Sigma Unspezifische Protease Activity Assay - Casein als Substrat

Proteasen spalten Peptidbindungen im Labor. Es ist oft notwendig, die Aktivität von Proteasen von Sigma zu messen und/oder zu vergleichen. Der universelle Protease-Aktivitäts-Assay kann als standardisiertes Verfahren zur Bestimmung der Protease-Aktivität verwendet werden, was wir auch in unseren Qualitätskontrollverfahren tun.

In diesem Assay fungiert Casian als Substrat, wenn die Protease, die wir testen, Casian spaltet. Das Aminosäuretyrosin wird zusammen mit anderen Aminosäuren und Peptidfragmenten freigesetzt. Freies Tyrosin reagiert anschließend mit Follin und Cylcals Phenol oder Follin-Reagenz, um einen blau gefärbten Chromophor zu bilden, der quantifizierbar ist und als Absorptionswert am Spektrophotometer gemessen wird.

Je mehr Tyrosin aus Casian freigesetzt wird, desto mehr Chromophore entstehen und desto stärker ist die Aktivität der Protease. Die durch die Protease-Aktivität erzeugten Extinktionswerte werden mit einer Standardkurve verglichen, die durch die Umsetzung bekannter Tyrosinmengen mit dem FC-Reagenz erstellt wurde, um Änderungen der Extinktion zu korrelieren. Anhand der Tyrosinmenge in Mikromol aus der Standardkurve kann die Aktivität der Proteaseproben in Einheiten angegeben werden, wobei eine Einheit der Menge an Mikromol Tyrosinäquivalent entspricht, die pro Minute aus Cain freigesetzt wird. Hallo, mein Name ist Carrie Cup Vineyard und ich bin Wissenschaftlerin in unserer Sigma Aldridge DeKalb-Einrichtung hier in St. Louis, Missouri.

Heute zeige ich Ihnen eine universell anwendbare Methode, um die Proteaseaktivität bei Sigma Aldridge zu testen. Wir verwenden diesen Assay hauptsächlich in unserem Qualitätskontrollbereich, um sicherzustellen, dass unsere Protease ausreichende Aktivität besitzt, bevor wir sie direkt an Ihr Labor versenden. Vor Beginn des Assays müssen wir sicherstellen, dass die folgenden Reagenzien korrekt zubereitet wurden.

Ein 50 Millimolarer Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5. Die Lösung wird vor Gebrauch auf 37 Grad Celsius gebracht, sowie eine 0,65 Gewichtsprozentige Kasian-Lösung hergestellt, indem 6,5 Milligramm pro Milliliter in einem Liter gemischt werden. Die Lösungstemperatur wird unter sanftem Rühren allmählich auf 80 bis 85 Grad Celsius über etwa 10 Minuten erhöht, bis eine homogene Dispersion erreicht ist.

Es ist sehr wichtig, die Lösung nicht zu kochen. Der pH-Wert wird anschließend bei Bedarf mit Natriumhydroxid und Salzsäure eingestellt. Eine 110 Millimolar-Trichloressigsäure-Lösung wird hergestellt, indem ein 6,1 normales Stammlösung im Verhältnis 1 zu 55 mit gereinigtem Wasser verdünnt wird, 0,5 Millimolar, gefälltes und versiegeltes Calts oder gefälltes Phenolreagenz, das ist die Lösung, die mit Tyrosin reagiert, um eine messbare Farbänderung zu erzeugen.

Das steht in direktem Zusammenhang mit der Aktivität von Proteasen. Eine 500 Millimolar Natriumcarbonatlösung, hergestellt aus 53 Milligramm pro Milliliter wasserfreiem Natriumcarbonat in gereinigtem Wasser, sowie eine Enzymlöse, die aus 10 Millimolar Natriumacetatpuffer mit 5 Millimolar Calcium bei pH 7,5 bei 37 Grad Celsius besteht. Mit dieser Lösung lösen wir feste Proteasenproben oder verdünnen Enzymlösungen.

Die Standard-Stammlösung von L-Tyrosin, die eine Anfangskonzentration von 1,1 Millimolar, also eine Lösung von 0,2 Milligramm pro Milliliter L-Tyrosin, aufweisen sollte, wird in gereinigtem Wasser hergestellt und vorsichtig erwärmt, bis das Tyrosin gelöst ist. Wie bei der Casian-Lösung darf diese Lösung nicht gekocht werden. Lassen Sie die L-Tyrosin-Standardlösung auf Raumtemperatur abkühlen.

Diese Lösung wird gegebenenfalls weiter verdünnt, um unsere Standardkurve herzustellen, sowie eine feste Proteaseprobe mit vorbestimmter Aktivität, die mit Enzymverdünnungsmittel auf 0,1 bis 0,2 Einheiten pro Milliliter gelöst wird. Diese Lösung dient als positiver Kontrollwert für den Qualitätskontrolltest und zur Validierung der Berechnungen, die wir zur Bestimmung der Enzymaktivität durchführen werden. Nachdem wir unsere Reagenzien vorbereitet und auf die korrekte Temperatur gebracht haben, beginnen wir nun mit unserem Proteasetest.

Um diesen Assay zu beginnen, besorgen Sie geeignete Gefäße, die etwa 15 Milliliter fassen. Für jedes Enzym, das Sie testen werden, benötigen Sie vier Gefäße. Ein Gefäß dient als Blindprobe, die drei anderen werden zur Bestimmung der Aktivität von drei Proben verwendet.

Die Verdünnung der Protease in drei Verdünnungsstufen ist nützlich, wenn unsere Endberechnungen gegeneinander überprüft werden, um jedem Satz von vier Vials fünf Milliliter unserer 0,65 %igen Kasian-Lösung zuzusetzen und sie etwa fünf Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius equilibrieren zu lassen. Danach werden unterschiedliche Konzentrationen unserer Enzymlösung zu drei der Testprobe-Vials, jedoch nicht zum Blindansatz, hinzugefügt. Diese werden durch Schwenken gemischt und genau 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Die Proteaseaktivität und die daraus resultierende Freisetzung von Tyrosin während dieser Inkubationszeit werden zwischen unseren Testproben gemessen und verglichen. Nach dieser 10-minütigen Inkubation fügen Sie fünf Milliliter der TCA-Reagenzlösung zu jedem Reaktionsgefäß hinzu. Anschließend wird eine geeignete Menge der Enzymlösung zu jedem Gefäß, auch zum Blindansatz, zugegeben, sodass das Endvolumen der Enzymlösung in jedem Gefäß ein Milliliter beträgt.

Dies geschieht, um den Absorptionswert des Enzyms selbst zu berücksichtigen. Inkubieren Sie nun die Lösungen 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Während dieser 30-minütigen Inkubation können Sie Ihre Tyrosin-Standardverdünnungen vorbereiten, die unter Verwendung von sechs DR-Gefäßen durchgeführt wird.

Dieser kann problemlos acht Milliliter auf sechs Vials verteilen. Die 1,1-Millimolar-Tyrosin-Standardsalzlösung wird in den folgenden Volumina in Milliliter hinzugefügt: 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 und 0,5. Zum Blindansatz wird kein Tyrosin-Standard hinzugefügt.

Für IPU-Testproben, die nur eine geringe Farbänderung zeigen, können niedrigere Standards erforderlich sein. Nachdem die Tyrosin-Standardlösung hinzugefügt wurde, eine geeignete Menge gereinigtes Wasser zu jedem der Standards hinzufügen, um das Volumen auf zwei Milliliter aufzufüllen. Nach der Inkubation jede der Testlösungen sowie die Blindprobe filtrieren.

Unter Verwendung eines 0,45-Mikrometer-Spritzenfilters werden anschließend zwei Milliliter der Testproben und des blanken Filtrats in vier DR-Gefäße gegeben, die mindestens acht Milliliter fassen können. Sie können denselben Gefäßtyp verwenden, in dem die Standards hergestellt wurden. In alle Gefäße mit den Standards und dem Standard-Blanko werden fünf Milliliter Natriumcarbonat gegeben. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, wird das abgesetzte Reagenz unmittelbar danach hinzugefügt. Anschließend wird Natriumcarbonat zu den Testproben und dem Test-Blanko gegeben. Sie werden bemerken, dass diese Lösungen nach der Zugabe von Natriumcarbonat trüb werden.

Danach wird das abgesetzte Reagenz hinzugefügt, das mit freiem Tyrosin reagiert. Die DRAM-Probenfläschchen werden anschließend durch Schwenken gemischt und nach dieser Inkubation 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Sie sollten bemerken, dass die Standards eine Farbabstufung aufweisen, die mit der Menge des zugesetzten Tyrosins korreliert, wobei die höchsten Tyrosinkonzentrationen am dunkelsten erscheinen.

Sie können auch eine deutliche Farbänderung in unseren Testproben bemerken. Zwei Milliliter dieser Lösungen werden mit einem 0,45-Mikron-Spritzenfilter und geeigneten Küvetten filtriert. Nachdem wir unseren Assay abgeschlossen haben, begeben wir uns nun zum Spektrophotometer und nehmen unsere Extinktionswerte auf.

Die Absorption unserer Proben wird mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 660 Nanometern gemessen. Der Lichtweg wird auf einen Zentimeter eingestellt, und die Absorptionswerte für den Standard, die Standardblindprobe, die verschiedenen Testproben und die Testblindprobe werden aufgezeichnet. Sobald alle Daten gesammelt wurden, können wir unsere Eichkurve erstellen.

Um die Kurve zu erstellen, muss die Differenz der Extinktion zwischen dem Standard und dem Standard-Blanko berechnet werden. Dieser Extinktionswert entspricht der Menge an Tyrosin in den Standardlösungen. Nach dieser einfachen Berechnung erstellen wir unsere Eichkurve, indem wir die Extinktionsänderung unserer Standards auf der Y-Achse gegen die jeweilige Menge in Mikromol für jeden unserer fünf Standards auf der X-Achse auftragen.

Nachdem wir unsere Datenpunkte eingegeben und eine Ausgleichsgerade erstellt haben, ermitteln wir die Änderung der Absorption in unseren Testproben, indem wir die Differenz zwischen der Absorption unserer Testprobe und der Absorption unseres Test-Blanks berechnen. Anhand unserer Standardkurve identifizieren wir den Absorptionswert einer unserer Testproben auf der Y-Achse. Nun zeichnen wir eine Linie parallel zur X-Achse und halten an dem Punkt an, an dem wir auf unsere Standardkurve treffen.

Dann ergibt sich aus der X-Koordinate, die an diesem Punkt abgelesen wird, die Menge an freigesetztem Tyrosin in Mikromol während dieser spezifischen proteolytischen Reaktion. Um die Enzymaktivität in Einheiten pro Milliliter zu ermitteln, führen Sie die folgende Berechnung durch: Nehmen Sie die Anzahl der freigesetzten Tyrosin-Äquivalente in Mikromol, ermittelt aus der Standardkurve, und multiplizieren Sie diesen Wert mit dem Gesamtvolumen des Assays in Millilitern, das in unserem Fall 11 Milliliter beträgt. Anschließend teilen Sie diesen Wert durch drei weitere Größen.

Die Dauer des Assays, der zehn Minuten lang durchgeführt wurde, das Volumen des im Assay verwendeten Enzyms, das variiert wurde. Verwenden wir ein Milliliter. Das Volumen an Millilitern, das bei der chlorimetrischen Detektion verwendet wurde, das je nach Ihrem Q vet variieren kann.

Wir verwenden zwei Milliliter. Mikromol Tyrosin geteilt durch die Zeit in Minuten ergibt unsere Messgröße der Proteaseaktivität, die wir als Einheiten bezeichnen. Wir können die Volumeneinheiten im Zähler und Nenner gegeneinander kürzen und erhalten somit eine Messgröße der Enzymaktivität in Einheiten pro Milliliter.

Um die Aktivität einer festen Proteaseprobe, die in Enzympuffer verdünnt wurde, zu bestimmen, dividieren wir die Aktivität in Einheiten pro Milliliter durch die Konzentration des festen Stoffes, die ursprünglich in Milligramm pro Milliliter in diesem Assay verwendet wurde, sodass wir die Aktivität in Einheiten pro Milligramm erhalten. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man die Proteaseaktivität mithilfe des universellen Proteaseaktivitätsassays von Sigma analysiert. Wie Sie beim Durchführen dieses Verfahrens gesehen haben, ist es entscheidend, daran zu denken, sowohl die Casin- als auch die Tyrosinlösung langsam zu erhitzen und sie nicht zum Kochen zu bringen.

Außerdem ist es wichtig, unterschiedliche Blindproben sowohl für Ihre Standards als auch für jede Testprobe vorzubereiten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Proteaseaktivitäten.