Beziehen Eier von Xenopus laevis Weibchen

Xip-Labis-Ei-Extrakte eignen sich gut als Quelle für zytoplasmatisches Material und Organellen für die in-vitro-Rekonstitution zellulärer Vorgänge wie der Kernassemblierung und des nukleären Proteinimports. Natürlich muss man, bevor man Ei-Extrakte verwenden kann, zunächst die Eier von weiblichen Fröschen gewinnen. Hallo, ich heiße Marie Cross und bin Doktorandin in Dr. Maureen Powers Labor in der Abteilung für Zellbiologie an der Emory University in Atlanta, Georgia.

Heute zeigen wir Ihnen, wie man Ei- und D-Jelly-Eier von ausgewachsenen Weibchen von Opus lavis erhält. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Vorbereitung der Frösche für die Eiablage mittels pregnant mare serum gonadotropin, Induktion der Eiablage mittels humanem Choriongonadotropin sowie die Sortierung von defekten Eiern oder Zellen. Beginnen wir also.

Um Eier zu erzeugen, werden ausgewachsene weibliche Frösche zunächst mit schwangerem Stuten-Serum-Gonadotropin stimuliert. Für den Beginn des Stimulationsverfahrens bereiten Sie einen Behälter mit einer hundert Millimolar Natriumchloridlösung zur Unterbringung der Frösche vor. Nach der Injektion sollten stimulierte Frösche mit einer Dichte von etwa einem Frosch pro Liter gehalten werden.

Die optimale Eierproduktion wird durch die Haltung der Frösche bei 18 Grad Celsius gewährleistet. Injizieren Sie dem Frosch mit einer 27-Gauge-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, 0,5 Milliliter einer Lösung mit 200 Einheiten pro Milliliter schwangeren Stuten-Serum-Gonadotropin subkutan in den dorsalen Lymphsack.

Bringen Sie die gesunden Frösche zurück in das Becken mit hundert Millimolar Natriumchlorid. Nach zwei bis drei Tagen induzieren Sie die Eiablage, indem Sie die Frösche erneut subkutan in den dorsalen Lymphsack mit 0,5 Milliliter einer Lösung mit hundert Einheiten pro Milliliter humanem Choriongonadotropin injizieren.

Nach der Injektion jedes Frosch in fünf Liter einer hundert Millimolar Natriumchloridlösung geben. Es ist am besten, jeden Frosch in einen separaten Behälter zu setzen, da die Eiqualität von Frosch zu Frosch variiert. Etwa 16 bis 22 Stunden nach der Injektion mit humanem Choriongonadotropin den Frosch in ein sauberes Wasseraquarium überführen und die Eier in ein Becherglas gießen.

Es empfiehlt sich, die Frösche ein bis zwei Tage lang auf Anzeichen einer Infektion an der Injektionsstelle zu beobachten. Zu diesem Zeitpunkt umgibt eine durchsichtige Gelschicht jedes Ei, wodurch verhindert wird, dass sie sich berühren. Um das Gel von den Eiern zu entfernen, spülen Sie die Eier einmal mit einer 2%igen L-Cystein-Lösung bei pH 8 und setzen anschließend die Inkubation bei Raumtemperatur fort, wobei etwa fünf Minuten lang hundert Portionen einer 2%igen L-Cystein-Lösung pro Frosch verwendet werden. Nach fünf Minuten schwenken Sie die Eier vorsichtig und in regelmäßigen Abständen.

Gießen Sie die Cysteinlösung von den Deje-Eiern ab und waschen Sie diese dreimal in einer 0,25× modifizierten Ringer-Lösung. Um Verunreinigungen zu entfernen, geben Sie die Eier unter einem Stereomikroskop in eine 100 mm große Glas-Petri-Schale. Entfernen Sie die beschädigten Eier mit einer Pasteur-Pipette aus der Petri-Schale.

Reife Xip-Eier weisen eine dunkel pigmentierte obere Hälfte und eine helle untere Hälfte auf. Ein weißer, punktförmiger Fleck, der auf die Reifung des Oozyten hinweist, sollte in der Mitte der dunkel pigmentierten Hemisphäre des reifen Eis sichtbar sein. Ein gutes Ei zeichnet sich durch gleichmäßige, modellierte Pigmentierung aus.

Alles ohne diesen weißen Fleck ist ein Oozyt und sollte entfernt werden. Eier, die weiß vergrößert oder nicht gleichmäßig pigmentiert sind, sollten ebenfalls entfernt werden. Ein besonders schlechtes Ei erscheint als weißer, aufgeblähter Ball, bei dem die Grenze zwischen den Hemisphären vollständig verdeckt ist. Waschen und sortieren Sie die Eier zwei bis drei Mal, indem Sie Puffer für den Eilysat darüber gießen und den Puffer dann vorsichtig abgießen, wobei die Anzahl der verschütteten Eier minimiert werden sollte.

Nun können die Eier lysiert und Extrakte hergestellt werden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Eier von ausgewachsenen Xenopus laevis-Weibchen gewinnt und vom Eigel entfernt. Sehen Sie sich unbedingt unsere beiden weiteren Videos an, in denen gezeigt wird, wie man grobe Ei-Extrakte herstellt sowie wie man die in-vitro-Kernassemblierung unter Verwendung fraktionierte Ei-Extrakte rekonstituiert.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.