Interview: HIV-1 Provirus-DNA Excision Mit einem Evolved Rekombinase

Ich bin JohE Hvar und gehe an die Abteilung für Zellbiologie und Biologie des HE Pet Institute in Hamburg, Deutschland. Das HE PET Institute ist ein Grundlagenforschungsinstitut, das sich ausschließlich auf humane PE, pathogene Viren und ja, und damit verbundene Themen konzentriert, würde ich sagen. Unsere Abteilung interessiert sich daher vor allem für die Erforschung der Regulation der HIV-Genexpression und der Interaktion in der besonders intrazellulären Interaktion von HIV mit Komponenten der Wirtszelle.

Auf der Grundlage dieser Daten versuchen wir auch, experimentelle neue und experimentelle Therapien für die HIV-Krankheit zu entwickeln. Das Problem mit HIV ist, dass HIV ein Retrovirus oder Lentivirus ist und wie jedes Retrovirus integriert HIV bei der Infektion der Wirtszelle das virale Genom in das Genom der Wirtszelle. Bisher wird man das integrierte Provirus nicht mehr los.

Das heißt, in Bezug auf die Therapie sprechen wir über eine chronische Krankheit, mit einer lebenslangen Therapie und im Grunde mit allen Problemen, die mit lebenslangen Therapien verbunden sind, wie Nebenwirkungen der Medikamente, Auftreten von Resistenzen und so weiter. Nun, seit vielen Jahren kennen wir in der Grundlagenforschung die sogenannte Rekombinase, die natürlich in Rekombinationen wie zum Beispiel in Hefe oder in Bakterien vorkommt. Und diese Rekombinationen werden erkannt: spezifische DNA-Sequenzen und Gene werden gemischt und das Genom neu angeordnet und so weiter.

Und vor allem eine Rekombinase namens Decre-Rekombination wird in der Grundlagenforschung und die situ in der Grundlagenforschung eingesetzt. Und CRE erkennt im Grunde seine spezifische Reihenfolge. Und wenn Sie eine Sequenz haben, die sich zwischen zwei Erkennungsstellen befindet, ist CRE in der Lage, die dazwischenliegende Sequenz im Grunde zu entfernen.

So ist die Idee schon seit 10 oder 15 Jahren von der Medizin das Virus auszurotten und auf der anderen Seite, wie Rekombinase wie Trauer zum Beispiel zu verwenden, um das Profil zu entfernen. DNA, dies sollte theoretisch möglich sein, da HIV nach der Infektion sein RA-Genom in DNA zurücktranskribiert und, und aufgrund dieses reversen Transkriptionsprozesses werden Sequenzen erzeugt, die als lange terminale Wiederholungen bezeichnet werden und sie markieren im Grunde die fünf Bris oder den Anfang und die freie Krempegrenze, das Ende des integrierten Profils D.So in der Theorie, Wenn man mit einer drei Rekombination aufwarten könnte, die re spezifisch in einer Sequenz in der LTR erkennt, so würde die Meinungsverschiedenheit im Grunde das fünfprimale Ende und das freie BRI-Ende des integrierten Profils angreifen, die DNA herausschneiden und im Grunde das Virus aus der desinfizierten Zelle ausrotten. Nun, das Problem mit HIV ist, dass wir verschiedene Isolate haben, vielleicht auch, in, in einer, in einer, in einer einzigen Person, einem einzigen Patienten, aber, insbesondere wie wir bisher wissen, ist die Sequenz am Anfang und am Ende des Virus des viralen Genoms.

Mit anderen Worten, die LTRs sind stärker konserviert als beispielsweise die HIV-Gene. Ich denke also, dass es eine gute Chance gibt, dass wir mit nur ein paar Rekombinanzzahlen davonkommen, die im Grunde die enorme Reife aller HIV-Isolate anerkennen. Und wenn nicht, dann müssen wir im Grunde genommen durch molekulare Evolution ein neues erzeugen, das in Zukunft halbautotomisiert werden kann.

Und das wird es, der Prozess wird viel schneller sein als im Labor. Bei unserem Kollegen kam Dr. Frank vom Max Splunk Institut ans Ende des Bildes. Im Grunde ist er ein Experte für Rekombinase und alles.

Im Grunde genommen verwendete er das, was wir eine molekulare Evolutionsmethode nennen. Die Methode basiert jedoch auf der PCR-Polymer-Kettenreaktionstechnologie. Und er nimmt das Gen der natürlich vorkommenden Rekombinase-Gradkämme und richtet eine PCR oder mehrere PCR-Reaktionen unter Bedingungen ein, die zufällig Mutationen einführen.

Und der Trick besteht nun darin, die neuen Versionen der Rekombinase auszuwählen, die eine neue Kapazität oder eine neue Aktivität erworben haben, nämlich das Erkennen von HIV-spezifischen Sequenzen. Und er tut dies in sich wiederholenden Zyklen. Er, er, er brauchte etwa 120 oder über 120 Zyklen, um diese molekulare, diese Art von molekularer Evolutionsmethode durchzuführen.

Als er schließlich diese spezifische, jetzt drei für LTR-spezifische Rekombinanz bezeichnete Rekombinanz mit dieser neuen Rekombinanz entwickelte, die nun spezifisch HIV-Sequenzen erkennt. Die erste Studie hier war also die, die, die Experimente mit den Rekombinanten wurden hier am HE PET Institut in Hamburg durchgeführt. Und was wir gemacht haben, ist, dass wir diese Rekombinanz mit Vektoren, Genvektoren, in menschliche Zellkulturen eingebracht haben, die mit einem mehr oder weniger klinischen Isolat von H, H, H, V, infiziert worden waren.

Und im Laufe der Zeit, über sechs bis acht Wochen, konnten wir das unter Beweis stellen. Jetzt ist die Rekombinante quantitativ spannend, sie haben das HIV-Profil DA integriert, im Grunde wird die gesamte Kultur geheilt, indem HIV beseitigt wird. Es gibt sicherlich zahlreiche Probleme mit dieser Technologie.

Zunächst müssen wir sicherstellen, dass die Expression der Rekombinase keine toxischen Nebenwirkungen verursacht. Das erwarten wir nicht, denn für natürlich vorkommende Rekombinationen wie gre gibt es sogenannte transgene Tiere. Sie drücken diese GRE-Rekombination aus und okay, es gibt also einige Probleme, aber nicht zu signifikant.

Das darf ich an dieser Stelle sagen. Es besteht also die Hoffnung, dass es keine toxischen Nebenwirkungen gibt, aber man weiß nie, wann man die Experimente machen muss. Und es gibt auch Probleme, dass ich vielleicht nicht jedes klinische Isolat damit erkennen werde, damit wir das dominante Isolat, das HIV-Isolat bei einem Patienten, loswerden können.

Aber wir werden im Laufe der Zeit aus kleineren, kleineren Isolaten auswählen. Das ist, wir wissen es nicht, wir müssen diese Experimente machen. Dann gibt es ein großes Problem mit der Genübertragung, mit der Vektortechnologie.

Wir müssen sogenannte lentivirale Vektoren oder auch retrovirale Vektoren verwenden, um das Gen oder das Rekombinase-Gen zu liefern. Gibt es also Nebenwirkungen? Gibt es, verursachen diese Vektoren toxische Wirkungen?

Das sind alle Fragen, die wir haben. Außerdem hoffen wir, die Aktivität der Waben zu verbessern. Sie, die Rekombination wirkt einfach schneller, als wir es jetzt sehen, ein paar Wochen, die Aktivität.

Das sind also alles offene Fragen, die wir in den nächsten Jahren entwickeln müssen. Und das ist jetzt sicherlich das Problem, weil Rekombinasen oral nicht verfügbar sind. Es wird also keine Pille geben, die Rekombinase-Pille, nur gut, und Sie werden das Virus los.

Wenn wir also über zukünftige Therapien spekulieren, müssen wir über Gentherapie-Ansätze nachdenken. Vielleicht kann man sich also vorstellen, dass wir sogenannte hämatopoetische Stammzellen oder CD 34-positive Zellen aus dem Blut von Patienten von HIV-infizierten Patienten isolieren. Und dann führen wir im Labor das Gen für die Waben in die Zellen dieses Patienten ein.

Schließlich führen wir den Patienten wieder ein, wir injizieren ihn erneut, wir rein, infundieren die Patientenzellen und jetzt haben sie genetisch veränderte Patientenzellen in den Rücken desselben Patienten eingebaut. Was also passieren sollte, ist, dass das Immunsystem oder das hämatopoetische System des Patienten im Laufe der Zeit zumindest teilweise mit Zellen rekonstituiert, die sie bei einer Infektion mit HIV das Virus loswerden können, weil sie jetzt eine Rekombinase exprimieren. Der Effekt wäre also, dass die Viruslast beim Patienten sinkt, aber sicherlich die Lebensqualität verbessert.

Und wir können auch hoffen, dass sich das Immunsystem bei diesen Patienten zumindest teilweise wieder rekonstituiert. Jetzt werden also die, die, die Funktion, die, die Immunzellen, die voll funktionsfähig sind, hoffentlich in der Lage sein, die verbleibenden langwierig infizierten Zellen bei diesen Patienten anzugreifen. Ob wir HIV wirklich vollständig, vollständig von einem Patienten ausrotten können oder nicht, das können wir zu diesem Zeitpunkt nicht sagen.