Der MODS Verfahren zur Diagnose von Tuberkulose und multiresistente Tuberkulose

Auf jeden dritten Menschen auf der Welt kommt eine Tuberkulose. Die Diagnose einer aktiven Tuberkulose verhindert Neuinfektionen, da Patienten mit aktiver Tuberkulose zwischen 10 und 15 andere Menschen pro Jahr infizieren, bis sie entweder behandelt werden oder sterben. Mods ist ein Akronym, das wir verwenden, um zu vermeiden, mikroskopische Beobachtung, Arzneimittelempfindlichkeitstest und den Grund, warum es genannt wird, sagen zu müssen, wird deutlich, wenn die Methodik erklärt wird.

In dem kurzen Video skizzieren wir die Mods-Methodik für die schnelle und kostengünstige Diagnose von Tuberkulose und multiresistenter Tuberkulose. In dem Video wird die Methodik Schritt für Schritt erläutert. Wir werden die Auswirkungen der Arbeit mit Flüssigkulturen auf die biologische Sicherheit erörtern und einige der wichtigen Fragen der Qualitätssicherung erläutern, die für die Anwendung dieser Methode erforderlich sind.

Der Mods-Assay wurde an der Kayana University in Lima, Peru, im Labor von Bob Gilman entwickelt. Nach Beobachtungen, die ursprünglich von losem Kaviatur gemacht wurden. LOOSE versuchte, mithilfe von farbmetrischen Indikatoren schnelle Wege zum Nachweis von Mycobacterium tuberculosis in Kulturen zu finden.

Sie wies jedoch darauf hin, dass die Beobachtung dieser Kulturen unter dem Mikroskop das Vorhandensein von Wachstum von Mikrobakterien mehrere Tage vor der Farbänderung der Colormetric-Indikatoren zeigte, und auf der Grundlage dieser Beobachtung wurde der Assay des Verteidigungsministeriums entwickelt. Der Assay des MOD wurde in einem ressourcenbegrenzten Umfeld entwickelt und zielt auf ressourcenbegrenzte Umgebungen ab, daher knapp 3 pro Test für den flüssigkulturbasierten Nachweis von TB und Multidrug-Resistenznachweis. Es ist äußerst ansprechend und bringt diese Art von Diagnosekapazität zum ersten Mal an Orte, an denen die Ressourcen begrenzt sind.

Der mods Assay basiert also auf drei zentralen Prinzipien. Die erste ist, dass Mycobacterium tuberculosis in flüssigen Medien viel schneller wächst als in festen Medien. Das ist eine Tatsache, die seit vielen Jahren bekannt ist.

Zweitens können wir, wenn wir diese flüssigen Medien unter dem Mikroskop beobachten, das Wachstum von myb tuberculosis viel schneller erkennen, als wenn wir auf das makroskopische Erscheinungsbild von Kolonien auf festen Medien warten. Und in der Tat ist dieses Wachstum völlig charakteristisch, so dass wir M. tuberculosis in flüssigen Medien von Bakterien oder Pilzkontaminationen unterscheiden können, oder auch von dem Wachstum atypischer nichttuberkulöser Mykobakterien, die möglicherweise vorhanden sein könnten. Schließlich, und das ist vielleicht das Aufregendste am Mods-Assay, ist, dass wir die Medikamente Rifampicin und damit Multiresistenz direkt aus dem Sputum einbeziehen können.

Durch die Verwendung dieser Medikamente zu Beginn des Assays können wir sowohl Tuberkulose nachweisen als auch feststellen, ob das Isolat gegen diese beiden Medikamente resistent ist oder nicht. Und das macht eine Subkultur überflüssig und schafft einen indirekten Drogenempfindlichkeitstest. Jetzt werden wir nur die Ausrüstung skizzieren, die für den Mods-Assay erforderlich ist.

Für die Lagerung der vorbereiteten Medien wird ein Kühlschrank benötigt. Für das Wiegen von is und Rifampicin ist eine Waage erforderlich. Zum Mischen des Auswurfs wird ein Wirbel benötigt.

Bei der Dekontaminationslösung ist eine Zentrifuge erforderlich, um die dekontaminierte Sputumprobe zu konzentrieren, und diese sollte in der Lage sein, 3000 G zu erreichen. Die Zentrifuge muss nicht gekühlt werden, aber es ist absolut notwendig, dass sie bios-sicher ist und bios-sicher ist. Für mykobakterielle Arbeiten, die erfordern, dass die Eimer der Zentrifuge mit verschließbaren Deckeln verschlossen werden können. Ein Inkubator, der 37 Grad Celsius erreichen und 37 Grad Celsius halten kann, ist erforderlich.

Diese muss nicht mit CO2 angereichert werden. Ein inverses Mikroskop ist erforderlich, um die Mods-Platten zu lesen, und dies sollte Objektive von vier x und 10 x haben, und der Autoklav wird benötigt, um Medien zu sterilisieren und auch für die Entsorgung von Mikrobakterienkulturen, Abfallmikros sind für das Aliquot in Medien erforderlich, eine biologische Sicherheitswerkbank. Klasse zwei ist für Verfahren erforderlich, bei denen Sputumproben manipuliert und Platten inokuliert werden.

Die Reagenzien, die zur Durchführung der Mods erforderlich sind, sind wie folgt: Middlebrook Seven H Nine Media Cascione und Glycerin Panta, das Antibiotika-Supplement und OADC. Die Nahrungsergänzungsmittel enthalten Antibiotika und Rifampicindimethylsulfoxid, DMSO zur Herstellung von Rifampicin, Natriumhydroxid, Natriumcitrat und Nyl Cystein zur Sputum-Dekontamination DI, Natriumphosphat und Monokaliumphosphat zur Herstellung des Phosphatpuffers, 10%Natriumhypochlorit zur Entsorgung von infizierten Abfällen und Desinfektionsmittel zur Reinigung von Arbeitsflächen. Die folgenden Kunststoffe und Verbrauchsmaterialien werden ebenfalls benötigt: sterile Glasröhrchen, 0,2-Mikrometer-Filter für wässrige Lösungsmittel und 0,2-Mikrometer-Filter für organische Lösungsmittel, Mikrozentrifugenröhrchen, 15-mil-Zentrifugenröhrchen, sterile 50-Milliliter-, 10-Milliliter-Serologie-Peppes Past Peppes, sterile Mikropipettenspitzen, 24-Well-Gewebekulturplatten und verschließbare Ziploc-Beutel, in denen die 24-Well-Platten platziert werden, nachdem die Sputumprobe in das Medium inokuliert wurde.

Es gibt vier Gruppen von Stammlösungen, die im Voraus zubereitet werden können. Die Phosphatpufferlösung besteht aus einer Kombination von Natriumphosphat-, Diba- und Kaliumphosphat-Monobasislösungen, die auf einen pH-Wert von 6,8 plus oder minus 0,2 eingestellt sind. Diese Lösung wird zur Sterilisation 15 Minuten lang bei 121 bis 124 Grad Celsius autoklaviert, und ein Aliquot wird auf Nähragar kultiviert, um die Sterilität zu bestätigen.

Dieser kann bis zu einem Monat bei zwei bis acht Grad Celsius im Kühlschrank gelagert werden. Für jede Sputumprobe werden 10 Milliliter Phosphatpufferlösung benötigt. Die Stammlösung für die Sputumdekontamination ist eine Natriumhydroxid-Natriumcitrat-Kombination.

Diese Lösungen werden in gleichen Volumina kombiniert und 15 Minuten lang bei 121 bis 124 Grad Celsius autoklavieren und können auch bis zu einem Monat lang bei zwei bis acht Grad Celsius im Kühlschrank gelagert werden. Für jede Sputumprobe werden zwei Milliliter dieser Lösung benötigt. Das Basiskulturmedium besteht aus Middlebrook seven H nine mit Cascion und Glycerin.

Das sieben H neun Pulver wird in sterilem destilliertem Wasser, das Glycerin und Cascion enthält, aufgelöst und unter ständigem Rühren gemischt, bis es sich vollständig aufgelöst hat. Dieses Medium wird 15 Minuten lang bei 121 bis 124 Grad Celsius autoklaviert und nach dem Abkühlen in 4,5 Milliliter große Quats in sterilen 16 x 100 Millimeter großen Glasröhrchen aufgeteilt. Das Medium wird 48 Stunden lang bei 37 Grad inkubiert, um die Sterilität zu überprüfen, die sich nach dieser Zeit durch einen Mangel an Trübungen bemerkbar macht, und kann bei zwei bis acht Grad Celsius bei fest verschlossener Kappe bis zu einem Monat gelagert werden.

Für jede Sputumprobe wird ein Röhrchen mit 4,5 Millilitern dieser Kultur benötigt. Mittlere antibiotische Stammlösungen werden wie folgt hergestellt, werden vollständig in sterilem destilliertem Wasser aufgelöst und mit einem 0,2-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter für wässrige Lösungsmittel filtriert. 20 Mikroliter Aliquots können dann in sterilen Mikrozentrifugationsröhrchen bei minus 20 Grad Celsius bis zu sechs Monate gelagert werden; jedes 20 Mikroliter Aliquot reicht für bis zu hundert Proben.

Rifampicin-Stammlösungen von acht Milligramm pro mil werden durch Auflösen von Rifampicin in DMSO und sterilem destilliertem Wasser hergestellt. Dieses Gemisch wird mit einem 0,2-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter für organische Lösungsmittel filtriert und die Lösung kann in 20-Mikroliter-Aliquoten in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen bei minus 20 Grad Celsius für bis zu sechs Monate gelagert werden; jeweils 20 Mikroliter Aliquot sind ausreichend: Für bis zu 100 Proben. Kommen wir nun zum Teil der Methodik selbst und den drei Schritten, die Sie am Tag des Eingriffs ausführen müssen.

Dies ist die Umwandlung der Stammlösungen in die funktionierenden Lösungen. Zuerst haben wir die Dekontaminationslösung, dann haben wir die Medienlösung. Und schließlich die Arbeitslösungen der Medikamente Isen und Rifampicin.

Die Dekontaminationsmethode, die für die Mods-Methodik verwendet wird, ist die standardisierte Natriumhydroxid-NALK-Dekontaminationsmethode. Das Nalk ist ein Mukolytikum, das hilft, den Auswurf zu verdauen und dem Natriumhydroxid die Dekontamination zu ermöglichen. Dazu benötigen wir unsere Natriumhydroxid-Natriumcitrat-Stammlösung und 0,1 Gramm NA werden zu 20 ml dieser Lösung hinzugefügt.

Jede Lösung, die am Tag der Zubereitung nicht verwendet wird, muss verworfen werden. Auch die abschließende Vorbereitung des Nährmediums sollte erst am Tag der Anwendung erfolgen. Gelagert werden sieben H neun Medien mit OADC kombiniert und panta werden 4,5 Milliliter des Mediums mit 0,5 Millilitern OADC und 0,1 Millilitern Panta in jedem Röhrchen kombiniert.

Dies ist für eine Probe ausreichend. Arbeitslösungen jedes Arzneimittels werden am Tag der Anwendung hergestellt, und alle Lösungen, die nicht verwendet werden, sollten verworfen werden, da die Aktivität nicht garantiert werden kann. Gelagerte Aliquote werden in 24 verdünnt. Well-Gewebekulturplatten seriell mit Medien sieben H neun oh A DC so an, dass die endgültige Well-Konzentration, die nach Zugabe der Sputumprobe mit Medium erreicht wird, 0,4 Mikrogramm pro mil forinsäure und ein Mikrogramm pro mil für Rifampicin beträgt.

Nun zum Dekontaminationsverfahren: Zwei mil Sputumprobe werden in ein konisches Falcon-Röhrchen gegeben und dann zwei mil unserer Natriumhydroxid-Milch-Dekontaminationslösung hinzugefügt. Der Deckel wird wieder aufgesetzt und fest verschraubt, wonach die Suspension vortex und 15 Minuten lang stehen gelassen wird, während dieser Zeit findet der Dekontaminationsvorgang statt. Nach dieser Zeit werden 14 Milliliter Phosphatpufferlösung zugegeben.

Der Deckel wird wieder aufgesetzt und festgeschraubt, und das Röhrchen wird nach 50 Minuten bei 3000 G in die Zentrifuge gelegt, der S-Überstand wird dekantiert und das verbleibende Pellet ist die Probe, die wir mit den 5,1-Milliliter-Röhrchen von sieben H neun OEDC-Pantern ausplattieren wollen. Unser Pellet wird auf ein Volumen von etwa zwei Millilitern resuspendiert. Die Hälfte dieser resuspendierten Probe wird als Backup in einem Mikrozentrifugenröhrchen aufbewahrt.

Diese steht dann zur Verfügung, falls unsere Kultur kontaminiert wird und wir die Probe erneut ausstopfen müssen. Der andere Milliliter wird zu den verbleibenden sieben H neun oh einem Gleichstrompanter hinzugefügt, der sich in unserer Glasröhre befindet, und dies ist unsere Probe, die zum Ausplattieren bereit ist. 900 Mikroliter dieser Suspension aus Medium und Probe werden in jede der vier Vertiefungen in einer Säule einer 24-Well-Platte gegeben.

Die verbleibenden Vertiefungen der 24-Well-Platte werden mit nachfolgenden Proben gefüllt, so dass fünf Proben eine 24-Well-Platte füllen, eine für jede der fünf Säulen, und die sechste Säule ohne Probe verbleibt. Die sechste Spalte dient als Negativkontrolle in diese Spalte. Es wurden alle Medienbestandteile ohne Sputumprobe platziert, und jedes Wachstum in dieser Säule deutet eindeutig darauf hin, dass wir ein Problem mit Kreuzkontamination haben und die gesamte Platte entsorgt werden muss.

Jede Platte, die wir betreiben, erfordert eine Spalte mit Negativkontrolle. Jetzt haben wir also unsere Platte mit all unseren Proben und Medien. Wir müssen unsere Antibiotika-Suspensionen in einer separaten Platte hinzufügen.

Wir haben unsere Verdünnungen von Rifampicin und Isid wie zuvor beschrieben vorbereitet, und mit einem Vierkanal-Multi-PET sammeln wir 100 Mikroliter aus jeder dieser Vertiefungen und dosieren 100 Mikroliter von sieben H neun OADC in jede der beiden Kontrollvertiefungen und 100 Mikroliter Rifampicin und 100 Mikroliter Isid in jede der beiden wirkstoffhaltigen Vertiefungen. Sobald die Platte fertig ist, wird der Deckel wieder aufgesetzt und sie wird hineingelegt. Ein Ziploc-Beutel wird ab diesem Zeitpunkt des Beutels nicht mehr geöffnet, und daher haben Kulturen, die in flüssigen Medien wachsen, nie die Möglichkeit, den Beutel zu verlassen.

Alle Messwerte der Platte werden von nun an im Beutel durchgeführt, und der Beutel wird in einen Autoklavenbeutel gelegt und am Ende der Kultur entsorgt. Und auf diese Weise vermeiden wir die Manipulation von hochkonzentrierten Suspensionen von Mykobakterien. Lassen Sie uns jetzt nur ein paar Worte zur Qualitätskontrolle sagen.

In der Mods-Methodik sind Qualitätskontrollen eingebaut, die für die ordnungsgemäße Anwendung des Assays unerlässlich sind. Zunächst einmal gibt es Negativregler und diese werden auf jeder einzelnen Platte ausgeführt. Diese wurden bereits erwähnt, aber zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir eine Säule haben, die alle Medienbestandteile enthält, ohne dass eine Sputumprobe neben fünf anderen Sputumproben auf einer Platte vorhanden ist. Die Vertiefungen in der Säule sollten wie alle anderen Vertiefungen untersucht werden, und das Vorhandensein von Wachstum in diesen Vertiefungen deutet darauf hin, dass die Kreuzkontamination stattgefunden hat und dass keines der Ergebnisse auf der Platte daher vertrauenswürdig ist.

Die Platte muss daher entsorgt und alle Proben neu beschichtet werden. Darüber hinaus gibt es interne Kontrollen, bei denen es sich um Positivkontrollen handelt. Diese werden auf einer separaten Platte geführt, und diese Platte wird vorbereitet, nachdem alle anderen Probenplatten am Ende des Tages vorbereitet wurden, um das Risiko einer Kreuzkontamination innerhalb des Labors zu minimieren.

Auf dieser separaten Platte führen wir einen vollständig anfälligen Stamm von Mycobacterium tuberculosis und einen Stamm durch, der gegen ISID und Rifampicin resistent ist. Wenn Bedenken bestehen, einen multiresistenten Stamm auf einer Platte laufen zu lassen, kann ein monoresistenter Rifampin-Stamm ohne seinen monoresistenten Stamm anstelle dieser beiden anfälligen und MDR-Stämme betrieben werden. Der Zweck dieser Stämme besteht darin, nicht nur zu zeigen, dass die Medien das Wachstum unterstützen, daher sollten alle unsere Positivkontrollen ein Wachstum des drogenfreien Wohlstands aufweisen, sondern auch, dass unsere Arzneimittelkonzentrationen korrekt sind und daher die anfälligen Positivkontrollen in Gegenwart von is und Rifampicin nicht wachsen sollten, und die resistenten Positivkontrollen sollten offensichtlich durch die Konzentrationen von Rifampicin und is wachsen, die in der Platte vorhanden sind.

Okay, jetzt zum Tellerlesen. Wenn wir den Tag der Plattierung aus unseren Probenehmern betrachten, beginnt die Plattenablesung am Tag Null am fünften Tag. Davor ist das Wachstum von Mykobakterien sehr selten zu beobachten.

Die Platten werden unter einem Inverslichtmikroskop untersucht. Das heißt, dass die Platten von unten nach oben untersucht werden, und dies ermöglicht es uns, die Schnüre sehr deutlich zu sehen. Der Versuch, die Kulturen von oben zu visualisieren, wird durch Kondensation auf dem Deckel der Platten behindert, und auch, weil die Brennweite für ein Standardmikroskop nicht ausreichend ist. Die mikroskopische Untersuchung wird im Allgemeinen mit den 10 x objektiven positiven Kulturen durchgeführt, die als eine Kultur angesehen werden, in der es mindestens zwei koloniebildende Einheiten in beiden arzneimittelfreien Vertiefungen gibt.

Das Vorhandensein von Verunreinigungen ist leicht zu erkennen, da das Medium trüb wird und am fünften Tag der größte Teil des Bohrlochs im Allgemeinen überwuchert ist. Im Gegensatz dazu führt das Wachstum von Mykobakterien nicht zu einer Trübung des anfänglichen Wachstums von Mykobakterien bilden kleine kommaartige Formen, die stetig fortschreiten und charakteristische Sehnen oder Verwicklungen bilden. Innerhalb von zwei Wochen wird ein stark positives Wachstum Konglomerate von Mykobakterien gebildet haben, deren Schnüre nur an den Extremitäten wirklich sichtbar sind.

Die überwiegende Mehrheit der Kulturen, die positiv werden, sind bis zum 14. Tag positiv, und daher empfehlen wir tägliche Messungen vom fünften bis zum 14. Tag und danach alle zwei oder drei Tage je nach Laborbelastung an dem Tag, an dem eine Kultur in den beiden drogenfreien Vertiefungen eindeutig positiv ist, sollte die medikamentenhaltige Vertiefung abgelesen werden. Jedes Wachstum in Gegenwart eines der beiden Arzneimittel weist auf eine Resistenz gegen dieses Arzneimittel hin. Es ist sehr wichtig zu beachten, dass, wenn der Bereich der wirkstoffhaltigen Vertiefungen mehr als eine Woche nach der Feststellung einer positiven Kultur in den arzneimittelfreien Vertiefungen durchgeführt wird, dies möglicherweise keine Resistenz darstellt, da gelegentlich ein Durchbruchswachstum zu beobachten ist.

Die Messwerte können an Tag 21 aufhören, wenn eine Kultur negativ ist, da positive Kulturen nach dieser Zeit bei Patienten, die keine Therapie erhalten, nie mehr auftreten. Nach Abschluss der 21-tägigen Inkubation können die Kulturen verworfen werden. Die Kulturen verbleiben in ihren Ziploc-Beuteln und werden in Autoklavenbeuteln und Autoklaven bei 121 bis 124 Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten gelagert, wonach sie sicher entsorgt werden können. Ich werde jetzt nur ein paar Worte über die Biosicherheit und den Mods-Assay sagen, da wir Mods nicht nur in Peru, sondern auch in Afrika und Asien eingeführt haben.

Es stellt sich immer wieder die Frage nach der Sicherheit und der Biosicherheit der Verwendung von mikrobakteriellen Kulturen in flüssigen Medien. Das ist eine verständliche Befürchtung, denn offensichtlich können Flüssigkeiten verschüttet werden und feste Medien tragen dieses Risiko nicht in sich, und es besteht auch die Gefahr der Aerosolisierung, wenn wir es mit Suspensionen von Mykobakterien zu tun haben. Genau aus diesen Gründen glauben wir, dass die Mod-Methodik eine sicherere Methode ist als jede Methodik, die indirekte Empfindlichkeitstests erfordert.

Der Grund dafür ist, dass für die indirekte Empfindlichkeitsprüfung eine Suspension einer bekannten Konzentration von Mikrobakterien hergestellt wird. Dies beinhaltet daher die Manipulation von hochkonzentrierten Lösungen von Mikrobakterien mit allen damit verbundenen Risiken des Verschüttens und der Aerosolisierung. Im Gegensatz dazu beinhaltet die Mods-Methodik, wie Sie jetzt gesehen haben, einfach die Inokulation einer Sputumprobe in unsere Platte, wonach die Platte in einer Plastiktüte versiegelt wird.

Dieser Beutel wird nie wieder geöffnet, und daher müssen wir uns nicht mit diesen hochkonzentrierten Suspensionen auseinandersetzen. Das soll nicht heißen, dass wir glauben, dass die Mod-Methodik absolut sicher ist: Der Umgang mit Mykobakterien birgt immer ein Risiko. Allerdings schienen die 2006 veröffentlichten Daten aus Korea unsere Position bestätigt zu haben, dass Mods nicht gefährlicher sind als das Auslöschen jeder anderen Kultur.

Dabei handelte es sich um eine Studie, die an Labormitarbeitern durchgeführt wurde und die zeigte, dass die Berufsrisiken für Laborarbeiter, die Kulturen ausplattierten und keine Verantwortung für Arzneimittelempfindlichkeitstests trugen, nicht größer waren als die für diejenigen, die Sputumabstrichmikroskopie durchführen. Im Gegensatz dazu haben diejenigen, die mit Suspensionen von Mykobakterien umgehen und Empfindlichkeitstests durchführen, ein viel höheres berufsbedingtes Risiko für Tuberkulose. Es ist natürlich von größter Bedeutung, dass das gesamte Laborpersonal so weit wie möglich geschützt ist, und wir empfehlen daher dringend, dass keiner dieser Eingriffe ohne angemessenen persönlichen Atemschutz durchgeführt wird, d. h. N95-Standardmasken.

Darüber hinaus ist eine biologische Sicherheitswerkbank oder Haube der Klasse zwei erforderlich, in der alle erschöpften Bereiche durch HEPA-Filter gefiltert werden. Ein einfacher Mechanismus, der sehr wichtig ist, um Turbulenzen des Luftstroms in einem Labor zu vermeiden, ist ein Schloss an der Labortür, um das Betreten und Verlassen des Personals während der Probenverarbeitung zu verhindern. Dies reduziert das Risiko einer Übertragung innerhalb des Labors, also hoffe ich, dass das Ihnen einen guten Überblick darüber gegeben hat, was die Mods-Methodik beinhaltet und wie nützlich sie in Umgebungen sein könnte, in denen die Ressourcen begrenzt sind, aber eine qualitativ hochwertige TB- und MDR-TB-Diagnose dringend erforderlich ist.

Für weitere Informationen können Sie unsere Website mods peru. org besuchen, wo Sie unsere detaillierten Standardarbeitsanweisungen, das Benutzerhandbuch für Mods, finden. Neben SOPs für die Verarbeitung von extrapulmonalen Proben haben wir auch eine Fotobibliothek von Mykobakterien und Tuberkulose, anderen Mykobakterien sowie bakterieller und pilzlicher Kontamination, und Sie können auch unsere Qualitätssicherungsstrategie und das Verfahren finden, das wir für die Akkreditierung von Laboratorien empfehlen, um mit der Verwendung von Mods zu beginnen.

Zu guter Letzt gibt es noch ein Blatt mit häufig gestellten Fragen, und wir freuen uns über jedes Feedback von Benutzern, die derzeit Mods verwenden, da es sich um eine iterative Methode handelt. Wie wir bereits erklärt haben, handelt es sich um einen nicht-proprietären Test und wir sind immer an Verbesserungen interessiert, die andere Labore vorgenommen haben.