Name: Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Lernen Sie die Präparation des ZNS aus Drosophila-Larven dritter Instar für neurobiologische Studien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteinausdruck im Nervensystem.

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<ol><li> Dissect 3 rd Larvenstadium, so dass CNS an der Nagelhaut. Legen Sie in einem 1,5 ml-Tube. </li><li> Fix in PBS (1x) mit 2% Formaldehyd für 40 min mit Schaukeln. ; Verwenden 250ul für alle 5-10 seziert ZNS. </li><li> Entfernen Formaldehyd und kurz 3 x waschen mit PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST). Verwenden Sie ein fein gezogen Pasteurpipette, um den Verlust von Gewebe zu vermeiden. </li><li> Block nicht-spezifische Protein-Bindungsstellen und permeabilisieren Zellmembranen durch Inkubation Gewebe 1-8 Std. in PBST + 5% BSA, Schütteln bei 4 ° C. </li><li> Inkubieren in Primärantikörper in PBST + 5% BSA Schütteln bei 4 ° C über Nacht verdünnt. Optimal Antikörperverdünnung wird für verschiedene Antikörper variieren. </li><li> Spülen Sie 3x in PBST durch zwei 30min Wäschen bei 4 ° C, gefolgt </li><li> Inkubieren in sekundären Antikörper in PBST verdünnt + 5% BSA für 1-3 Stunden Schütteln bei 4 ° C. Spülen Sie 3x in PBST durch zwei 30min Wäschen bei 4 ° C, gefolgt Wenn der sekundäre konjugiert ist eine lichtempfindliche Verbindung, wickeln Sie das Rohr in Alufolie. </li><li> Dissect Gewebe weiter (falls nötig) und montieren Sie auf Folien. </li></ol>

<ol>
	<li>Lin, D. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+and+increased+expression+of+fasciclin+II+alters+motoneuron+growth+cone+guidance.">Ectopic and increased expression of fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance.</a> Neuron. 13, 507-523 (1994).</li><li>Park, Y., Fujioka, M., Kobayashi, M., Jaynes, J., Datta, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=even+skipped+is+required+to+produce+a+trans-acting+signal+for+larval+neuroblast+proliferation+that+can+be+mimicked+by+ecdysone.+Development+128.">even skipped is required to produce a trans-acting signal for larval neuroblast proliferation that can be mimicked by ecdysone. Development 128.</a> , 1899-1909 (2001).</li></ol>

Die Autoren haben keine Offenlegungspflichten.

Dieses Video zeigt, wie das ZNS aus dritten Larvenstadium Drosophila-Larven zu sezieren. Nach der Präparation kann das ZNS gefärbt mit einem Standard-Immunhistochemie Protokoll. Derzeit ist vieles noch unbekannt, wie die erwachsenen Nervensystem ist und wie es speichert generiert und übermittelt Informationen. Studien über die Entwicklung von Drosophila Larve ZNS sollte unser Wissen darüber, Nervensystem Verdrahtung und Funktion. Drosophila-Larven weisen eine Reihe von stereotpyed Verhaltensweisen wie eine Reaktion auf Umweltreize. ...

<table><tbody><tr><td>Pinzette</td><td>feinspitzig</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9-Vertiefungen-Objektträger</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik-Petri-Schale</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection der larven zns von drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Das zentrale Nervensystem (ZNS) von Drosophila-Larven ist komplex und kaum verstanden. Ein Weg, um das ZNS zu untersuchen ist, Immunhistochemie verwenden, um die Expression von verschiedenen neuen und Markerproteine ​​zu untersuchen. Die Färbung des ganzen Larven ist unpraktisch, weil die harten Kutikula verhindert das Eindringen von Antikörpern in der Körperhöhle. Um diese Gewebe Fleck ist es notwendig, das Tier vor sezieren, um Fixierung und Färbung. In diesem Artikel werden wir zeigen, wie Drosophila-Larven ohne Beschädigung des ZNS zu sezieren. Beginnen Sie mit dem Reißen der Larve in Hälfte mit einer feinen Pinzette, und biegen Sie dann die Kutikula &quot;inside-out&quot; des ZNS aussetzen. Wenn die Dissektion sorgfältig durchgeführt wird, das ZNS bleibt an der Nagelhaut. Wir halten in der Regel das ZNS an der Kutikula der ganzen Fixierung und Färbung Schritte, und nur die vollständige Entfernung des ZNS von der Kutikula kurz vor der Montage der Proben auf Glasträger. Wir zeigen auch einige repräsentative Bilder eines larvalen ZNS mit Eve, ein Transkriptionsfaktor in einer Untergruppe von Neuronen im ZNS exprimiert gefärbt. Der Artikel schließt mit einer Diskussion über einige der praktischen Anwendungen dieser Technik und die möglichen Schwierigkeiten, die entstehen können.

In diesem Artikel werden wir zeigen, wie das zentrale Nervensystem aus dritten Larvenstadium Drosophila-Larven zu sezieren.

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

Das Zentralnervensystem (ZNS) von Drosophila-Larven ist komplex und bisher nur unzureichend verstanden. Eine Möglichkeit, das ZNS zu untersuchen, besteht darin, die Immunhistochemie einzusetzen, um ...

Ich heiße Nate Fer. Ich bin hier an der Princeton-Universität Doktorand. Okay. Das, was Sie tun möchten, ist, den Wurm zu finden und ihn dann in eine Schale mit etwas PBS zu überführen.So sehen sie aus, und man reißt sie in der Mitte auseinander, wobei sämtliche Innereien herausspringen. Hier habe ich das Cuticula mit einer Ansammlung aller inneren Strukturen, und ich achte darauf, dass es von innen nach außen gestülpt ist, und stelle sicher, dass das ZNS noch angeheftet ist. So. Verstanden. Ja. Es ist genau dort.Genau dort. Welche? Sie können es auf meiner rechten Pinzette sehen.Hier haben Sie zwei verschiedene Lappen und dann das ZNS selbst, das wie eine Pfahlwurzel nach unten verläuft und sich direkt hier an der rechten Seite der dunklen Mundhaken und des restlichen Cuticula-Anteils befindet. Möchten Sie das ZNS auf diese Weise isolieren? Ja, sicher.Ich kann es schaffen. Und das ist die Ansicht von oben nach unten. Sie sehen also die beiden Lappen und dann das zentrale Nervensystem selbst.Warum führen Sie dieses Experiment durch? Nun, wir interessieren uns dafür, die Expression von Proteinen im Nervensystem der Larven zu untersuchen. Die beste Vorgehensweise besteht daher darin, das Larvengewebe einfach auseinanderzunehmen.Und da es für Antikörper schwierig ist, durch die Cuticula in einem gesamten Gewebe einzudringen, isolieren wir zuerst das zentrale Nervensystem der Larve und verwenden dann das präparierte Gewebe, um die gewünschte Analyse hinsichtlich der Proteinanfärbung durchzuführen. Und warum tun Sie das? Genauer gesagt, aus welchem Grund?Im Grunde genommen hängt es wirklich davon ab, was Ihre Interessen bezüglich der Analyse sind. Das Protein, das ich untersuche, wird während der gesamten Entwicklung exprimiert, und wir möchten beobachten, wie sich die Lokalisation des Proteins verändert, und sehen, welche Zelltypen unser Protein exprimieren. Daher möchten wir einen zeitlichen Verlauf während der Entwicklung erhalten.Welches sind die spezifischen Probleme bei diesem Experiment? Nun, eines der Probleme, wie ich bereits erwähnt habe, besteht darin, dass Sie das Gewebe dissezieren müssen. Daher ist zunächst eine gewisse technische Expertise erforderlich, um die Larven stabil zu halten, vorsichtig auseinanderzuziehen und die Invertiertechnik durchzuführen.Um das ZNS freizulegen, benötigen Sie eine feine Spitzzange. Denn wenn Ihre Pinzette nicht fein genug ist, ist es, als würden Sie mit Handschuhen statt mit Ihren Fingern arbeiten. Die Technik ist am Anfang etwas schwierig zu erlernen, danach ist sie jedoch nicht mehr so schwierig.Und die Färbung ist eigentlich gar nicht so schwierig. Es handelt sich lediglich um eine Standard-Antikörper-Färbung. Allerdings muss man beim Pipettieren der Lösungen in Ihrem Reaktionsgefäß vorsichtig sein, um das Gewebe nicht zu verlieren, da es recht klein sein kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila Larven NMJ Dissection

Drosophila melanogaster-Larven bieten ein ideales Modellsystem, um die Mechanismen der axonalen Transport innerhalb Larven segmentalen Nerven zu untersuchen. Mit diesem Verfahren können 3 rd Larvenstadium, die verschiedene Mutationen zu Wildtyp-Larven verglichen werden.

Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3 Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

Wir beschreiben ein Flippase-induzierte intersectional Gal80/Gal4 Repression (FINGR)-Methode, so dass Gewebe-spezifische FLP zu GAL80 Expressionsmuster zu bestimmen. Überall dort, wo Gal4 und FLP überlappen, wird Gal4 Ausdruck eingeschaltet (GAL80 ausgeflippt) oder aus (GAL80 gespiegelt in). Die FINGR Methode ist vielseitig für klonale Analyse und neuronalen Schaltkreis-Mapping.

Mapping und Anwendung von Enhancer-trap Flippase Expression in Larven und Erwachsene Drosophila CNS

Dieses Video beschreibt, wie man das erwachsene Drosophila-Gehirn präpariert und isoliert – ein Verfahren, das notwendig ist, um das Organ sichtbar zu machen, das sonst von der Nagelhaut, dem Auge und dem Luftröhrengewebe verdeckt wird. Das Beispielprotokoll zeigt eine detaillierte Demonstration, die zu hochwertigen Präparaten führt, die für Immunfärbungen und bildgebende Verfahren in der Neurobiologie von Drosophila verwendet werden können.

Drosophila Dissektion des Gehirns von Erwachsenen: Eine Methode der Fliegenneurobiologie

Dieses Video zeigt das Sezieren und Montieren von Hirnexplantaten von Drosophila-Larven. Das zentrale Nervensystem (ZNS), das an den Augenscheiben befestigt ist, wird aus den Larven extrahiert und dann in einer physiologischen Kochsalzlösung auf einen Objektträger montiert.

Dissektion und Montage von Explantaten aus Fruchtfliegenlarven

Eine Verletzung Paradigma mit der Drosophila Larve Bauchmark des zentralen Nervensystems Regeneration und Reparatur zu untersuchen beschrieben. Stabbing gefolgt von Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie im Zeitraffer und festen Proben mit quantitativen Analyse mit gezielt entwickelten Software und Genetik kombiniert werden verwendet, um die molekularen Mechanismen der ZNS-Regeneration und Reparatur zu untersuchen.

Eine Verletzung Paradigm Central Nervous System Repair in Untersuchen<em&gt; Drosophila</em

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Aufzeichnen der absteigenden elektrische Aktivität von Drosophila Melanogaster Zentralnervensystems ermöglichen kostengünstige und praktische Erprobung von pharmakologischen Wirkstoffen, Genmutationen neuronaler Proteine, und/oder die Rolle der unerforschten physiologischen Wege.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

Dieses Protokoll beschreibt drei Schritte zur Vorbereitung von Larven und adulten Drosophila-Sehlappen für die Bildgebung: 1) Dissektion des Gehirns, 2) Immunhistochemie und 3) Montage. Der Schwerpunkt liegt auf Schritt 3, da unterschiedliche Montageausrichtungen erforderlich sind, um spezifische Optikkeulenstrukturen sichtbar zu machen.

Dissektion, Immunhistochemie und Montage von Larven und adulten Drosophila-Gehirnen zur Visualisierung des Sehlappens

Hier diskutieren wir einen Arbeitsablauf zur Präparation, Sektion, Montage und Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven des dritten Stadiums, um die zelluläre und subzelluläre Dynamik unter physiologischen Bedingungen zu beobachten.

Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns

Lernen Sie die Präparation des ZNS aus Drosophila-Larven dritter Instar für neurobiologische Studien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteinausdruck im Nervensystem.

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

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