Name: In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Markierung humaner embryonaler Stammzellen mit Mangan(II)-chlorid für die Magnetresonanztomografie. Diese Methode ermöglicht die verlässliche Darstellung lebensfähiger Zellen über Kalziumkanäle.

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Mangan Kennzeichnung von humanen embryonalen Stammzellen <ol><li> Trypsinize der humanen embryonalen stammt, die in Feeder-freien Bedingungen für 5 Minuten wurden kultiviert. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von Nährmedien. </li><li> Spin down die Zellen durch Zentrifugation bei 800 rpm für 5 Minuten bei 20 ° Celsius. Nach Resuspendieren des Zellpellets, zählen die Anzahl der Zellen durch Trypanblau-Färbung. Basierend auf der Zellzahl erhalten, teilen sich die Zellen in vier Aliquots von 3 Millionen Zellen in konische Rohre. Pellet die Zellen wieder abzentrifugiert. </li><li> Kurz vor dem Start der Mangan-Kennzeichnung, lösen sich frische Manganchlorid mit 0,9% Natriumchlorid-Lösung, um eine 0,1 Millimeter Manganchloridlösung machen. </li><li> Um Calcium-Kanal-Aktivität zu beobachten, wurden vier Proben hergestellt. Die erste Probe wird unserer Kontrolle, welche Zellen in 0,9% Natriumchlorid allein inkubiert enthält. Die zweite Probe enthält Zellen in 0,1 mM MnCl 2 inkubiert. Beispiel 3 und 4 enthalten Zellen in 0,1 mM MnCl 2 entweder mit 5 uM der Ca 2 +-Kanal-Agonisten inkubiert (S )-(-)- Bay K8644 oder 250 uM der Ca 2 +-Kanal-Antagonisten, Verapamil. Inkubieren Sie die vier Proben bei 37 ° Celsius mit 5% CO 2 für 30 Minuten. </li><li> Nach 30 Minuten Spin-Down die Zellen bei 800 rpm für 5 Minuten bei 20 ° Celsius. Dann saugen Sie den Überstand und waschen Sie die markierten Zellen zweimal mit PBS. Nach dem Waschen wieder auszusetzen jedes Pellet mit 200 ul PBS und Überführung in PCR-Röhrchen. Diese Pellets werden in der Regel weiß. </li></ol> Eisen Kennzeichnung von humanen embryonalen Stammzellen <ol><li> Mix klinisch-grade Protaminsulfat mit destilliertem Wasser zu einer 1 mg / ml Stammlösung erhalten. </li><li> In ein Röhrchen mit menschlichen embryonalen Stammzellen Kulturmedien, fügen ferumoxides bei 100 ug / ml durch Zugabe von 12 ug / ml Protaminsulfat gefolgt. Mischen Sie die Lösung kräftig für fünf Minuten. </li><li> Add gemischte Lösung, die gleiche Menge des Zellkulturmedien zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml ferumoxides und 6 pg / mL der Protaminsulfat zu beschriften Zellen zu erreichen. Inkubieren Zellen in dieser Lösung für 12 Stunden. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, mit dem letzten Waschschritt mit 10U/ml Heparin an die extrazelluläre ferumoxides-Protaminsulfat komplexen aufzulösen. Nach dem Waschen trypsinize Zellen zu einer einzigen Zelle Suspension zu erhalten. </li><li> Zählen Sie die Zellen und Aliquot in die erforderliche Anzahl von Proben. Nach dem Waschen wieder auszusetzen jedes Pellet mit 200 ul PBS und Überführung in PCR-Röhrchen. Diese Pellets sollten dunkel orange-braun in Farbe sein. </li></ol> Performing Cellular Magnetic Resonance Imaging <ol><li> Machen Sie ein Phantom, um die Röhrchen mit den Zellpellets zu stabilisieren und auch Artefakte aus der Umgebungsluft während des Scanvorgangs zu vermeiden. Dazu mischen 0,8% Agar und 1% Kupfersulfat in destilliertem Wasser und bringen es zum Kochen von microwaving für 5-7 Minuten. Coole diese Mischung für mindestens 1 Stunde vor der Abtastung zu einem Gel zu erreichen. </li><li> Das Röhrchen mit dem markierten Zellpellets werden in dem Phantom für das Scannen platziert. In-vitro-Zell-MRT ist bei Signa HDx 3T-MRT (GE Medical Systems) mit klinischen Kniespule durchgeführt. </li><li> Scan der Mangan-markierten Zellen für jede der drei Proben mit einem Spin-Echo-Sequenz: TR; Wiederholung Zeit = 800 ms. TE; Echo Zeit = Minimum, FOV; Sichtfeld = 12 x 12 cm; matrix = 256x256, NEX 1. </li><li> Scan der Eisen-markierten Zellen mit Hilfe eines Gradienten-Echo-Sequenz. Wir verwenden die folgenden Einstellungsmöglichkeiten für den Imaging: TR = 100 ms; TE = 10 ms, FA; Flipwinkel = 30 °; FOV = 12 x 12 cm; Matrix = 256 x 256, NEX 1. </li></ol> Die Analyse der MRT-Ergebnisse <ol><li> Analysieren Sie Bilder von MRT-Untersuchung von 4 verschiedenen Proben von Mangan-markierten Zellen: <ul><li> Probe Nr. 1 ist unsere steuern, welche Zellen in 0,9% Natriumchlorid allein inkubiert enthält. </li><li> Probe Nr. 2 enthält Zellen in 0,1 mM MnCl 2 inkubiert. </li><li> Probe Nr. 3 enthält Zellen in 0,1 mM MnCl 2 mit 5 uM der Ca 2 +-Kanal-Agonisten (S )-(-)- Bay K8644 inkubiert. </li><li> Probe Nr. 4 enthält Zellen in 0,1 mM MnCl 2 mit 250 uM der Ca 2 +-Kanal-Antagonisten, Verapamil inkubiert. </li></ul></li><li> Wie vorhergesagt, sind die Unterschiede in Signalintensitäten aus Mangan markierten Zellen sichtbar. Im Vergleich zu den Zellen rein mit Mangan gekennzeichnet, die Signalintensität deutlich erhöht in Anwesenheit des Calcium-Kanal-Agonist und nimmt in der Anwesenheit von Calcium-Kanal-Antagonisten. Der Bereich, in dem Signalintensität für Mangan markierten Zellen erhöht hat, sind mit Image J (NIH, Bethesda, MD, USA) gemessen. Die gleiche Software ist für die Analyse im Bereich der dunklen off-resonance-Signal aus der Eisen-markierten Zellen verwendet. Die Größe der dunklen Signal aus der Eisen-markierten Zellen hängt von der Anzahl der Zellen oder die Anzahl der Eisenteilchen durch Zellen enthalten. In diesem Fall, Eine Million Zellen zeigt eine kleinere Fläche des dunklen Signal im Vergleich zum Signal von den drei Millionen Zellen. </li></ol>

<ol><li>Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-calcium+interactions+with+contrast+media+for+cardiac+magnetic+resonance+imaging%3A+a+study+of+manganese+chloride+supplemented+with+calcium+gluconate+in+isolated+Guinea+pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Radiol%22%5BJournal%5D)">Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts.</a> Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).</li>
<li>Aoki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+for+magnetic+resonance+imaging+with+the+T1+agent+manganese+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride.</a> NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).</li>
<li>Arbab, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+magnetic+cell+labeling+with+protamine+sulfate+complexed+to+ferumoxides+for+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI.</a> Blood. 104, 1217-1223 (2004).</li>
<li>Arbab, A. S., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+MRI+and+its+role+in+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular MRI and its role in stem cell therapy.</a> Regen Med. 3, 199-215 (2008).</li>
</ol>

Diese Ergebnisse zeigen, dass Mangan nicht über den spannungsabhängigen Calcium-Kanal-und Mangan können als Kontrastmittel eingesetzt werden, die auch zeigen können, die die Lebensfähigkeit der Zellen geben. Daher empfehlen wir, dass Mangan-geführten MRT kann hilfreich sein, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Transplantation von menschlichen embryonalen Stammzellen in den Herzmuskel zu überwachen.

<table><tbody><tr><td>Mangan(II)-chlorid-Tetrahydrat</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td></td></tr><tr><td>(S)-(–)-Bay K8644</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B133</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Verapamilhydrochlorid, mindestens 99,0 % Titration</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid 0,85–0,90 % Gew./Vol.</td><td>Reagenz</td><td>VWR international</td><td>VW 3257-1</td><td></td></tr><tr><td>Feridex I.V.</td><td>Reagenz</td><td>Berlex Laboratories</td><td>NDC 59338-7035-5</td><td>eisenhaltige injizierbare Lösung, 11,2 mg Eisen/mL</td></tr><tr><td>Protaminsulfat</td><td>Reagenz</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td>NDC 63323-229-05</td><td>50 mg (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>Knockout SR (Serumersatz für ES-Zellen)</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercap&amp;#8211;toethanol 98+ %</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M 3148</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM 100x</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 10.000 Einheiten/ml</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nichtessentielle Aminosäuren 100x-Lösung</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Signa HDx 3T MRT</td><td>Werkzeug</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>klinische Knie-Spule</td><td>Werkzeug</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro-markierung von humanen embryonalen stammzellen für magnetic resonance imaging

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Humane embryonale Stammzellen (hES) haben die Möglichkeit, den verletzten Herzmuskel wieder unter Beweis gestellt. Magnetic Resonance Imaging (MRI) hat als eines der vorherrschenden bildgebenden Verfahren entstanden, um die Wiederherstellung der verletzten Herzmuskel zu beurteilen. Darüber hinaus haben ex-vivo-Markierung Mittel, wie Eisenoxid-Nanopartikel, eingesetzt worden, um zu verfolgen und lokalisieren die transplantierten Stammzellen. Allerdings funktioniert diese Methode nicht überwachen eine grundlegende zellbiologische Eigentums in Bezug auf die Lebensfähigkeit der transplantierten Zellen. Es ist bekannt, dass Manganchlorid (MnCl 2) die Zellen über spannungsgesteuerte Calcium (Ca 2 +)-Kanäle, wenn die Zellen biologisch aktiv sind betritt, und reichert sich intrazellulär zu T 1 Verkürzung Effekt zu erzeugen. Daher empfehlen wir, dass Mangan-geführten MRT kann hilfreich sein, um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Transplantation von embryonalen Stammzellen in den Herzmuskel zu überwachen. In diesem Video zeigen wir, wie man hESC mit MnCl 2 und wie diese Zellen deutlich mit MRI in vitro beobachtet werden label. Zur gleichen Zeit, die biologische Aktivität von Ca 2 +-Kanäle moduliert werden unter Verwendung von sowohl Ca 2 +-Kanal-Agonist und Antagonist zur gleichzeitigen Signalwechsel zu bewerten.

In diesem Video zeigen wir, wie man menschliche embryonale Stammzellen (hES) mit Manganchlorid (MnCl Label<sub&gt; 2</sub&gt;), Die Zellen über spannungsabhängige Kalziumkanäle geben, wenn die Zellen biologisch aktiv sind. Darüber hinaus zeigen wir die Verwendung von MnCl<sub&gt; 2</sub&gt; Als zelluläre MRT-Kontrastmittel zur Bestimmung der in vitro Lebensfähigkeit von humanen embryonalen Stammzellen.

In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

Humane embryonale Stammzellen (hESC) haben die Fähigkeit gezeigt, das geschädigte Myokard zu regenerieren. Die Magnetresonanztomographie (MRT) hat sich als eine der ...

Die Magnetresonanztomographie oder MRT hat sich als vorherrschende Bildgebungsmodalität zur Lokalisierung transplantierten Stammzellen und zur besseren Aufklärung der Regenerationsmechanismen etabliert. Diese MRT-Studien verwenden typischerweise Eisenoxid-Nanopartikel als Kontrastmittel für die Bildgebung. Eisenpartikel können jedoch im Gewebe verbleiben, nachdem die Stammzellen abgestorben sind, und von Makrophagen aufgenommen werden, was suboptimale Bedingungen für die Verfolgung lebensfähiger transplantierten Zellen bewirkt.Dieses Video zeigt, dass Manganchlorid eine wirksame Alternative darstellt. Die Markierung mit Manganchlorid als Kontrastmittel bietet mehrere Vorteile gegenüber der Markierung mit Eisenoxid. Zum Beispiel erzeugt Mangan ein positives Signal, während Eisenpartikel ein negatives Signal erzeugen.Außerdem ist bekannt, dass Manganionen über spannungsabhängige Kalziumkanäle in Zellen eindringen. Daher weist ihr Auftreten in der MRT auf lebensfähige, biologisch aktive Zellen hin. Hallo, ich bin Uni Mother aus dem Labor von Philip Yang in der Abteilung für Kardiologische Medizin an der Stanford University.Heute zeige ich Ihnen, wie man humane embryonale Stammzellen m

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Forschung

JoVE Journal

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Biologie

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Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

Dieses Video zeigt Techniken für die Kennzeichnung von menschlichen embryonalen Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Technik kann für eine in vivo Verfolgung der transplantierten Stammzellen mit optischen Bildgebung und zur histopathologischen Korrelation mit Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Mit dem wachsenden Interesse an Stammzelltherapien, sind molekulare Bildgebungsverfahren ideal für die Überwachung Stammzellen Verhalten nach der Transplantation. Luciferase Reporter Gene nicht-invasive, repetitive Beurteilung der das Überleben der Zelle, den Standort und Verbreitung in vivo ermöglicht. Dieses Video wird gezeigt, wie man hESC Proliferation in einer lebenden Maus zu verfolgen.

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

Ziel der Präsentation ist es, eine hohe Reproduzierbarkeit der Methode zur Matrix verbunden Stammzellen Implantate in Knorpeldefekte, die visualisiert werden MR-Bildgebung erzeugen kann demonstrieren. Stammzellen sind mit von der FDA zugelassene Ferumoxides mit Agarose, implantiert in Knorpeldefekte und abgebildet mit einem 7T MR-Scanner bezeichnet.

Die Implantation von Ferumoxides Labeled humanen mesenchymalen Stammzellen in Knorpeldefekte

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Labeling Stammzellen mit Ferumoxytol, eine FDA-Zulassung Eisenoxid-Nanopartikel

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Verfolgung von Zellen mittels MRT hat bemerkenswerte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen. Dieses Protokoll beschreibt die Kennzeichnung von dendritischen Zellen mit Fluor...

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In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

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