Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Sea Elegance ist ein unglaublich nützlicher Modellorganismus, sowohl aufgrund unseres Wissens über seine Zelllinien als auch aufgrund der Fülle an Informationen, die durch die Sequenzierung und Analyse seines gesamten Genoms gewonnen werden. In diesem Video demonstrieren wir den Prozess der Mikroinjektion von Plasmiden in Sea Elegance und die Selektion transgener Nachkommen mittels Fluoreszenzmikroskopie Als transparentes und mehrzelliges Tier ist Sea Elegance ideal für die Visualisierung von Transgenen, die fluoreszenzmarkierte Proteine in vivo exprimieren. Hallo, mein Name ist Laura Berkowitz und ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin im Caldwell Lab im Department of Biological Sciences hier an der University of Alabama.

Und ich bin Adam Knight, ebenfalls vom Calwell Lab an der University of Alabama. Heute zeige ich Ihnen, wie Sie sich auf die Plasmin-Mikroinjektion vorbereiten und diese durchführen, um transgene Meereseleganz zu erzeugen, und ich zeige Ihnen, wie Sie transgene Dichtungs-Eleganzlinien auswählen und pflegen. Also lasst uns loslegen.

Bevor wir mit der Mikroinjektion beginnen, haben wir noch ein paar Vorbereitungsschritte, die ich dir jetzt zeige. Zuerst bereiten Sie die Plasmid-DNA für die Injektion vor, es werden zwei Plasmide benötigt, eines, das die gewebespezifische Expression unseres interessierenden Gens kodiert, und das zweite, das einen selektierbaren Transformationsmarker liefert. Mischen Sie die Plasmide in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis von 50 Nanogramm pro Mikroliter zusammen.

Bereiten Sie jeweils Schneckenpads vor, die verwendet werden, um die Würmer für die Injektion zu immobilisieren. Um die Schneckenteller herzustellen, legen Sie zunächst mehrere 22 mal 50 Millimeter große Deckgläser auf die Arbeitsplatte. Geben Sie mit einer Weidepipette einen Tropfen geschmolzenes 2%iges Agros auf ein Deckglas und legen Sie sofort ein zweites Deckglas in einem 90-Grad-Winkel zum ersten Tropfen über den Tropfen.

Lassen Sie die Aero einige Sekunden lang erstarren und entfernen Sie dann das obere Abdeckglas. Der Durchmesser der abgeflachten Scheibe von aero sollte zwischen 15 und 20 Millimetern liegen. Lassen Sie die Binde wie ein Haustier mehrere Stunden oder über Nacht vollständig an der Luft trocknen.

Sobald sie trocken sind, lagern Sie die Pads in einem abgedeckten Glaskasten bei Raumtemperatur. Bereiten Sie als Nächstes die Nadellader für die DNA-Lösung vor. Nehmen Sie dazu ein hundert Mikroliter großes Kapillarrohr und erhitzen Sie es in der Mitte einer offenen Flamme und ziehen Sie es schnell auf etwa die doppelte Länge.

Sobald das Kapillarrohr abgekühlt ist, schnappen Sie die beiden Hälften auseinander. Bevorratung von 10 bis 20 Nadelladern für die Injektion. Sie können sie aufrecht in einem Mikrozentrifugenröhrchen aufbewahren.

Brack, sei vorsichtig. Die Spitzen der Nadellader sind sehr scharf. Stellen Sie nun die Mikroinjektionsnadeln her.

Diese Nadeln bestehen aus einem speziellen Kapillarrohr, das ein internes Glasfilament enthält. Dieses Filament dient als Docht für die DNA-Lösung. Für die Herstellung der Nadeln verwenden wir eine Niki PP eight 30 Polar mit einer Heizstufe von 24,8, wobei mehrere Nadeln gleichzeitig zur Aufbewahrung gezogen werden.

Es können mehrere Nadeln auf einen Streifen Modelliermasse montiert werden. Kleine Scherben Deckglas werden verwendet, um die gezogene Nadelspitze aufzubrechen. Diese Scherben werden vorbereitet, indem ein 18 mal 18 Millimeter großes Deckglas mit einem Kim-Tuch umwickelt und vorsichtig Druck ausgeübt wird, bis es in mehrere Stücke zerbricht.

Verwenden Sie Splitter, die etwa drei mal vier Millimeter groß sind. Bereiten Sie zusätzlich zur Vorbereitung der DNA und der Nadeln etwa 50 bis 100 richtig vorbereitete Nadeln vor. Zwei Wildtyp-Würmer für jedes Ausdrucksvektorkonstrukt, das injiziert werden soll.

Jetzt sind wir bereit, das Mikroinjektionsmikroskop einzurichten. Um mit der Einrichtung des Mikroskops zu beginnen, öffnen Sie das Hauptventil am Heliumtank, der mit dem Mikroinjektionsnadelarm und dem Halter verbunden ist. Schließen Sie den Regler, damit das Gas in die Leitung gelangen kann.

Wenn der Druck auf 35 PSI gebracht wird, kann das Gas mit einem Fußpedal abgelassen werden. Führen Sie als Nächstes einen Nadellader in einen Standard-Mundpipettenschlauch ein und lassen Sie eine kleine Menge der Plasmidmischung etwa einen Mikroliter fallen. Führen Sie nun den Lader vorsichtig ganz durch die Mikroinjektionsnadel ein, bis ein Widerstand zu spüren ist.

Stoßen Sie die DNA-Lösung durch leichtes Blasen aus und entfernen Sie dann den Lader. Sobald die DNA geladen ist, führen Sie die Nadel in den Mikroinjektionsarm ein, achten Sie darauf, sie in der kleinen internen Gummidichtung zu platzieren, und klemmen Sie sie dann an den Arm des Manipulators. Legen Sie als Nächstes eine nadelbrechende Scherbe des Deckglases auf eine Kante eines Schneckenpolsters.

Bedecken Sie die Scherbe sowie die gesamte Oberfläche des Schneckentellers mit heiligem Kohlenöl. Legen Sie dann das Schneckenpad auf den Tisch eines inversen Mikroskops. Positionieren Sie die Nadel nach dem Einsetzen des Schneckentellers mit dem Forex-Objektiv und der Hellfeldbeleuchtung in der Mitte des Sichtfelds, aber senken Sie sie noch nicht in das Öl.

Positionieren Sie als Nächstes die innere Kante der Scherbe des Deckglases in der Mitte, und fokussieren Sie sich dann darauf. Senken Sie die Nadel in das Öl und bringen Sie sie in die gleiche Brennebene wie die Scherbe des Deckglases. Erhöhen Sie die Vergrößerung, indem Sie auf das 40-fache Objektiv umschalten, fokussieren Sie dann erneut auf den Rand der Scherbe und positionieren Sie die Nadelspitze bei Bedarf neu.

Brechen Sie nun die Spitze der Injektionsnadel auf. Schieben Sie die Nadel vorsichtig gegen den Rand der Deckglasscherbe und üben Sie gleichzeitig einen kurzen Gasimpuls über das Fußpedal aus. Die Nadel wird ausreichend aufgebrochen.

Wenn kleine Flüssigkeitströpfchen aus dem Ende der Nadel austreten, weil sie zu groß sind, ist eine Öffnung nicht wünschenswert, da sie die Tiere tötet. Sobald die Nadel fertig ist, beginnen wir mit der Mikroinjektion. Entfernen Sie anschließend den Schneckenteller vom Tisch, indem Sie die Nadel nach oben heben.

Ändern Sie jedoch nicht die Position der X- oder Y-Achse. Schieben Sie den Tisch unter der Nadel hervor. Entfernen Sie das Schlangenpad und setzen Sie es auf ein Präpariermikroskop.

Übertragen Sie ein Wort auf das Pad unter der Oberfläche des Öls. Wenn sich die Schnecke windet, streicheln Sie sie sanft, bis sie den Schneckenteller berührt, sollte die feuchte Schnecke an der trockenen Agro haften. Platzieren Sie das Schneckenpad schnell wieder auf der Bühne und zentrieren Sie die Schnecke im Sichtfeld.

Senken Sie dann die Nadel in die gleiche Fokusebene wie der Wurm. Schalten Sie die Filter am invertierten Zielfernrohr auf Hoffman-Beleuchtung um. Dieser Kontrastfilter ermöglicht es, morphologische Details des Wurms sichtbar zu machen.

Fokussieren Sie sich mit dem 40-fach-Objektiv auf das körnige sensorische Zentrum der Wurmgonade unterhalb des Wabenmusters der Keimkeime. Wählen Sie, welche Keimdrüse auf der Seite des Wurms positioniert ist, die der Nadel zugewandt ist. Fein. Passen Sie die Position der Nadel an, bis die Spitze ebenfalls scharf ist.

Führen Sie die Nadel vorsichtig in die Mitte der Gonade ein und üben Sie einen kurzen Gasdruckimpuls aus, um ein oder zwei Tröpfchen DNA in den Gonadenarm auszustoßen. Sie sollten eine Welle von Flüssigkeit beobachten, die sich mit viel Übung und Geschick über den distalen Stachel verteilt. Du kannst jedes Mal die Mitte treffen.

Denken Sie daran, dass es wichtig ist, schnell zu arbeiten, wenn Sie einen Wurm injizieren. Da es leicht austrocknen kann. Der gesamte Vorgang sollte idealerweise weniger als ein bis zwei Minuten dauern.

Sobald die Injektion abgeschlossen ist, nehmen Sie das Schneckenpad vom Tisch und legen Sie es auf ein Präparierfernrohr. Tragen Sie einen Mikroliter M neun Puffer direkt auf den injizierten Wurm auf. Dies kann bedeuten, dass die Pipettenspitze unter die Oberfläche des Halo-Kohlenhydratöls getaucht wird.

Der Puffer sollte den Wurm rehydrieren und er schwebt dann von der Oberfläche des Aeros-Pads, übertragen Sie den Wurm mit einem Wurmpickel auf eine normale Platte. Jetzt werde ich die injizierten Würmer an Adam übergeben und er wird uns die Auswahl und Pflege von transgenen Linien zeigen. Die injizierten Würmer werden auf einzelne, frisch gesäte 60-Millimeter-Platten überführt und dürfen sich vermehren.

Diese Würmer repräsentieren die P-Null-Generation. In der Regel werden injizierte Tiere zwei bis drei Tage lang bei 20 Grad Celsius inkubiert, bis der Nachwuchs erscheint. Sobald die Nachkommen erscheinen, sind wir bereit, mit dem Screening auf transgene Würmer zu beginnen.

Die F1-Nachkommen werden als Nachweis des transgenen Markers beobachtet. In diesem Fall ist der wählbare Marker fluoreszierend, so dass wir mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop screenen können. Jedes fluoreszierende F1-Trägertier wird separat auf eine neue Platte kloniert.

Das injizierte P Null kann nur ein bis fünf fluoreszierende Nachkommen unter all seinen F1-Nachkommen hervorbringen. Lassen Sie die F1-Hermaphroditen sich zwei bis drei Tage lang bei 20 Grad fortpflanzen, bis der Nachwuchs erscheint. Sobald die F-2-Generation bereit ist, werden sie auch für transgene Tiere beobachtet. F zwei Tiere, die einen transgenen Marker geerbt und exprimiert haben, gelten als stabile Linie.

Jede unabhängige Stalllinie sollte als separate Linie von Würmern gehalten werden. Jede Linie vermehrt sich, indem bei jeder Generation mehrere transgene Tiere auf eine neue Platte übertragen werden. Dies muss mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop erfolgen. Wenn der selektierbare Marker fluoreszierend ist, um die Variabilität der Genkopienzahl zu kontrollieren, erzeugen Sie mindestens drei unabhängige stabile Linien pro injiziertem Konstrukt.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Ausdrücke und Vektorkonstrukte mikroinjizieren und Elgan sehen und für stabile Linien auswählen. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.