Name: Protokolle für Mikroapplikator-assisted Infektion Schmetterlingslarven mit Baculovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-23T13:32:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Lernen Sie zwei Mikroapplikator-Techniken zur Infektion von Schmetterlingslarven mit Baculovirus. Diese Methoden ermöglichen präzise Bioassays zur Bewertung der insektiziden Wirksamkeit verschiedener Virusstämme in vivo.

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Bitte besuchen <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-457-5_18">Springer Protocols</a> , um mehr über das Engineering Baculovirus als insecidical Agenten und dem Mikroapplikator Techniken in diesem Test verwendet.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

protokolle für mikroapplikator-assisted infektion schmetterlingslarven mit baculovirus

Protocols for Microapplicator-assisted Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviren sind weit verbreitet sowohl als Protein-Expressionsvektoren und Schädlingsbekämpfung Mittel verwendet. . Dieses Video zeigt, wie Schmetterlingslarven mit Mikroapplikator Techniken in den Darm mit Baculovirus Polyeder und in der Hämolymphe mit Knospen-Virus infiziert werden können. Diese begleitende Springer Protocols Abschnitt gibt einen Überblick über das Baculovirus-Lebenszyklus und die Verwendung von Baculoviren als insektizide Wirkstoffe. Formulierung und Anwendung von Baculoviren zur Schädlingsbekämpfung sind an anderer Stelle beschrieben.

In diesem Video zeigen wir zwei Mikroapplikator Techniken verwendet, um von Lepidoptera Larven mit Baculovirus infiziert, um insektizide Wirksamkeit zu bestimmen.

Protokolle für Mikroapplikator-assisted Infektion Schmetterlingslarven mit Baculovirus

Baculoviren werden sowohl weit verbreitet als Proteinexpressionsvektoren als auch als biologische Pflanzenschutzmittel zur Bekämpfung von Insektenschädlingen eingesetzt. Dieses Video zeigt, wie Larven von Lepidoptera ...

Während das arthropodenspezifische Baccala-Virus als Standard-Forschungswerkzeug für eukaryotische Proteinexpressionssysteme verwendet wird, wird es auch als umweltverträgliches insektizides Mittel entwickelt, das pflanzenfressende Insekten wie Lepidoptera in der Natur abtöten kann. Lepidopterenlarven werden infiziert, wenn sie infizierte Pflanzenteile fressen. Die Larven oder Raupen nehmen das Baccala-Virus in einer Form auf, die als Polyeder bekannt ist, einem Komplex aus Viruspartikeln, die in einer großen kristallinen Proteinstruktur verpackt sind, die das Virus vor Austrocknung schützt.Nach der Infektion der Larve verbreitet sich das Virus innerhalb des Insekts. Das Virus übernimmt die Maschinerie des Wirts zur Synthese von Nukleinsäuren und Proteinen, um weitere Viren und Polyederkörperchen zu produzieren. Schließlich ist die Larve derart gründlich mit Viren infiziert, dass sie zu einem zähen Sekret aus Polyederkörperchen zerfällt, das auf Pflanzenteile tropft, die vom Insekt gefressen werden. Dadurch beginnt der Zyklus erneut, um die insektizide Wirksamkeit eines bestimmten Baca zu bestimmen.Techniken mit Mikroapplikatoren für Avir-Stämme und Bioassays können kombiniert werden. Larven können durch Injektion von Viruspartikeln direkt in die Hämolymphe oder Körperhöhle infiziert werden, woraufhin die Sterblichkeitsraten bewertet werden können. Zusätzlich können Larven mittels oraler Mikroapplikation mit Polyedern infiziert werden, und der Zeitpunkt der Infektion des Darms sowie anderer Gewebe kann analysiert werden.Hi, ich bin Wendy Sparks im Labor von Brian e boning an der Abteilung für Entomologie an der Iowa State University, und ich komme ebenfalls von boning snap. Heute zeigen wir Ihnen zwei Verfahren zur Infektion von Labordrosseln mit dem Backlog-Virus. Beide Methoden verwenden einen Mikroapplikator.Zunächst zeige ich Ihnen, wie man einen Mikroapplikator verwendet, um Körpervirus über die Prole in das He in das Heni einzubringen. Anschließend zeige ich Ihnen, wie man den Mikroapplikator verwendet, um Poly-Header über die Maus in die Mittelsperre einzuführen. Beginnen wir also.Wenn Balo-Viren für insektizide Zwecke entwickelt werden, enthalten sie gewöhnlich das Polyhedrin-Gen, um die orale Infektion von Schadinsektenlarven zu erleichtern. Gelegentlich gibt es jedoch Gründe, ein polyhedron-negatives Baculovirus auf mögliche insektizide Wirkungen zu testen oder den Darm eines Insekts zu umgehen. In diesem Fall kann eine Injektion des freien Virus mit einem Mikroapplikator durchgeführt werden, um die Larven vor Beginn des Assays zu infizieren.Die Titer der Arbeitsprobe des butted Virus sollten mittels Plaque-Assay oder Endpunktverdünnungsassays bestimmt werden. Für physiologische Experimente wären Injektionen von fünf mal 10 hoch vier PFU pro fünfter Instar H VNS typisch. Um diesen Bioassay zu beginnen, füllen Sie jede Verdünnung des butted Virus in eine plastische Ein-Kubikzentimeter-Hercule-Spritze mit einer 28,5- oder 32-Gauge-Spitze.Normalerweise ein bis drei Mikroliter der angespitzten Viruslösung mit einer Titerkonzentration von 10 hoch 7 bis 10 hoch 8 pro Milliliter, die für jede Larve verwendet werden kann, sodass das Befüllen von 300 bis 500 Mikrolitern in die Spritze für die meisten Zwecke ausreicht. Danach werden Luftblasen aus der Spritze entfernt, indem man die Spritze aufrecht hält, um die Luft an die Nadelspitze zu bringen, und dann etwas Flüssigkeit abgibt.Befestigen Sie dann die Spritze an der Spritzenhalterung. Stellen Sie nun das Volumen auf 1,0 Mikroliter ein. Kalibrieren Sie für jeden Tropfen an der Mikroprozessor-Steuerungseinheit des Mikroapplikators zunächst die Steuerungseinheit, um sicherzustellen, dass das korrekte Volumen abgegeben wird. Die Geschwindigkeit, mit der der Tropfen abgegeben wird, kann auf einer Skala von null bis neun eingestellt werden.Ein Bereich von null bis eins wird üblicherweise verwendet. Drücken Sie den Fußschalter, um sicherzustellen, dass die Lösung angemessen abgegeben wird. Beachten Sie, dass bei zu großer abgegebener Menge oder zu langsamer Applikation die Volumen- und Geschwindigkeitseinstellungen so lange angepasst werden können, bis das richtige Lösungsvolumen mit der korrekten Rate appliziert wird.Ich bin nun bereit, die Injektion für die HVNS-Infektion durchzuführen. Frühe Larven im fünften Stadium werden typischerweise injiziert, da die größere Größe der späteren Larvenstadien den Injektionsvorgang erleichtert. Führen Sie die Nadelspitze durch die Plana eines der Vorderbeine und in die Körperhöhle ein.Beachten Sie, dass beim Einführen der Nadelspitze in das Prole die Position des Larvenkörpers verändert werden muss, um den Darm und die Körperwand nicht zu beschädigen. Drücken Sie nun viermal den Fußschalter, um vier Mikroliter der Viruslösung in die Hämolymphe abzugeben. Nach Abschluss der Injektionen bringen Sie alle Larven in den Inkubator bei 28 Grad Celsius zurück. Überprüfen Sie regelmäßig auf tote Larven und stellen Sie sicher, dass ausreichend Nahrung für die überlebenden Larven verfügbar ist.Auch wenn späte Larvenstadien nicht an Verletzungen des Cuticula durch Injektion sterben, sollten die Larven dennoch 24 Stunden nach der Injektion überprüft werden, um Schäden am Darm auszuschließen, die durch bakterielle Infektionen verursacht sein könnten. Diese frühe Mortalität sollte von der Datenanalyse ausgeschlossen werden. Wenn der mikroapplikatorgestützte Bioassay mit abgeschnittenem Virus für letale Konzentrationsbestimmungen verwendet wird, sollte der Bioassay an getrennten Termin drei- oder viermal wiederholt werden.Verwenden Sie 30 Individuen pro Dosis für jeden Virus oder jede Kontrollbehandlung. Nutzen Sie ein geeignetes Programm zur Probit-Analyse, wie zum Beispiel Polo oder SAS, um die LC50-Werte, 95-%-Konfidenzintervalle und die entsprechenden statistischen Kenngrößen zu berechnen. Dieser Bioassay kann ebenfalls verwendet werden, um ST50-Überlebenszeitwerte nach Inokulation einer festen Virusdosis zu bestimmen.In diesem Fall wird die Larvenmortalität alle vier bis acht Stunden mit häufigeren Beobachtungen erfasst. Wenn die Mortalitätsrate hoch ist, werden die medianen Überlebenszeiten innerhalb der 95-%-Konfidenzintervalle unter Verwendung des Kaplan-Meier-Schätzers mit einem S-Plus- oder SAS-Programm berechnet. Nun, da Harran Ihnen den mikroapplikatorgestützten Bioassay unter Verwendung von butted Virus gezeigt hat.Ich zeige Ihnen den Assay. Die orale Applikation von Polyedern direkt in den Insekten-Darm wird angewendet, wenn der exakte Zeitpunkt der Infektion entscheidend ist. Zum Beispiel, wenn man untersucht, wie sich das Virus innerhalb des Insekts ausbreitet, suspendieren Sie zu Beginn des Assays die Polyeder in einer neutral schwimmenden Lösung aus drei Teilen Glycerin und zwei Teilen Wasser von 10 bis 300.Polyeder könnten beispielsweise für die vierte Larvenstadiums-Infektion verwendet werden. Danach diese Lösung in eine plastische oder gläserne Ein-Kubikzentimeter-Tuberkulinspritze mit einer stumpfen Nadel der Größe 32 laden. Die Spritze auf das Halterungsrohr des Mikroapplikators setzen und durch ein Mikroskop schauen.Halten Sie die vierte oder fünfte Instar-Larve, führen Sie die Nadel durch den Mund in den vorderen Bereich des Mitteldarms ein und geben Sie anschließend die Polyeder ab. Diese Technik erfordert etwas Übung. Zunächst kann es schwierig sein, die Larven mit Handschuhen zu halten, ohne sie zu zerdrücken.Zweitens bedarf es etwas Übung, um die Nadel an den Mundteilen vorbeizuführen. Wir empfehlen, dass Sie das Inokulieren von etwa 30 Larven mit PBS üben. Sollten Sie versehentlich den Darm durchstechen, wird dies offensichtlich sein, da die Larven dann melanisieren und sich recht schnell schwarz färben.Auch hier ist die orale Inokulation mithilfe eines Mikroapplikators besonders nützlich für Experimente, bei denen der Infektionszeitpunkt wichtig ist, um die Ausbreitung des Virus innerhalb des Insekts zu untersuchen, da dieser exakt bestimmt werden kann. Beispielsweise können Viren, die Beta-Galactosidase exprimieren, oral in Larven inokuliert werden, die anschließend zu verschiedenen Zeitpunkten seziert werden, um festzustellen, welche Gewebe zu welchem Zeitpunkt infiziert werden. Wir zeigen Ihnen lediglich zwei mit dem Mikroapplikator durchgeführte Infektionsverfahren. Insekten werden mit Virus infiziert, wobei die erste Methode die direkte Inokulation über das Pro-Bein mit abgeschwächtem Virus ist, wodurch die Physiologie des Darms umgangen wird und Sie so die Letalität und die letale Zeit des untersuchten Virus beurteilen können.Die zweite Technik war die direkte Inokulation in den Mitteldarm unter Verwendung von Polyedern. Dadurch können Sie eine sehr präzise Dosis direkt in den Mitteldarm verabreichen und zudem den exakten Zeitpunkt des Ereignisses kontrollieren. Anschließend können Sie auch die Mortalität und andere Phänotypen des Virus untersuchen.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die von dem Baula-Virus getöteten Larven in der Regel zerbrechlich sind und leicht platzen können, wodurch das Virus freigesetzt wird. Deshalb müssen Arbeitsflächen sterilisiert und kontaminierte Handschuhe sowie Einwegmaterialien angemessen entsorgt werden, um eine Kontamination zu verhindern. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg mit Ihrem Experiment.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir, orale Infektion Techniken der Schmetterlingslarven mit Baculovirus um insektizide Wirksamkeit zu bestimmen.

Protokolle für orale Infektion von Schmetterlingslarven mit Baculovirus

Die hier beschriebene Methode nutzt Direkteinspritzung entomopathogener Bakterien in die Hämocoel...

Aufzucht und Injektion von<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larven zu bakteriellen Virulenz beurteilen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Etablierung eines Mycobacterium bovis-Infektionsmodells in den Larven der Großen Wachsmotte, Galleria mellonella. Ein biolumineszierender Stamm von Mycobacterium bovis BCG wird in die Hämolymphe der Larve injiziert, um eine Infektion zu etablieren, und die Biolumineszenz wird in vordefinierten Intervallen gemessen, um den Fortschritt der Infektion zu untersuchen.

Eine Technik zur Etablierung eines bakteriellen Infektionsmodells in Insektenlarven

Dieses Video zeigt die in vivo Messung der bakteriellen Belastung mit Bacillus Calmette-Guérin, BCG, lux-infizierten Insektenlarven. Der Prozess umfasst die Homogenisierung der Larven, die Behandlung mit einem Luciferase-Substrat und die Biolumineszenzmessung, um die relativen Lichteinheiten zu bestimmen, die mit der bakteriellen Belastung korrelieren.

Messung der in vivo Belastung durch Bakterien, die Luziferase exprimieren, in einer Insektenlarve

Die Mittelmeerfruchtfliege Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) ist ein weltweiter Schädling der Landwirtschaft. Ein tieferes Verständnis ihrer Biologie ist der Schlüssel, um die Populationen der Medfly zu kontrollieren und so die wirtschaftlichen Auswirkungen zu reduzieren. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein grundlegendes Instrument, das sowohl die Transformation der Keimbahn als auch umgekehrte genetische Studien bei dieser Spezies ermöglicht.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

Dieses Protokoll beschreibt eine Hitze Schock-induzierte Protein Expressionssystems (pDHsp/V5-His/sf9 Zellsystem), die verwendet werden können, mit dem Ausdruck Fremdeiweiße oder Bewertung der Anti-apoptotische Aktivität des potenziellen Fremdeiweiße und ihre abgeschnittenen amino Säuren in Insektenzellen.

Transiente Expression von Fremdgenen in Insekt Zellen (sf9) für funktionelle Protein Assay

In diesem Protokoll wird Baculovirus von Transiente Transfektion von Baculovirus Plasmid in Sf9 Zellen produziert und verstärkt in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR. Der Überstand wird durch Heparin Affinitätschromatographie gereinigt und weiter durch Ultrazentrifugation konzentriert. Dieses Protokoll eignet sich für die Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gen-Therapie Anwendung.

Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gentherapie Anwendung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Produktion Haus fliegen Carboxylesterase Proteine in Vitro mit einem Baculovirus vermittelte Insekt Ausdruck Zellsystem und später funktionell charakterisieren ihre Rolle bei der Metabolisierung Permethrin, dadurch konferieren pyrethroid Widerstand von zellbasierten MTT-Assay und in-vitro- metabolische Studien.

Funktionelle Charakterisierung von Carboxylesterases in Insektizid gegen Stubenfliegen, Musca Domestica

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle zur Nutzung von Insekten Zell- und Baculovirus Protein Expressionssystems zu produzieren große Mengen an Pflanzeneiweiß abgesondert für Protein Kristallisation. Ein Baculovirus Expressionsvektor wurde entweder mit GP67 oder Insekt Hemolin Signalpeptid für Pflanze Sekretion Proteinexpression in Insektenzellen geändert.

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

Das Baculovirus Expression Vector System (BEVS) ist eine robuste Plattform für das Expressionsscreening und die Produktion von Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs), die für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien verwendet werden sollen. Für die meisten PRMTs und andere Proteine von Interesse, die eine eukaryotische Expressionsplattform benötigen, können Milligrammmengen an Material produziert werden.

Herstellung rekombinanter PRMT-Proteine unter Verwendung des Baculovirus Expression Vector System

Strukturelle und biochemische Untersuchungen menschlicher Membrantransporter erfordern Milligrammmengen an stabilem, intaktem und homogenem Protein. Hier beschreiben wir skalierbare Methoden zum Screening, zur Expression und zur Reinigung humaner Transporter gelöster Substanzen unter Verwendung von Codon-optimierten Genen.

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Lernen Sie zwei Mikroapplikator-Techniken zur Infektion von Schmetterlingslarven mit Baculovirus. Diese Methoden ermöglichen präzise Bioassays zur Bewertung der insektiziden Wirksamkeit verschiedener Virusstämme in vivo.

Protokolle für Mikroapplikator-assisted Infektion Schmetterlingslarven mit Baculovirus

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