Tag, dem Tag der Kultur, spülen Sie die Platten mit Kochsalzlösung aus und präinkubieren Sie die mit Kollagen beschichteten und gespülten Kulturplatten etwa drei Stunden lang im Brutschrank mit Kulturmedium. Das Kulturmedium besteht aus 85 % alpha-modifiziertem MEM, 10 % fetalem Kälberserum und 5 % Extrakt aus Hühnerembryonen vom Tag 11.

Nach der Vorinkubation das Kulturmedium von den Platten entfernen und mehrere BULs mit so wenig Medium wie möglich hinzufügen. Überschüssiges Kulturmedium entfernen. Eine Stunde lang im Zellinkubator in einer befeuchteten Atmosphäre mit 10% Sauerstoff und 5% CO2 inkubieren.

Nach einer Stunde langsam 1,5 Milliliter Kultur hinzufügen. KULTURPFLANZEN MITTELS CHE sollten auf dem Kollagen-Substrat haften; täglich 50 % des Kulturmediums erneuern. Okay, jetzt geht’s los.

Und nun ein Blick auf die Kulturen. Innerhalb von drei bis vier Tagen wandern stark migrierende Zellen aus den Ballen aus. Achten Sie auf ihre sternförmige Morphologie und das vorherrschende Fehlen von Zell-Zell-Kontakten.

In den nächsten Tagen werden weitere Zellen auswandern und die bereits ausgewanderten Zellen proliferieren rasch. Wichtige seltene Zellen mit abgeflachter Morphologie werden sichtbar, die manchmal erst mehrere Tage später als epidermale Neuralleisten-Zellen erscheinen. In diesen Kulturen sind manchmal auch solche Zellen zu sehen. Es handelt sich dabei nicht um epidermale Neuralleisten-Stammzellen, sondern um weniger bewegliche, vermutete epidermale Stammzellen oder Vorläuferzellen. Kulturen, die aus diesen Zellen bestehen, sollten verworfen werden.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Bulge-Explant-Kulturen herstellt, die epidermale neurale Stammzellen enthalten. Da neurale Zellen sehr wandersaktiv sind, verlassen sie den Bulge-Explanten innerhalb von drei bis vier Tagen. Nach der Auswanderung wird der Bulge dann entfernt, und die reine Population der neuralen Zellen verbleibt in der Kulturplatte.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Maus sorgfältig zu desinfizieren, um Kontaminationen zu vermeiden. Außerdem muss tief in das Risikokissen geschnitten werden, um die Risikofollikel nicht zu verletzen. Bei den Kulturen ist es wichtig, zwischen den migrierenden distillierten Zellen, den Neuralleistenzellen und den nicht migrierenden, kieselsteinförmigen Keratinozyten zu unterscheiden.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.