Name: Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-15T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Mikroinjektionstechnik zur Erzeugung stabiler transgener C. elegans. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Genexpression mittels Fluoreszenzmikroskopie in vivo.

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Wir wollen den Geist der Zusammenarbeit aller Caldwell Lab Mitglieder anzuerkennen. Bewegungsstörungen Forschung im Labor wurde von der Bachmann-Strauss Dystonie &amp; Parkinson Foundation, Vereinigte Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, Parkinson Disease Association of Alabama, die Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research, und ein Undergraduate Research unterstützt.

Expressionsplasmid Construction Zwei Plasmide sind erforderlich: eine für Gewebe-spezifische Expression des Gens von Interesse und eine zweite als wählbare Transformation Marker. Experimentelle Plasmid <ol><li> Wählen Sie einen Promotor, der in dem Gewebe / Zelltyp von Interesse, zum Beispiel, einen Nerv oder Muskel-spezifischen Promotors exprimiert wird. Wenn man mehrere Gene im gleichen Gewebe auszudrücken ist, kann ein Promotorkassette Plasmid in das Gateway-System (Invitrogen) verwendet werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Einfügung von jedem Gen von Interesse stromabwärts des Promotors durch recombinational Klonen 4. Generell ist 2-5 kb Upstream-Sequenzen aus, um korrekte und genaue Ausdruck haben. </li><li> Die cDNA des Gens von Interesse kann auf zwei Arten geklont werden: <ol><li> Konventionelle Klonen mit Hilfe von Restriktionsenzymen. </li><li> Für Gateway-Klonen ist es PCR mit den Primern, dass das Gateway att B recombinational Sequenz enthalten. Die amplifizierte cDNA wird zunächst in der Donor-Vektor pDONR201 um den Eintrag zu erstellen Vektor rekombiniert und dann in E. coli-Stamm DH5a. Nach der Auswahl von erfolgreichen Rekombinanten und mini-prep Isolierung von DNA, wird der Eintrag Vektor in die Promotor-Destination-Vektor zu erstellen Expressionsplasmid rekombiniert. Details zu recombinational Klonen sind entweder von der Invitrogen Gateway-Handbuch oder in Caldwell et al Verfügung. 5. </li></ol></li></ol> Selektionsmarker Plasmid Als Beispiele transgener Marker Plasmide umfassen rol-6 oder Gebrauch des Körpers Wand Muskel Promoter unc-54 um fluoreszierende Protein-Expression zu fahren. Diese Marker Plasmide sind in der Regel innerhalb der Forschergemeinde auf Anfrage zur Verfügung. Mikroinjektion von C. elegans Vorbereitung <ol><li> Führen DNA-Isolierung der beiden Plasmide, die injiziert werden sollen. Quantifizieren sie und mischen im Verhältnis 1:1 von 50 ng / ul jeder. </li><li> Bereiten Sie Agar-Pads: <ol><li> Machen Sie einen 2% igen Lösung in Wasser, Wärme oder in der Mikrowelle bis zur Lösung. </li><li> Set aus mehreren 22 x 50 mm Deckgläser auf einem Labortisch. </li><li> Mit einer Pasteurpipette einen Tropfen des geschmolzenen Agarose auf einem Deckglas und sofort Platz ein zweites Deckglas über die Tropfen in einem 90-Winkel zur ersten. Wiederholen Sie dies für einige andere Deckgläser. Der Durchmesser des abgeflachten Scheibe aus Agarose sollte zwischen 15-20 mm sein. </li><li> Nach Erstarren der Agarose (dies dauert nur Momente), entfernen Sie die Abdeckung aus Glas und lassen Sie das Pad an der Luft trocknen komplett (mehrere Stunden bis über Nacht). </li><li> Bewahren Sie die Pads in einem Deckglas Feld bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Machen Nadel Lader für DNA-Lösung: Needle Lader sind aus 100 ul Kapillaren, die in der Mitte über einer offenen Flamme erhitzt und schnell auf etwa das Doppelte ihrer Länge gezogen geschaffen. Die beiden Hälften sind getrennt, sobald die Kapillare kühlt aufgeschnappt. Stockpile 10-20 Nadel Lader zur Injektion. Aufrecht lagern in einem Mikrozentrifugenröhrchen Rack. Seien Sie vorsichtig, um nicht aufspießen sich auf die Punkte. </li><li> Machen Mikroinjektion Nadeln: Die Nadel ist aus einem speziellen Kapillarröhrchen, dass eine interne Glasfilament enthält gemacht, das Filament dient als Docht für die DNA-Lösung. Diese basieren auf einer Nadel-Abzieher Maschine gezogen. Wir verwenden eine Narishige PP-830 Abzieher mit einer Heizstufe von 24,8. Mehrere Nadeln sind in einer Zeit gezogen und in einem kleinen Plastik-Box gespeichert. Mehrere Nadeln können leicht &quot;gemountet&quot; werden auf einem Streifen Knetmasse für eine langfristige Lagerung. </li><li> Nadelspitze &quot;Brandung&quot;: Die Spitze des Mikroinjektionsnadel gezogen wird so fein, dass es tatsächlich daran geschlossenen Ende und sollte aufgebrochen werden mit kleinen Scherben Deckglas. Diese werden durch das Einwickeln eines 18 x 18 mm Deckglas in ein Papiertuch und sanft Druck, bis es in mehrere Teile zerbricht vorbereitet. Scherben eines nützliche Größe ca. 3 x 4 mm. </li><li> Wachsen Wildtyp (N2) Würmer bis in die frühen Erwachsenen-Stadium für die Injektion mit Standard-Verfahren 6. Bereiten Sie etwa 100 richtig inszeniert Würmer / Konstrukt injiziert. </li></ol> Verfahren <ol><li> Öffnen Sie das Ventil auf ein Helium-Tank, die zu einem Mikroinjektionsnadel Arm und Halter verbunden ist. Schließen Sie das Regelventil, damit das Gas in die Zeile eingeben, wodurch der Druck auf 35 psi. Beachten Sie, dass das freigesetzte Gas kann mit einem Fußpedal werden. </li><li> Legen Sie eine Nadel-Loader in einen Standard-Mund Pipette Schlauch (gefunden in Behältnissen aus Glas Kapillaren) und stellt eine kleine Menge der Plasmid-Mischung (~ 1 ul). </li><li> Die Nadel-Loader wird vorsichtig in das hintere Ende einer Injektionsnadel gesetzt und sanft eingesetzt ganzen Weg durch die Länge derdie Nadel bis Widerstand zu spüren. Vertreibt die DNA-Lösung durch leichtes Blasen, entfernen Sie dann mit dem Kran. </li><li> Legen Sie die Nadel in den Arm Mikroinjektion, wobei darauf geachtet, um es im kleinen internen Gummidichtung Platz. </li><li> Legen Sie eine Nadel-breaking Splitter Deckglas an einer Kante einer Agar-Pad. Bedecken Sie den Splitter, sowie die gesamte Oberfläche des Agar-Pad, mit Halocarbonöl. Legen Sie die Agar-Pad auf der Stufe eines inversen Mikroskops. </li><li> Position der Nadel in der Mitte des Gesichtsfeldes mit dem 4X objektive und Hellfeldbeleuchtung, aber noch nicht unten in das Öl. Auch, stellen Sie den inneren Rand der Scherbe Deckglas in der Mitte, dann auf ihn zu konzentrieren (immer noch mit 4X Ziel). Senken Sie die Nadel in das Öl, womit sie in der gleichen Bildebene als Splitter Deckglas. Erhöhen Sie die Vergrößerung durch die Umstellung auf den 40X-Objektiv. Neuausrichtung auf den Rand der Scherbe und Neupositionierung der Spitze der Nadel, wenn nötig. </li><li> Zum Öffnen der Spitze der Injektionsnadel, sanft anstoßen die Nadel gegen die Kante der Abdeckung Glasscherbe, während zur gleichen Zeit die Anwendung einen kurzen Impuls von Gas über das Fußpedal. Die Nadel wird ausreichend gebrochen werden geöffnet, wenn kleine Tröpfchen von Flüssigkeit austreten Ende der Nadel. Überschüssige Flüssigkeit fließen durch eine zu große Öffnung ist nicht wünschenswert, da es die Tiere zu töten. </li><li> Entfernen Sie die Agar-Pad von der Bühne durch eine Erhöhung der Nadel nach oben, aber keine Änderung der X-oder Y-Achsen-Position. Schieben Sie die Bühne nicht unterhalb der Nadel, entfernen Sie die Agar-Pad und platzieren es auf einem Binokular. Transfer ein Wurm auf dem Pad, unter der Oberfläche des Öls. Wenn der Wurm schlängelt sich sanft streicheln, bis sie die Agar-Pad. Die feuchte Wurm sollte auf die trockene Agarose halten. </li><li> Injektion <ol><li> Raschen Platzierung der Agar-Pad zurück auf die Bühne, Zentrierung der Wurm in das Blickfeld. </li><li> Senken Sie die Nadel in der gleichen Ebene des Fokus wie der Wurm. </li><li> Schalten Sie den Filter auf Hoffman Illumination (eine Art von Gegensatz Filter). Dies ermöglicht morphologische Details des Wurms sichtbar werden. Wenn Nomarski / DIC-Optik sind auf den invertierten Bereich, der so gut funktionieren wird. Mit dem 40X-Objektiv, über die &quot;körnige&quot; Syncytial Zentrum der Wurm Gonade, unterhalb der &quot;Wabe&quot;-Muster des Keims Kerne (wählen Sie je nachdem, was Gonade befindet sich auf der Seite der Wurm vor der Nadel positioniert) zu konzentrieren. </li><li> Feinabstimmung der Position der Nadel, bis die Spitze auch im Fokus (der gleichen Ebene wie die Gonade &quot;Körnigkeit&quot;). </li><li> Schieben Sie die Nadel in der Mitte der Gonade und wenden Sie einen kurzen Puls der Gasdruck auf einen Tropfen oder zwei von DNA in die Gonaden Arm zu vertreiben. Sie sollten eine Welle der Flüssigkeit verteilt über den distalen Gonaden zu beobachten. Gehen Sie nicht davon mehr flüssig ist besser, da zu viel Flüssigkeit in den proximalen Kurve der Gonade Arm, der heruntergefahren werden Eizelle Produktion fließen kann. Wenn möglich, abhängig von der Position des Wurms, spritzen sie den anderen Gonade Arm in der gleichen Weise. </li><li> Es ist wichtig, schnell zu arbeiten während der Injektion ein Wurm, da sie leicht austrocknen. Die Entscheidung für die zweite Gonade Arm spritzen ist abhängig, wie schnell man wieder Position der Nadel und Wurm. Der gesamte Prozess sollte idealerweise weniger als 1-2 Minuten. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Abdeckung aus Glas von der Bühne und legen Sie es auf einem Binokular. Bewerben 1μl der M9-Puffer (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 85mm NaCl, 1 mM MgSO 4) direkt auf das injizierte Wurm (dies könnte zur Folge Eintauchen der Pipettenspitze unter der Oberfläche des Halocarbonöl). Der Puffer sollte rehydrieren der Wurm, es wird dann float aus dem Agarose-Pad-Oberfläche. Übertragung der Wurm zu einer regelmäßigen Platte mit einem Wurm zu pflücken. Die Agarose-Pad kann mehrere Male wiederverwendet werden, bis es geworden ist, zu gesättigt mit Puffer und die Würmer nicht mehr zu halten. </li></ol> Transgene Auswahl <ol><li> Injected Würmer, die P 0 Generation, sind auf die individuellen frisch, bakteriell ausgesät Platten (60 mm) überführt und zu reproduzieren. Typischerweise sind injizierten Tieren bei 20 ° C für 2-3 Tage inkubiert, bis die Nachkommen erscheinen. </li><li> Die F 1 Nachkommen sind zum Nachweis der transgenen Marker (z. B. Fluoreszenz) mit Hilfe eines Fluoreszenz-Stereomikroskop beobachtet. Jeder fluoreszierend, Träger F 1, ist Tier einzeln auf eine neue Platte geklont (seit Nachkommen von jedem F 1 eine klare Linie berücksichtigt werden). Die F 1 Hermaphroditen sind erlaubt sich zu vermehren. Auch dies ist in der Regel bei 20 ° C für 2-3 Tage durchgeführt, bis die Nachkommen erscheinen. </li><li> Die F 2-Generation ist für transgene Tiere sowie beobachtet. F 2 Tiere, die geerbt haben und drücken die transgenen Array werden als &quot;stable&quot;-Zeile. HINWEIS: Bei der F 1 stAlter kann es viele transgene Tiere, aber sie sind nicht stabil. Die Mehrzahl der F 1 transgenen Tieren nicht in F 2 stabile Linien vermehrt werden. HINWEIS: Für die Steuerung für die Variabilität in der Genkopienzahl, erzeugen ein Minimum von drei unabhängigen stabilen Linien pro Konstrukt injiziert. </li><li> Jeder unabhängige stabile Linie sollte in einer separaten Zeile der Würmer gehalten werden. Jede Zeile kann durch die Übertragung von mehreren transgenen Tieren, um eine neue Platte bei jeder Generation weitergegeben werden, dies muss mit Hilfe eines fluoreszierenden Stereomikroskop werden, wenn der Selektionsmarker ist fluoreszierend. </li></ol>

<ol><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li>
<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, um: - Einfügen direkt in das Zentrum der Gonade - Nicht spritzen zu viel Flüssigkeit - Schnell zu arbeiten, um Austrocknung zu verhindern. Wenn Sie Probleme mit der Nadel, wie es gebrochen ist zu groß ausgeführt wird, ist es am besten Remake eine frische Nadel, anstatt zu versuchen, mit einem weniger als ideal Nadel injiziert. Die Erzeugung von transgenen Würmer hat viele Anwendungen wie zum Beispiel: - Identifizierung von mutierten...

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Halogenkohlenwasserstoff-Öl, Voltalef</td><td>Hulle 10S</td><td>elfatochem, Frankreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 18x18 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 22x50 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Kapillare, 100 µl</td><td></td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Kapillare für Nadeln</td><td>&quot;Kwik-Fil&quot;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Nadelzieher</td><td>Werkzeug</td><td>Narishige International</td><td>Modell PP-830</td><td></td></tr><tr><td>microINJECTOR-System</td><td></td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1000</td><td>Mikroskop, Objekttisch, Manipulator</td></tr><tr><td>Zerlegungsmikroskop mit Fluoreszenz</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Zerlegungsmikroskop</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung von stabilen transgenen c. elegans mit mikroinjektion

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgene Caenorhabditis elegans leicht über Mikroinjektion eines DNA-Plasmid-Lösung in die Gonade 1 erstellt werden. Die Plasmid-DNA lagert sich extrachromosomale Konkatamere, die stabil vererbt werden, wenn auch nicht mit der gleichen Effizienz wie tatsächliche Chromosomen 2 zu bilden. Ein Gen von Interesse ist mit einer offensichtlichen phänotypischen Marker, wie rol-6 oder GFP co-injiziert, um die Auswahl von transgenen Tieren unter einem Binokular erlauben. Das exogene Gen kann aus seiner nativen Promotor für zelluläre Lokalisation Studien ausgedrückt werden. Alternativ kann das Transgen von einem anderen Gewebe-spezifischen Promotor, um die Rolle des Genprodukts in der jeweiligen Zelle oder eines Gewebes zu beurteilen gefahren werden. Diese Technik effizient Laufwerke Genexpression in allen Geweben von C. elegans mit Ausnahme der Keimbahn oder frühen Embryo 3. Erstellung von transgenen Tieren ist bekannt für eine Reihe von experimentellen Paradigmen genutzt. Dieses Video zeigt die Mikroinjektion Verfahren zur transgenen Würmern zu generieren. Darüber hinaus ist die Auswahl und Pflege von stabilen transgenen C. elegans Zeilen beschrieben.

Dieses Video zeigt die Technik der Mikroinjektion in die Gonade von C. elegans, um transgene Tiere zu schaffen.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgene Caenorhabditis elegans können problemlos durch Mikroinjektion einer DNA-Plasmidlösung in die Gonaden erzeugt werden. Die Plasmid-DNA ordnet sich zu ...

Sea elegance ist aufgrund des umfangreichen Wissens über seine Zelllinien sowie der Fülle an Informationen, die aus der Sequenzierung und Analyse seines gesamten Genoms gewonnen wurden, ein äußerst nützlicher Modellorganismus. In diesem Video demonstrieren wir das Verfahren zum Mikroinjizieren von Plasmiden in Sea elegance und die Selektion transgener Nachkommen mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie. Als durchsichtiges, vielzelliges Tier eignet sich Sea elegance ideal dafür, Transgene, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren, in vivo sichtbar zu machen. Hallo, mein Name ist Laura Berkowitz und ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin im Caldwell-Labor der Abteilung für Biowissenschaften hier an der University of Alabama.Und ich bin Adam Knight, ebenfalls aus dem Calwell-Labor an der University of Alabama. Heute zeige ich Ihnen, wie man die Plasmin-Mikroinjektion vorbereitet und durchführt, um transgene Sea Elegance zu erzeugen, und ich zeige Ihnen, wie man transgene Seal Elegance-Linien auswählt und pflegt. Beginnen wir also.Bevor wir mit der Mikroinjektion beginnen, gibt es einige Vorbereitungsschritte, die ich Ihnen nun zeigen werde. Bereiten Sie zunächst die zu injizierende Plasmid-DNA vor; zwei Plasmide werden benötigt: eines, das die gewebespezifische Expression unseres Gens der Interesse kodiert, und ein zweites, das einen selektierbaren Transformationsmarker bereitstellt. Mischen Sie die Plasmide im Verhältnis eins zu eins, jeweils mit einer Konzentration von 50 Nanogramm pro Mikroliter.Bereiten Sie als Nächstes Bohrerpads vor, die zum Immobilisieren der Würmer für die Injektion verwendet werden. Legen Sie dazu mehrere 22 mal 50 Millimeter große Deckgläser auf die Laborbank. Geben Sie mit einer Pasteurpipette einen Tropfen geschmolzenes 2 % Agarose auf ein Deckglas und setzen Sie sofort ein zweites Deckglas im 90-Grad-Winkel zum ersten darauf.Lassen Sie das Aero einige Sekunden lang erstarren und entfernen Sie dann die obere Abdeckungsscheibe. Der Durchmesser der abgeflachten Aero-Scheibe sollte zwischen 15 und 20 Millimetern liegen. Lassen Sie das Pad wie bei einem Haustier mehrere Stunden oder über Nacht vollständig an der Luft trocknen.Nachdem sie trocken sind, bewahren Sie die Pads in einer Deckglasbox bei Raumtemperatur auf. Bereiten Sie anschließend die Nadel-Lader für die DNA-Lösung vor. Nehmen Sie dazu ein hundert Mikroliter fassendes Kapillarrohr, erhitzen es in der Mitte einer offenen Flamme und ziehen es rasch auf etwa die doppelte Länge. Nachdem die Kapillare abgekühlt ist, brechen Sie die beiden Hälften auseinander. Stapeln Sie 10 bis 20 Nadellader für die Injektion. Sie können sie aufrecht in einem Mikrozentrifugenröhrchen aufbewahren.Brack, seien Sie vorsichtig. Die Nadellader-Spitzen sind sehr scharf. Stellen Sie nun die Mikroinjektionsnadeln her.Diese Nadeln bestehen aus einem speziellen Kapillarrohr, das einen inneren Glasfaden enthält. Dieser Faden dient als Docht für die DNA-Lösung. Zum Herstellen der Nadeln verwenden wir einen Niki-PP-Acht-30-Polar mit einer Heizeinstellung von 24,8; dabei werden mehrere Nadeln gleichzeitig zum Lagern gezogen.Mehrere Nadeln können auf einem Streifen Modellierknete befestigt werden. Kleine Splitter von Deckgläsern werden verwendet, um die gezogene Nadelspitze zu öffnen. Diese Splitter werden hergestellt, indem ein 18 mal 18 Millimeter großes Deckglas in ein Kim-Tuch eingewickelt und vorsichtig unter Druck gesetzt wird, bis es in mehrere Stücke zerbricht.Verwenden Sie Splitter, die etwa drei mal vier Millimeter groß sind. Neben der Vorbereitung der DNA und der Nadeln bereiten Sie etwa 50 bis 100 korrekt gestufte Exemplare vor. Jeweils zwei Wildtyp-Würmer für jeden Expressionsvektor-Konstrukt, der injiziert werden soll.Jetzt sind wir bereit, das Mikroinjektionsmikroskop einzurichten. Öffnen Sie zunächst das Hauptventil an dem Heliumtank, der mit dem Mikroinjektionsnadelarm und -halter verbunden ist, um die Einrichtung des Mikroskops zu beginnen. Schließen Sie den Regler, um das Gas in die Leitung eintreten zu lassen.Wenn der Druck auf 35 PSI gebracht wurde, kann das Gas mit einem Fußpedal abgelassen werden. Als Nächstes wird ein Nadelbestücker in eine Standard-Mundpipettenspitze eingeführt und etwa ein Mikroliter der Plasmidmischung eingetropft. Danach wird der Bestücker vorsichtig vollständig durch die Mikroinjektionsnadel geschoben, bis ein Widerstand spürbar ist.Drücken Sie die DNA-Lösung vorsichtig durch Blasen aus und entfernen Sie anschließend den Lader. Sobald die DNA geladen ist, setzen Sie die Nadel in den Mikroinjektionsarm ein, wobei Sie darauf achten müssen, sie innerhalb der kleinen, inneren Gummidichtung zu platzieren, und klemmen sie dann am Arm des Manipulators fest. Legen Sie danach ein Deckglas-Bruchstück zum Nadelzerbrechen an eine Kante des Auger-Pads.Bedecken Sie das Splitterstück sowie die gesamte Oberfläche des Bohrerkissens mit hohlem Kohlenstofföl. Anschließend platzieren Sie das Bohrerkissen auf dem Objekttisch eines invertierten Mikroskops. Sobald das Bohrerkissen positioniert ist, bringen Sie die Nadel mit Hilfe des Forex-Objektivs und der Hellfeldbeleuchtung in die Mitte des Sichtfeldes, senken Sie jedoch noch nicht in das Öl ab.Positionieren Sie als Nächstes den inneren Rand des Deckgläserstücks in der Mitte und fokussieren Sie darauf. Senken Sie die Nadel in das Öl ab, sodass sie sich in derselben Fokusebene wie das Deckgläserstück befindet. Erhöhen Sie die Vergrößerung, indem Sie zum 40×-Objektiv wechseln, fokussieren Sie erneut auf die Kante des Deckgläserstücks und positionieren Sie die Nadelspitze gegebenenfalls neu.Jetzt öffnen Sie die Spitze der Injektionsnadel. Bewegen Sie die Nadel vorsichtig gegen die Kante des Deckgläschens, während Sie gleichzeitig über das Fußpedal einen kurzen Gasimpuls zuführen. Die Nadel wird dadurch ausreichend geöffnet.Wenn kleine Flüssigkeitstropfen am Ende der Nadel entweichen, ist ein zu starker Flüssigkeitsaustritt aufgrund einer zu großen Öffnung unerwünscht, da dies die Tiere töten würde. Sobald die Nadel bereit ist, beginnen wir die Mikroinjektion. Als Nächstes entfernen Sie das Stößelkissen von der Probe, indem Sie die Nadel anheben.Ändern Sie jedoch nicht die Position der X- oder Y-Achse. Ziehen Sie den Präparatteller vorsichtig unter der Nadel hervor. Entfernen Sie die Bohrermatte und platzieren Sie sie unter ein Stereomikroskop.Bringen Sie ein Wort auf das Pad unterhalb der Öloberfläche. Wenn sich der Wurm leicht bewegt, streichen Sie vorsichtig darüber, bis er das Bohrerpads berührt; der feuchte Wurm sollte an dem trockenen Agar haften. Setzen Sie das Bohrerpads anschließend schnell wieder auf den Objekttisch zurück und zentrieren Sie den Wurm im Sichtfeld.Senken Sie die Nadel dann in dieselbe Fokusebene wie den Wurm. Schalten Sie die Filter am invertierten Mikroskop auf Hoffman-Kontrastbeleuchtung um. Dieser Kontrastfilter ermöglicht es, morphologische Details des Wurms sichtbar zu machen.Verwenden Sie das 40x-Objektiv, um den körnigen sensorischen Bereich der Wurmgonade unterhalb des wabenförmigen Musters der Keimkerne zu fokussieren. Wählen Sie die Gonade, die sich auf der Seite des Wurms befindet, die der Nadel zugewandt ist. Feinjustieren Sie die Position der Nadel, bis auch deren Spitze scharf gestellt ist.Führen Sie die Nadel vorsichtig in die Mitte der Gonade ein und geben Sie einen kurzen Druckstoß ab, um einen oder zwei Tropfen DNA in den Gonadenarm abzugeben. Bei ausreichender Übung und Geschicklichkeit sollten Sie eine Flüssigkeitswelle beobachten können, die sich über die distale Gonade ausbreitet. So können Sie jedes Mal die Mitte der Gonade treffen.Beachten Sie, dass es wichtig ist, beim Injizieren eines Wurms schnell zu arbeiten, da er leicht austrocknen kann. Der gesamte Vorgang sollte idealerweise weniger als ein bis zwei Minuten dauern.Nach Abschluss der Injektion das Bohrerpolster vom Objektträger nehmen und unter ein Stereomikroskop stellen. Einen Mikroliter M-neun-Puffer direkt auf den injizierten Wurm auftragen. Dies kann beinhalten, die Pipettenspitze unter die Oberfläche des Halo-Carb-Öls zu tauchen.Das Puffermittel sollte den Wurm rehydrieren, wodurch er von der Oberfläche des Aeros-Pads abhebt. Übertragen Sie den Wurm mithilfe eines Wurmpicks auf eine gewöhnliche Platte. Nun übergebe ich die injizierten Würmer an Adam, und er wird uns die Selektion und Pflege transgener Linien zeigen. Die injizierten Würmer werden auf einzelne frische, beimpfte 60-Millimeter-Platten überführt und zur Fortpflanzung freigegeben.Diese Würmer stellen die P0-Generation dar. Injizierte Tiere werden typischerweise bei 20 Grad Celsius zwei bis drei Tage lang inkubiert, bis die Nachkommen erscheinen. Sobald die Nachkommen auftreten, können wir mit der Selektion transgener Würmer beginnen.Die F1-Nachkommen werden auf Hinweise auf den transgenen Marker untersucht. In diesem Fall ist der selektierbare Marker fluoreszierend, sodass wir mithilfe eines fluoreszierenden Stereomikroskops screenen können. Jedes fluoreszierende F1-Tier wird einzeln auf eine neue Platte geklont.Das injizierte P-null-Tier darf unter all seinen F1-Nachkommen nur ein bis fünf fluoreszierende Nachkommen hervorbringen. Lassen Sie die F1-Hermaphroditen zwei bis drei Tage lang bei 20 Grad Celsius sich fortpflanzen, bis die Nachkommen erscheinen. Sobald die F2-Generation bereit ist, wird ebenfalls auf transgene Tiere geachtet. F2-Tiere, die einen transgenen Marker geerbt und exprimiert haben, gelten als stabile Linie.Jede unabhängige stabile Linie sollte als separate Linie gehalten werden; vermehren Sie jede Linie, indem Sie bei jeder Generation mehrere transgene Tiere auf eine neue Platte übertragen. Dies muss unter Verwendung eines fluoreszierenden Stereomikroskops durchgeführt werden. Falls der selektierbare Marker fluoreszierend ist, um die Variabilität der Genkopienzahl zu kontrollieren, erzeugen Sie pro injiziertem Konstrukt mindestens drei unabhängige stabile Linien.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Expressionsvektor-Konstrukte mikroinjiziert und stabile Linien auswählt. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

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Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

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Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

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Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

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