Beziehen Eier von Xenopus laevis Weibchen

Die Eier von Xenopus laevis intakt, lysiert und / oder fraktionierte sind nützlich für eine Vielzahl von Experimenten. Dieses Protokoll zeigt, wie die Eiablage zu veranlassen, zu sammeln und dejelly die Eier, und sortieren Sie die Eier, um beschädigte Eier zu entfernen.

Xip Labis Ei-Extrakte eignen sich als Quellen für zytoplasmatisches und Organellenmaterial für die in vitro Rekonstitution zellulärer Ereignisse wie der Kernassemblierung und des Imports von Kernproteinen. Bevor Sie Eiextrakte verwenden können, müssen Sie natürlich zuerst die Eier von weiblichen Fröschen gewinnen. Hallo, mein Name ist Marie Cross und ich bin Doktorandin im Labor von Dr. Maureen Power in der Abteilung für Zellbiologie an der Emory University in Atlanta, Georgia.

Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie Gelee-Eier von ausgewachsenen Opus-Lavis-Weibchen gewinnen und D-Eier erhalten. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Vorbereiten der Frösche auf das Ei, Legen mit trächtiger Marere, Serumgonadotropin-induzierendes Ei, Legen mit humanem Choriongonadotropin und Aussortieren von schlechten Eiern oder Zyten. Also lasst uns loslegen.

Um Eier zu produzieren, werden ausgewachsene weibliche Frösche zunächst mit trächtiger Stutenserum Gonadotropin gefüttert. Um mit dem Grundieren zu beginnen, bereiten Sie einen Tank mit hundert Millimolar Natriumchlorid vor, in dem die Frösche untergebracht werden können. Nach der Injektion sollten die Prime-Frösche bei einer Dichte von etwa einem Strahl pro Liter gehalten werden.

Eine optimale Eierproduktion wird durch die Haltung der Frösche bei 18 Grad Celsius gewährleistet. Injizieren Sie mit einer 27-Gauge-Nadel, die an einer Ein-Mil-Spritze befestigt ist, Frosch subkutan in den dorsalen Lymphsack mit 0,5 mil von 200 Einheiten pro Mil. Trächtige Stute Serum Gonadotropin.

Die Prime-Frösche werden wieder in den Tank mit hundert Millimolar Natriumchlorid zurückgeführt. Nach zwei bis drei Tagen induzieren Sie die Eiablage, indem Sie Fröschen 0,5 mil von hundert Einheiten pro Monat injizieren. Humanes Choriongonadotropin wird wiederum subkutan in den dorsalen Lymphsack injiziert.

Nach der Injektion legen Sie jeden Frosch in fünf Liter hundert Millimolar Natriumchlorid. Es ist am besten, jeden Frosch in einen eigenen Behälter zu legen, da die Qualität der Eier von Frosch zu Frosch unterschiedlich ist. Etwa 16 bis 22 Stunden nach der Injektion von humanem Choriongonadotropin bringen Sie den Frosch in einen sauberen Wassertank und gießen Sie die Eier in ein Becherglas.

Es ist ratsam, die Frösche ein bis zwei Tage lang auf Anzeichen einer Infektion an der Injektionsstelle zu beobachten. In diesem Stadium umgibt jedes Ei eine durchsichtige Geleehülle, die verhindert, dass sie sich berühren, um die Gelee-Eier zu entleeren, die Eier einmal zu spülen und 2 % Cystein pH H acht zu trinken und dann etwa fünf Minuten lang in hundert Schaufeln 2 % Cysteinlösung pro Frosch weiter zu inkubieren. Bei Zimmertemperatur die Eier nach fünf Minuten regelmäßig vorsichtig schwenken.

Gießen Sie die Cysteinlösung von den Deje-Eiern und waschen Sie sie dreimal in einer 0,25-fach modifizierten Ringerlösung. Um Schmutz zu entfernen, gießen Sie Eier in eine hundert Millimeter große Petrischale aus Glas und arbeiten Sie unter einem Präpariermikroskop. Die schlechten Eier mit einer Weidepipette aus der Petrischale nehmen.

Reife Xip-Eier haben eine dunkel pigmentierte Hälfte auf der Oberseite und eine helle Hälfte auf der Unterseite. Ein weißer, punktförmiger Fleck, der auf die Eizellreifung hinweist, sollte in der Mitte einer dunkel pigmentierten Hemisphäre der reifen Eizelle sichtbar sein. Ein gutes Ei ist eines, das gleichmäßig auf modellierter Pigmentierung steht.

Alles, was diesen weißen Fleck nicht hat, ist eine Eizelle und sollte entfernt werden. Eizellen, die weiß vergrößert oder nicht gleichmäßig pigmentiert sind, sollten ebenfalls entfernt werden. Ein besonders schlechtes Ei erscheint als weiße, aufgedunsene Kugel mit einer Grenze zwischen den Hemisphären, die zwei- bis dreimal vollständig verdeckt sind, indem sortierte Eier zwei- bis dreimal gewaschen werden, indem man Ei-Lys-Puffer auf sie gießt und dann den Puffer vorsichtig abgießt, um die Anzahl der verschütteten Eier zu minimieren.

Nun können Eier lysiert und Extrakte hergestellt werden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Gelee-Eier von reifen Xenopus lavis-Weibchen gewinnen und detieren können. Schauen Sie sich unbedingt unsere beiden anderen Videos an, die Ihnen zeigen, wie Sie rohe Eiextrakte zubereiten und wie Sie die In-vitro-Kernassemblierung mit fraktionierten Eiextrakten rekonstituieren.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.