Protokolle für Mikroapplikator-assisted Infektion Schmetterlingslarven mit Baculovirus

Während das Arthropoden-spezifische Baccala-Virus als Standardforschungswerkzeug für eukaryotische Proteinexpressionssysteme verwendet wird, wird es auch als umweltverträgliches Insektizid entwickelt, das in der Natur pflanzenfressende Insekten wie Schmetterlinge töten kann. Schmetterlingslarven infizieren sich mit Baccala-Viren, wenn sie infiziertes Laub fressen. Die Larven oder Raupen nehmen das Baccala-Virus in einer Form auf, die als Polyeder bekannt ist, ein Komplex aus Viruspartikeln, der in einer großen kristallinen Proteinstruktur verpackt ist, die das Virus vor Austrocknung schützt.

Sobald die Larve infiziert ist, verbreitet das Butt-Virus die Infektion im Insekt. Das Virus kapert die Nukleinsäure- und Proteinsynthesemaschinerie des Wirts, um mehr Viren und Polyeder zu produzieren. Schließlich werden die Larven so gründlich mit dem Virus infiziert, dass sie sich in einem unordentlichen Schlamm aus Polyedern auflösen, der auf die vom Insekt gefressenen Pflanzenoberflächen tropft, und dann beginnt der Zyklus von neuem, um die insektizide Wirksamkeit eines bestimmten Bacas zu bestimmen.

Avir-Stamm-Mikroapplikatortechniken und Bioassays können kombiniert werden. Leid Dorin-Larven können durch Injektion des Butt-Virus direkt in die HemosIL infiziert werden oder die Körperhöhle und die Mortalitätsraten können beurteilt werden. Darüber hinaus können Larven durch orale Mikroapplikator-gestützte Injektion mit Polyedern infiziert werden, und der Zeitpunkt der Infektion des Darms und anderer Gewebe kann bestimmt werden.

Hallo, ich bin Wendy Sparks im Labor von Brian e Boning in der Abteilung für Entomologie an der Iowa State University Und ich bin auch von Boning Snap. Heute zeigen wir Ihnen zwei Verfahren zur Infektion von Laborkanal-DI mit dem Backlog-Virus. Bei beiden Methoden wird ein Mikroapplikator verwendet.

Zuerst zeige ich Ihnen, wie Sie einen Mikroapplikator verwenden, um Körperviren durch Prole in das Heni zu bringen. Wenn die Show angezeigt wird, verwenden Sie den Mikroapplikator, um den Poly-Header über die Maus in den Mid Guard zu bringen. Also lasst uns loslegen.

Wenn Baloviren für insektizide Zwecke entwickelt werden, enthalten sie in der Regel das Polyeder-Gen, um die orale Infektion von Schädlingslarven zu erleichtern. Gelegentlich gibt es jedoch Gründe, ein Polyeder-negatives Baccala-Virus auf mögliche insektizide Wirkungen zu testen oder den Darm eines Insekts zu umgehen. In diesem Fall kann die Injektion des konifizierten Virus mit einem Mikroapplikator durchgeführt werden, um die Larven vor Beginn des Assays zu infizieren.

Der Titer des Arbeitsstocks des butted Virus sollte mittels Plaque-Assay oder Endpunkt-Verdünnungsassays bestimmt werden. Für physiologische Experimente wären Injektionen von fünfmal 10 bis zur vierten PFU pro fünftem H-VNS im Stadium typisch. Zu Beginn dieses Bioassays wird jede konifizierte Virusverdünnung mit einer scharfen Nadelspitze von 28,5 oder 32 Gauge in eine Kunststoffspritze mit einem cm³ bis herkulieren gefüllt.

In der Regel ein bis drei Mikroliter konifizierte Viruslösung. Bei einem Titer von 10 bis zum Siebtel, minus 10 bis zum Achtel pro Milliliter kann für jede Larve so verwendet werden, dass das Laden von 300 bis 500 Mikrolitern in die Spritze für die meisten Zwecke ausreichend ist. Treiben Sie anschließend Luftblasen aus der Spritze, indem Sie die Spritze aufrecht halten, um Luft zur Nadelspitze zu bringen und abzugeben.

Befestigen Sie dann die Spritze auf dem Stützrohr der Spritze. Stellen Sie nun das Volumen auf 1,0 Mikroliter ein. Für jedes Tröpfchen an der Mikroprozessor-Steuereinheit des Mikroapplikators kalibrieren Sie zuerst die Steuereinheit, um sicherzustellen, dass das richtige Volumen abgegeben wird, die Geschwindigkeit, mit der das Tröpfchen dosiert wird, kann auf einer Skala von null bis neun eingestellt werden.

Häufig wird ein Bereich von null bis eins verwendet. Drücken Sie den Fußschalter, um sicherzustellen, dass die Lösung richtig dosiert wird. Denken Sie daran, dass bei zu viel oder zu langsamer Anwendung die Volumen- und Geschwindigkeitseinstellungen angepasst werden können, bis die richtige Menge der Lösung in der richtigen Menge aufgetragen wird.

Ich bin jetzt bereit, mit der Injektion für eine H-VNS-Infektion zu beginnen. Frühe fünfte Larven im Stadium werden in der Regel injiziert, die größere Größe der späteren Larven erleichtert den Injektionsprozess. Führen Sie die Nadelspitze durch die Plana eines der Pro-Beine in die Körperhöhle ein.

Beachten Sie, dass Sie beim Einstechen der Nadelspitze in das Prole die Körperposition der Larve ändern Um eine Beschädigung des Darms und der Körperwand zu vermeiden, drücken Sie nun viermal den Fußschalter, um vier Mikroliter der Viruslösung in die Hämodichtung zu bringen. Nachdem die Injektionen abgeschlossen sind, bringen Sie alle Larven in den 28 Grad Celsius heißen Inkubator zurück. Überprüfen Sie regelmäßig, ob tote Larven vorhanden sind und ob für überlebende Larven ausreichend Nahrung zur Verfügung steht.

Auch wenn späte Stadien nicht an einer Verletzung der Nagelhaut infolge der Injektion sterben, sollten die Larven dennoch 24 Stunden nach der Injektion auf Schäden am Darm untersucht werden, die aus einer bakteriellen Infektion resultieren könnten. Diese frühe Sterblichkeit sollte von der Datenanalyse ausgeschlossen werden. Wenn der Mikroapplikator-gestützte Bioassay mit konifiziertem Virus für Bioassays mit letaler Konzentration verwendet wird, sollte der Bioassay drei- oder viermal zu unterschiedlichen Zeitpunkten repliziert werden.

Verwenden Sie 30 Personen pro Dosis für jede Virus- oder Kontrollbehandlung. Verwenden Sie ein geeignetes Nachlassanalyseprogramm wie Polo oder SAS, um lc 50-Werte, 95%-Konfidenzintervalle und die entsprechenden Statistiken zu berechnen. Dieser Bioassay kann auch zur Bestimmung der ST 50-Überlebenszeit nach Inokulation einer festen Virusdosis verwendet werden.

In diesem Fall wird die Larvensterblichkeit alle vier bis acht Stunden gemessen, wobei die Beobachtungen häufiger sind. Wenn die Mortalitätsrate hoch ist, werden die medianen Überlebenszeiten in den 95%-Konfidenzgrenzen mit dem Kaplan-Meyer-Schätzer unter Verwendung eines s plus- oder SAS-Programms berechnet. Jetzt, da Harran Ihnen den Mikroapplikator-gestützten Bioassay mit butted virus gezeigt hat.

Ich zeige Ihnen den Assay. Verwendung von Polyedern Die orale Inokulation von Polyedern direkt in den Insektendarm wird angewendet, wenn der genaue Zeitpunkt der Infektion kritisch ist. Wenn Sie beispielsweise überwachen, wie sich das Virus im Insekt ausbreitet, um diesen Assay zu beginnen, suspendieren Sie Polyeder in einer neutral schwimmfähigen Lösung von drei bis zwei Glycerin und Wasser von 10 bis 300.

Polyeder könnten zum Beispiel für den vierten Einbau verwendet werden. Laden Sie dann diese Lösung in eine 1-CC-Tuberkulinspritze aus Kunststoff oder Glas mit einer 32-Gauge-Nadel mit stumpfer Spitze. Setzen Sie die Spritze auf das Stützrohr des Mikroapplikators und schauen Sie durch ein Mikroskop.

Halten Sie die vierte oder fünfte in die Sternlarve, führen Sie die Nadel durch den Mund in den vorderen Bereich des Mitteldarms ein und geben Sie dann die Polyeder ab. Diese Technik erfordert etwas Übung. Erstens kann es schwierig sein, die Larven mit Handschuhen zu halten, ohne sie zu zerquetschen.

Zweitens braucht es etwas Übung, um die Nadel an den Mundwerkzeugen vorbei zu navigieren. Wir empfehlen, dass Sie die Impfung von etwa 30 Larven mit PBS üben. Wenn Sie den Darm durchstechen, wird es offensichtlich sein, da die Larven melanieren und ziemlich schnell schwarz werden.

Da die mikroapplikatorgestützte orale Inokulation den genauen Zeitpunkt der Infektion liefert, ist diese Methode am nützlichsten für Experimente, bei denen der Infektionszeitpunkt wichtig ist, um festzustellen, wie sich das Virus im Insekt ausbreitet. Zum Beispiel können Viren, die Beta-Galaktose dase exprimieren, oral in Larven geimpft werden, die dann zu verschiedenen Zeitpunkten präpariert werden, um festzustellen, welches Gewebe infiziert wird. Wir zeigen Ihnen nur zwei Mikroapplikator-unterstützte Gefäße für die Infektion. Insektenliebe mit Viren, von denen die erste die direkte Inokulation über das Pro Legg des Butted-Virus war, und dies ermöglicht es Ihnen, die Darmphysiologie zu umgehen und die Letalität und Letalzeit des Virus zu beurteilen, an dem Sie interessiert sind.

Die zweite Technik war die direkte Inokulation in den Mitteldarm mit Polyedern. Dies ermöglicht es Ihnen, eine sehr präzise Dosis direkt in den Mitteldarm zu verabreichen und das Timing des Ereignisses sehr genau zu steuern. Dann können Sie auch die Sterblichkeit und andere Phänotypen des Virus untersuchen.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die vom Baula-Virus getöteten Larven in der Regel zerbrechlich sind und leicht aufplatzen können, um Viren freizusetzen. Sterilisieren Sie also Arbeitsflächen und entsorgen Sie kontaminierte Handschuhe und Einwegmaterialien in geeigneter Weise, um eine Kontamination zu vermeiden. Das war's also.

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit. Viel Glück bei Ihrem Experiment.