Molekulare Evolution der Tre-Rekombinase

Mein Name ist Frank Alz. Ich bin Gruppenleiter am Maxx-Plunk-Institut für Makuläre Zellbiologie und Genetik in Dresden. Und ich werde nun über unsere Arbeit an der Entwicklung standortspezifischer Rekombinasen für die molekulare Chirurgie berichten.

Grundsätzlich als ein Werkzeug, um vordefinierte Sequenzen aus dem Genom herausschneiden zu können, und genauer gesagt, um HIV-infizierte Zellen vom Virus zu befreien. Im Wesentlichen soll also das HIV-Provirus aus dem Genom infizierter Zellen entfernt werden. Ein weiterer konzeptioneller Ansatz besteht darin, ein bereits etabliertes genetisches Werkzeug – die Cre-Rekombinase – so anzupassen, dass es eine vordefinierte Zielstelle bindet, erkennt und nutzt.

Wir stellten uns daher die Frage, ob wir eine standortspezifische Rekombinase herstellen können, die an eine Sequenz bindet, die natürlich im LTR eines HIV-Virus vorkommt. Und wenn uns das gelingen würde, dann erwarten wir, dass es anschließend möglich sein sollte, das Provirus aus dem Genom auszuschneiden. Grundsätzlich durchläuft der virale Lebenszyklus ein Stadium, in dem das Virus in die Wirtszelle integriert wird und anschließend durch eine Reverse Transkription eine DNA-Vorlage erzeugt, die von zwei terminalen Wiederholungssequenzen flankiert ist.

Sie werden lange terminale Wiederholungen oder kurz LTRs genannt. Anschließend wird dies in den Zellkern gebracht und integriert sich mehr oder weniger zufällig in das Genom des Wirtsgenoms. So entsteht eine Situation, in der ein sogenanntes Provirus vorliegt, das integriert ist und von zwei langen terminalen Wiederholungen, also zwei LTRs, flankiert wird.

Die Vorstellung war nun, dass, wenn wir einen Rekombinase herstellen könnten, die eine im LT-R vorhandene Sequenz erkennt, wir in der Lage sein sollten, das Provirus als Kreis aus dem Wirtsgenom auszuschneiden und somit das Virus aus den Zellen zu eliminieren. Das war die konzeptionelle Idee. Die Rekombinase ist jedoch tatsächlich ein DNA-bindendes Protein, das eine sehr spezifische Stelle erkennt.

Es verfügt also über eine DNA-Bindungsdomäne, die eine bestimmte Sequenz innerhalb der DNA erkennt. Nur wenn diese exakte Sequenz gefunden wird, ist das Enzym aktiv. Es ist nicht aktiv gegenüber irgendwelchen anderen Sequenzen.

Die Prinzipien der molekularen Evolution sind im Grunde jedem bekannt, weil es nichts anderes als Züchtung ist. Ein Prinzip der molekularen Evolution besteht darin, dass man Mutationen einführt und anschließend einen Selektionsprozess durchführt, bei dem eine bestimmte Eigenschaft ausgewählt wird. Es ist dasselbe wie bei der Pflanzenzüchtung.

Sie wissen, dass Sie bestimmte Merkmale wie eine bestimmte Größe oder eine bestimmte Farbe wünschen, und wählen dann immer wieder die Nachkommen der nächsten Generation aus, die diese Merkmale aufweisen, um sie miteinander zu kreuzen. Genau dasselbe tun wir bei Molekülen. Es ist im Grunde dasselbe, nur im kleinen Maßstab.

Wir beginnen also mit einem Enzym, das eine bestimmte Aktivität besitzt – in unserem Fall die CRE-Rekombinase – sowie mit einem Wildtyp-Protein. Anschließend mutieren wir leicht die Stelle, an die diese Rekombinase bindet, wobei die Aktivität weiterhin sehr, sehr, sehr gering bleibt. Danach führen wir zufällige Mutationen in das Enzym, in die Rekombinase ein, und selektieren Mutanten, die nun in der Lage sind, an diese mutierte Stelle zu binden.

Wenn wir dies einmal erreicht haben, können wir anschließend die verschiedenen Mutanten miteinander kombinieren, um schließlich das gewünschte Endprodukt zu erhalten, bei dem die Rekombinase die in der LTR definierte Sequenz erkennt. Wir beginnen also, wie bereits erwähnt, mit einer Zufallsmutagenese-Bibliothek. Dies erfolgt typischerweise mittels fehleranfälliger PCR.

Daher verwenden wir PCR-Bedingungen, bei denen beispielsweise die Tuck-Polymerase viele Fehler macht. Auf diese Weise erzeugen wir eine zufällige Bibliothek, die Mutationen an verschiedenen Stellen enthält. Wir können auch einen Mutator-Stamm, einen bakteriellen Mutator-Stamm, verwenden, der zahlreiche Mutationen in bestimmten Transkripten hervorruft.

Und diese werden dann als Ausgangsmaterial verwendet. Die andere Technologie, die wir nutzen, ist nach einer gewissen Zeit ein DNA-Shuffling. Dabei handelt es sich im Wesentlichen um eine Methode, die es ermöglicht, verschiedene vorteilhafte Mutationen zu kombinieren, da man nicht genau weiß, welche der Mutationen vorteilhaft ist, aber man erhält verschiedene Mutanten mit unterschiedlichen Mutationen.

Sie haben also ein Gen mit einer hier vorliegenden Mutation, die vorteilhaft ist. Sie haben einen zweiten Klon, der eine Mutation an dieser Stelle aufweist, und um diese beiden Mutationen zusammenzubringen, führen Sie nun eine zufällige Fragmentierung der verschiedenen Stücke durch und setzen diese anschließend in einer PCR-Reaktion wieder zusammen. Nun erhalten Sie mit einer bestimmten Häufigkeit eine Kombination aus beiden, bei der ein Teil der Rekombination aus diesem Mutanten und ein anderer Teil aus jenem Mutanten stammt.

Und dann wird dieser hier eine zusätzliche Wirkung haben, die verbessert und es ermöglicht, viel schneller die Kandidaten auszuwählen, die die gewünschten Eigenschaften aufweisen. Ich würde daher die Definition festlegen, bei der ich sage, dass das Wildtyp-Protein absolut keine Aktivität an einer bestimmten Stelle besitzt. Wenn wir beispielsweise unsere Sequenz nehmen, die wir aus dem LTR des H-I-V-L-T-R ausgewählt haben, und wenn wir Cre-Rekombinase auf diese Sequenz anwenden, wird es absolut keine Aktivität geben.

CRE-Rekombinase ist nicht in der Lage, die Stelle zu rekombinieren, und wenn Sie dann ein Enzym haben, das in der Lage ist, diese Sequenz zu binden und zu rekombinieren, haben Sie per Definition eine neue Rekombinase. Wir haben nicht im Voraus festgelegt, wie viele Zyklen wir durchführen wollten, aber wir führten so viele Zyklen durch, wie notwendig waren, bis wir ein Enzym mit der gewünschten Aktivität erhalten hatten. Wir begannen also mit sehr geringfügigen Mutationen in der Stelle und kombinierten anschließend die verschiedenen Mutationen miteinander.

Dies war einer der wichtigen Schritte dafür, dass dieser Prozess funktioniert. Wir durchliefen daher Zwischenstufen und mussten viele Zyklen durchlaufen, um ein Enzym zu finden, das anschließend aktiv genug war, um in den nächsten Zyklus überzugehen. Es ist dem Züchtungsprozess in vieler Hinsicht sehr ähnlich.

Sie legen eine bestimmte gewünschte Aktivität sowie ein bestimmtes gewünschtes Merkmal fest und beginnen dann mit der Züchtung. Solange Sie nicht das Erwünschte erreicht haben, sind Sie noch nicht am Ziel und müssen weitere Generationen durchlaufen. Im Wesentlichen liegt hierin der Kern des Verfahrens.

Ich sollte außerdem erwähnen, dass die 120 Evolutionszyklen beziehungsweise genauer einhundertachtundzwanzig, lediglich einen Zwischenschritt darstellen, an dem wir feststellten: „Jetzt können wir aufhören, da wir bereits eine gewisse Aktivität beobachten“. Die derzeit vorliegenden Rekombinasen sind immer noch weniger aktiv als die CRE-Rekombinase an ihrer Wildtyp-Seite. Um daher eine aktivere Rekombinase zu erhalten, müssten wir weitere Evolutionszyklen durchführen.

Es endet also nicht grundlegend dort, wo wir uns derzeit im Evolutionsprozess befinden. Ich sehe keine technischen Grenzen. Es ist fraglich, wie weit man dies vorantreiben kann.

Die Lox-LTR-Seite, also die Sequenz, die Sie im LTR-HA finden, weist eine Sequenzähnlichkeit von 50 % mit der natürlichen Lox-P-Seite auf, der natürlichen Seite, die die Rekombinase erkennt. Die Frage ist also, ob man noch weiter gehen kann, und das wissen wir noch nicht, aber die Tatsache, dass wir nur eine Sequenzähnlichkeit von 50 % zur Wildtyp-Sequenz hatten, legt nahe, dass man dies noch weiter vorantreiben kann. Die Rekombinase funktioniert gut in menschlichen Zellkulturzellen, auch wenn sie, wie bereits erwähnt, nicht ganz so aktiv ist wie die Cre-Rekombinase auf ihrer natürlichen Sequenz.

Die Stabilität ist vermutlich etwas geringer als die der untersuchten Rekombinase, also der Wildtyp-Enzymform, und es wären weitere Selektionen sowie mehr Evolutionszyklen erforderlich, um diese Eigenschaften in Zukunft zu verbessern. Der erste Schritt besteht also darin, die Erkennungsstelle sowie speziell diese Rekombinase – die Drei-Rekombinase – zu optimieren, ihre Aktivität zu steigern, möglicherweise andere, besonders auffällige Stellen zu finden, die sich gut als Zielstrukturen in einem LTR eignen, und eine sehr effiziente Rekombinase dafür zu entwickeln. Anschließend müsste diese Rekombinase in verschiedenen Tests untersucht werden, zunächst erneut in Zellkultursystemen, aber danach ganz entscheidend in Tiermodellen.

Daher müssten wir überprüfen, ob diese Rekombinase unerwünschte Nebenwirkungen in einem Organismus hat. Und natürlich ist ein sehr anspruchsvoller Aspekt die Entwicklung eines geeigneten Abgabesystems für diese Rekombinase, was keineswegs trivial ist. Dies stellt zudem einen eigenen Forschungsbereich dar, der entwickelt werden muss.

Es handelte sich im Grunde um einen Gentherapie-Ansatz, den wir verfolgen mussten. Ich denke, wir beobachten eine Verschiebung der Medizin hin zu immer molekulareren Ansätzen. Dafür benötigen wir natürlich Werkzeuge, um auf einer solchen Größenordnung arbeiten zu können.

Und hier sehe ich die Zukunft des Evolutionsprozesses. Wir müssen maßgeschneiderte Enzyme herstellen, die für einen Prozess geeignet sind, den wir tatsächlich nutzen möchten. Im Fall der Rekombinase könnte man dies als eine Analogie zu einem Werkzeug für einen Chirurgen betrachten, der während einer Operation etwas entfernen muss. Hier benötigen wir nun Werkzeuge, mit denen ein molekularer Chirurg gezielt ein bestimmtes DNA-Stück aus dem Genom herausschneiden kann.

Und dafür benötigt er die Werkzeuge, um dies bewerkstelligen zu können. Die molekulare Evolution kann diese Funktion im Grunde erfüllen. In der Natur existieren viele Enzyme mit sehr wünschenswerten Eigenschaften, um dies durchführen zu können.

Und wir müssen sie lediglich an unsere Bedürfnisse anpassen, um sie nützlich zu machen. Ich denke, dass die molekulare Evolution hier eine sehr wichtige Rolle spielen kann. Wo die Grenzen liegen, ist derzeit schwer zu sagen, da die Technologie bzw. dieses Forschungsfeld noch in den Kinderschuhen steckt.

Die Zeit wird zeigen, wo die Grenzen liegen. Ich bin sicher, dass es einige geben wird, aber im Moment denke ich, dass es mehr Möglichkeiten als wirkliche Einschränkungen gibt.