Name: Interview: HIV-1 Provirus-DNA Excision Mit einem Evolved Rekombinase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-16T23:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Erfahren Sie, wie eine entwickelte Rekombinase integrierte HIV-1-Provirus-DNA aus infizierten Zellen excidiert. Diese Methode zeigt Potenzial für zukünftige HIV-Eradikationsstrategien und Gentherapie.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

interview: hiv-1 provirus-dna excision mit einem evolved rekombinase

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

HIV-1 integriert sich in das Host-Chromosom von infizierten Zellen und weiterhin als Provirus durch long terminal repeats flankiert. Aktuelle Behandlungsstrategien in erster Linie Ziel-Virus-Enzyme oder Virus-Zell-Fusion, die Unterdrückung der viralen Lebenszyklus ohne Beseitigung der Infektion. Da die integrierte Provirus wird durch diese Ansätze, neue resistente Stämme von HIV-1 gezielten entstehen kann. Hier berichten wir, dass die gentechnisch Rekombinase Tre (siehe Molekulare Evolution der Tre-Rekombinase, Buchholz, F., Max-Planck-Institut für Molekulare Zellbiologie und Genetik, Dresden) effizient Verbrauchsteuern integrierte HIV-1 Provirus-DNA aus dem Genom der infizierten Zellen. Wir produzierten loxLTR mit viralen Pseudotypen und infizierten HeLa-Zellen zu untersuchen, ob Tre-Rekombinase kann Verbrauchsteuern das Provirus aus dem Genom des HIV-1 infizierten menschlichen Zellen. Ein Virus-Partikel-Releasing-Zelllinie wurde kloniert und transfiziert mit einem Plasmid, das Tre oder mit einer Kindersicherung Vektor. Rekombinase-Aktivität und Virus-Produktion überwacht wurden. Alle Assays demonstriert die effiziente Löschung der Provirus aus infizierten Zellen ohne sichtbare zytotoxische Wirkung. Diese Ergebnisse dienen als proof of principle, dass es möglich ist, eine Rekombinase entwickeln, um gezielt eine HIV-1 LTR und dass diese Rekombinase ist in der Lage Auslösen der HIV-1-Provirus aus dem Genom des HIV-1-infizierten menschlichen Zellen. Bevor ein technisch-Rekombinase die therapeutische Arena betreten konnten, müssen jedoch erhebliche Hindernisse zu überwinden. Zu den wichtigsten Themen, mit denen wir konfrontiert sind eine effiziente und sichere Lieferung an Zielzellen und das Fehlen von Nebenwirkungen.

Aktuelle HIV-1-Strategien handeln, um den viralen Lebenszyklus zu unterdrücken, aber nicht effektiv beseitigen Infektion. Hier zeigen wir, dass ein technisch Rekombinase effizient Verbrauchsteuern integrierte HIV-1 Provirus-DNA aus dem Genom der infizierten Zellen.

Interview: HIV-1 Provirus-DNA Excision Mit einem Evolved Rekombinase

HIV-1 integriert sich in das Wirtschromosom infizierter Zellen und persistiert als Provirus, das von langen terminalen Wiederholungen (long terminal repeats) flankiert wird. Aktuelle Behandlungsstrategien ...

Ich bin JohE Hvar und befinde mich am Institut für Zellbiologie und Biologie des HE Pet Instituts in Hamburg, Deutschland. Das HE PET Institut ist ein Institut für Grundlagenforschung, das sich ausschließlich auf humane, pathogene Viren und damit verbundene Fragestellungen konzentriert, würde ich sagen. Unsere Abteilung interessiert sich hauptsächlich dafür, die Regulation der HIV-Genexpression zu untersuchen sowie die insbesondere intrazellulären Wechselwirkungen von HIV mit Bestandteilen der Wirtszelle.Basierend auf diesen Daten versuchen wir außerdem, neue experimentelle Therapien gegen die HIV-Erkrankung zu entwickeln. Das Problem bei HIV ist, dass HIV ein Retrovirus oder Lentivirus ist und wie jedes Retrovirus integriert es nach der Infektion der Wirtszelle das virale Genom in das Genom der Wirtszelle. Bislang kann man den integrierten Provirus nicht mehr beseitigen.Das bedeutet, was die Therapie betrifft, dass wir es bei dieser Krankheit um eine chronische Erkrankung mit lebenslanger Therapie zu tun haben und damit grundsätzlich um all die mit lebenslangen Therapien verbundenen Probleme wie Nebenwirkungen der Medikamente, Auftreten von Resistenzen und so weiter. Nun kennen wi

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier berichten wir über die Generation der Tre-Rekombinase durch gezielte, molekularen Evolution. Tre-Rekombinase erkennt eine vordefinierte Ziel-Sequenz innerhalb der LTR-Sequenzen des HIV-1 Provirus, was in der Exzision und Tilgung des Provirus aus infizierten menschlichen Zellen. Während noch in den Kinderschuhen, wird gerichteten molekularen Evolution erlauben die Erstellung von benutzerdefinierten Enzyme, die als Werkzeuge der molekularen Chirurgie und Molekulare Medizin dienen.

Molekulare Evolution der Tre-Rekombinase

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Wachstumskonkurrenz zwischen nahezu isogenen Viren bietet ein sensitives Maß für die Bestimmung der relativen Replikationsfitness. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen die Konstruktion rekombinanter HIV-1-Klone, die Virusvermehrung und Wachstumskonkurrenz sowie Analysemethoden, die optimiert sind, um empfindliche und konsistente Ergebnisse zu erzielen.

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

Wir beschreiben ein Protokoll zur Amplifikation retroviraler Integrationsstellen aus der genomischen DNA infizierter Zellen, zur Sequenzierung der amplifizierten Virus-Wirt-Verbindungen und zur anschließenden Kartierung dieser Sequenzen auf ein Referenzgenom. Wir beschreiben auch Techniken zur Quantifizierung der Verteilung von Integrationsstellen relativ zu verschiedenen genomischen Annotationen mit Hilfe von BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Dieses Manuskript beschreibt die experimentelle Prozedur und Softwareanalyse für einen bidirektionalen Integrationsort-Assay, der gleichzeitig stromaufwärts und nachgeschaltete Vektor-Host-Junction-DNA analysieren kann. Bidirektionale PCR-Produkte können für jede nachgeschaltete Sequenzplattform eingesetzt werden. Die resultierenden Daten sind nützlich für einen hochdurchsatzreichen, quantitativen Vergleich von integrierten DNA-Targets.

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

In voller Länge individuelle proviralen Sequenzierung (FLIPS) bietet eine effiziente und Hochdurchsatz-Methode für die Verstärkung und die Abfolge der einzelnen, in der Nähe von Full-Length (intakt und Defekte) HIV-1-Proviruses und ermöglicht die Bestimmung ihres Potenzials Replikation-Kompetenz. FLIPS überwindet Grenzen der früheren Assays entwickelt, um die latente HIV-1-Reservoir-Sequenz.

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

Wir präsentieren einen Genom engineering Workflow für die Generation der neuen in-vitro-Modelle für HIV-1-Infektion, die proviralen Integration an ausgewählten genomischen Standorten zu rekapitulieren. Ausrichtung der HIV-abgeleitete Reporter wird durch CRISPR-Cas9-vermittelten, ortsspezifische Genom Manipulation erleichtert. Detaillierte Protokolle für einzellige Klon-Generierung, Screening und richtige targeting Überprüfung stehen zur Verfügung.

CRISPR-Cas9-basierte Genom Engineering Jurkat Reporter Modelle für HIV-1-Infektion mit ausgewählten proviralen Integration Websites generieren

Hier präsentieren wir einen Tiefe Sequenzierung Ansatz, der eine objektive Bestimmung der im Entstehen begriffenen 3'-Termini sowie mutagenen Profile der einzelsträngigen DNA-Moleküle enthält. Die Hauptanwendung ist die Charakterisierung der im Entstehen begriffenen retrovirale ergänzende DNAs (cDNAs), die Zwischenprodukte, die während des Prozesses der retroviralen reversen Transkription generiert.

Bestimmende 3'-Termini und Sequenzen der im Entstehen begriffenen einsträngige virale DNA-Moleküle während HIV-1 Reverse Transkription in infizierten Zellen

Ein hoher Durchsatz-Protokoll für funktionale Bewertung von HIV effiziente Reaktivierung und Clearance von latenten Proviruses ist beschrieben und durch die Auswirkungen von Interventionen auf die Transkription von HIV-Tests und Spleißen angewendet. Repräsentative Ergebnisse des Effekts der Latenz Umkehrung Agenten auf LTR-driven Transkription und Spleißen stehen zur Verfügung.

Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Einführung einer kontrollierbaren genetischen Vielfalt in das Genom des Hepatitis-C-Virus durch die Kombination von mutierter RNA-Synthese in voller Länge mit fehleranfälliger PCR und umgekehrter Genetik. Die Methode stellt ein Modell für die Phänotypauswahl dar und kann für 10 kb lange RNA-Virusgenome verwendet werden.

Reverse Genetik zur Entwicklung von RNA-Virusvarianten mit positivem Sinn

Erfahren Sie, wie eine entwickelte Rekombinase integrierte HIV-1-Provirus-DNA aus infizierten Zellen excidiert. Diese Methode zeigt Potenzial für zukünftige HIV-Eradikationsstrategien und Gentherapie.

Interview: HIV-1 Provirus-DNA Excision Mit einem Evolved Rekombinase

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