Name: Sigma Unspezifische Protease Activity Assay - Casein als Substrat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Lernen Sie die standardisierte Protease-Aktivitätsbestimmung mit Casein als Substrat. Diese kolorimetrische Methode quantifiziert freigesetztes Tyrosin für die Qualitätskontrolle von Enzympräparationen im Labor.

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Vor Beginn des Tests, müssen wir sicherstellen, dass die folgenden Reagenzien richtig vorbereitet sind: <ol><li> Eine 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5. Bereiten Sie mit 11,4 mg / ml Kalium Phosphat zweiwertigen Trihydrat in gereinigtem Wasser und Einstellen des pH mit 1 M HCl. Diese Lösung wird bei 37 ° C vor dem Einsatz platziert. </li><li> A 0,65% Gewicht / Volumen Casein-Lösung durch Mischen 6,5 mg / ml Casein in der 50 mM Kaliumphosphatpuffer vorbereitet. Allmählich stieg die Temperatur der Lösung unter leichtem Rühren auf 80-85 ° C für ca. 10 Minuten, bis eine homogene Dispersion erreicht ist. Es ist sehr wichtig, nicht die Lösung kochen. Der pH-Wert wird dann angepasst, wenn nötig mit NaOH und HCl. </li><li> A 110 mM Trichloressigsäure-Lösung durch Verdünnen einer 6.1N Lager 1.55 mit gereinigtem Wasser hergestellt. Trichloressigsäure ist eine starke Säure und sollten mit Vorsicht behandelt werden. </li><li> 0,5 mM Folin &amp; Ciolcaltea ist, oder Folin ist Phenolreagenz, die die Lösung, die mit Tyrosin reagieren wird, um eine messbare Farbwechsel, die direkt auf die Aktivität von Proteasen bezogen werden zu generieren. Folin ist Phenolreagenz ist eine Säure und sollte mit Sorgfalt behandelt werden. </li><li> A 500 mM Natriumcarbonatlösung, hergestellt unter Verwendung von 53 mg / ml anyhydrous Natriumcarbonat in gereinigtem Wasser. Ein Enzym, Verdünnungsmittel Lösung, die von 10 mM Natriumacetat-Puffer mit 5 mM Calcium Acetate, pH 7,5, besteht bei 37 ° C. Diese Lösung ist es, was wir feste Protease-Proben auflösen oder verdünnten Enzym-Lösungen verwenden. </li><li> 1,1 mM L-Tyrosin-Standard-Stammlösung. Hergestellt unter Verwendung von 0,2 mg / ml L-Tyrosin in gereinigtem Wasser und leicht, bis die Tyrosin löst erwärmt. Wie mit dem Casein, nicht kochen diese Lösung. Lassen Sie die L-Tyrosin-Standard auf Raumtemperatur abkühlen. Diese Lösung wird weiter verdünnt werden, um unsere Standard-Kurve machen. </li><li> Protease-Lösung. Unmittelbar vor der Anwendung aufgelöst Protease in Enzym-Verdünnungslösung in Schritt 6 erstellt. </li></ol> Wenn nötig, verwenden Sie eine feste Protease-Probe von vorbestimmten Tätigkeit, die aufgelöst mit Enzym Verdünnungsmittel auf 0,1-0,2 Einheiten / ml ist. Diese Lösung dient als positive Kontrolle für die Qualitätskontrolle Test und Validierung für die Berechnungen führen wir die Enzymaktivität bestimmt wird. Einrichten des Protease-Assay-und Standard-Kurven <ol><li> Zu Beginn dieses Tests finden Sie passende Fläschchen, dass etwa 15 mls halten wird. Für jedes Enzym, das getestet werden soll, sind 4 Flaschen benötigt. Ein Fläschchen wird als Rohling verwendet werden, und drei andere wird Assay Aktivität von drei Verdünnungen der Protease verwendet werden. Drei Verdünnungen sind nützlich, wenn die Überprüfung endgültigen Berechnungen gegeneinander. <ol><li> Zu jedem Satz von vier Flaschen, fügen 5mls unserer 0,65% Casein-Lösung. Lassen Sie sie in ein Wasserbad Gleichgewicht bei 37 ° C für ca. 5 Minuten. </li><li> Fügen unterschiedlicher Menge Enzymlösung, dass drei der Probe Fläschchen getestet werden, aber nicht die leer. Mix durch Schütteln und Inkubation für 37 ° C für genau 10 Minuten. Die Protease-Aktivität und Folgeschäden Befreiung von Tyrosin während dieser Inkubationszeit ist, was wird gemessen und verglichen werden zwischen Testproben. </li></ol></li><li> Nach diesem 10-minütigen Inkubation, fügen Sie die 5 ml des TCA-Reagenz in jedes Röhrchen, um die Reaktion zu stoppen. Dann fügen Sie ein geeignetes Volumen der Enzymlösung in jedes Röhrchen, auch die leeren, so dass die endgültige Volumen der Enzymlösung in jedes Röhrchen wird 1 ml. Dies ist für den Extinktionswert des Enzyms selbst Rechnung und um sicherzustellen, dass das Endvolumen in jeder Röhre gleich ist getan. Inkubieren Sie die Lösungen bei 37 ° C für 30 Minuten. Während dieser 30-minütigen Inkubation, können Sie zum Einrichten Ihres Tyrosin Standardverdünnungen. Verwende 6 dram Fläschchen (dram Fläschchen mit Polypropylen-Röhrchen ersetzt werden), die leicht zu halten kann 8 mls. Um die sechs Fläschchen, fügen Sie die 1,1 mM Tyrosin Standard-Stammlösungen mit folgenden Volumina in ml: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Fügen Sie keine Tyrosin-Standard auf den Rohling. Niedrigere Standards können für unreine Proben, die wenig Farbe ändern Ertrag benötigt werden. Sobald die Tyrosin-Standardlösung zugesetzt worden ist, fügen Sie ein geeignetes Volumen des gereinigten Wassers in jedem der Standards, um die Lautstärke zu 2 ml zu bringen. </li><li> Nach der Inkubationszeit von 30 Minuten, Filter jede der Testlösungen und der Rohling mit einem 0,45 um Polyethersulfon Spritzenfilter. Filtration ist erforderlich, um unlösliche Bestandteile aus den Proben zu entfernen. <ol><li> Fügen Sie die Filtration 2 ml der Test-und Blindproben Filtrat bis 4 dram Fläschchen, dass mindestens 8 mls halten kann. Die gleiche Art von Flasche, in der die Standards hergestellt wurden genutzt werden kann. </li><li> Um alle Flaschen mit den Normen und Standards blank, fügen 5mls von Natriumcarbonat. Für beste Ergebnisse 1 ml Folin-Reagenz unmittelbar danach. </li><li> Add Natriumcarbonat zu einer pH-Abfall durch die Zugabe des Folin-Reagenz geschaffen zu regulieren. </li><li> Add Natriumcarbonat zu den Proben und test leer. Diese Lösungen trüb nach der Zugabe von Natriumcarbonat. Fügen Sie die Folin-Reagenz, das vor allem reagiert mit freiem Tyrosin. </li><li> Mischen Sie die DRAM-Fläschchen durch Schütteln und Inkubation bei 37 ° C für 30 Minuten. </li></ol> Nach dieser Inkubation, sollten Sie feststellen, dass die Standards eine Abstufung der Farbe korreliert mit der Menge an Tyrosin hinzugefügt haben, die höchsten Konzentrationen von Tyrosin erscheinen dunkelsten. Sie können auch feststellen, nennenswerte Farbveränderung in unseren Proben. 2mls dieser Lösungen sind durch ein 0,45 um Polyethersulfon Spritzenfilter in geeignete Küvetten. Nun, da der Test durchgeführt wird, können Sie mit dem Spektralfotometer Sie diese in unserem Extinktionswerte aufzunehmen. </li></ol> Messung der Absorption und Berechnung Enzymaktivität <ol><li> Die Absorption der Proben wird durch ein Spektralphotometer mit einer Wellenlänge von 660nm gemessen. Der Lichtweg ist 1cm gesetzt. Notieren Sie sich die Extinktionswerte für die Standards, Standard-blank, die verschiedenen Proben und testen leer. Sobald alle Daten gesammelt wurden, kann die Standardkurve erstellt werden. Um die Kurve zu erzeugen, Extinktionsdifferenz zwischen der Standard-und Standard-Rohling berechnet werden muss. Dies ist der Extinktionswert auf die Menge an Tyrosin in der Standard-Lösungen. Nach dieser einfachen Rechnung, erstellen Sie die Standard-Kurve mit einem Grafik-Programm, um die Änderung der Absorption von unseren Standards auf der Y-Achse gegen die Menge in Mikromol für jedes unserer 5-Norm auf der X-Achse zeichnen. <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> Volume von Tyrosin Standard- </th><th style="text-align:center"> uMoles Tyrosin </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,05 </td><td style="text-align:center"> 0,055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,10 </td><td style="text-align:center"> 0,111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,20 </td><td style="text-align:center"> 0,221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,40 </td><td style="text-align:center"> 0,442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,50 </td><td style="text-align:center"> 0,553 </td></tr></tbody></table></li><li> Nachdem die Daten eingegeben sind, erzeugen eine Reihe von Best-Fit und entsprechende Neigung Gleichung. Finden Sie die Änderung der Absorption in den Proben durch Berechnung der Differenz zwischen der Probe Absorption und der Absorption der Test leer. Einsetzen der Extinktionswert für eine der Proben in den Hang Gleichung ein und lösen in der Mikromol Tyrosin befreiten während dieser besonderen proteolytischen Reaktion führen. Um die Aktivität des Enzyms in Einheiten pro / ml, führen Sie die folgende Berechnung: (Umole Tyrosinäquivalent freigegeben) x (11) Einheiten / ml Enzym = __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = Gesamtvolumen (in Milliliter)-Assay 10 = Time of Assay (in Minuten) nach der Einheit Definition 1 = Volumen der Enzyme (in Milliliter) des Enzyms verwendet 2 = Volumen (ml) in kolorimetrischen Bestimmung verwendet Nehmen Sie die Anzahl der Mikromol Tyrosin-Äquivalente freigesetzt aus der Steigung Gleichung erhalten und vermehren es durch das Gesamtvolumen des Assays in mls, was in unserem Fall ist 11mls. Teilen Sie diesen Wert durch drei weitere Mengen: die Zeit des Tests, die wir für 10 Minuten lief, das Volumen des Enzyms im Assay verwendet, die variiert wurde (wir verwenden 1ml), das Volumen der Milliliter in kolorimetrischen Nachweis verwendet, der eventuell unterscheiden auf der Grundlage Ihrer Küvette. Wir haben 2 mls. </li><li> Mikromol Tyrosin durch die Zeit in Minuten liefert die Messung der Protease-Aktivität als &quot;Einheiten&quot; unterteilt. Wir können heben die Einheiten für Volumen-Messung in den Zähler und Nenner, so dass ein Messen von Enzymaktivität in Einheiten / ml. Um die Aktivität in einem festen Protease Probe in Enzym-Verdünnungsmittel verdünnt bestimmen, teilen wir unsere Tätigkeit in Einheiten / ml durch die Konzentration der festen in diesem Test ursprünglich in mg / ml. Verwendet, so dass uns mit der Aktivität in Bezug auf die Einheiten / mg . Einheiten / ml Enzym Units / mg Feststoff = _____________________ mg Feststoff / ml Enzym </li></ol>

<ol><li>Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li>
<li>Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).</li>
</ol>

Wir haben gerade gezeigt, wie Sie Protease-Aktivität analysieren mit Hilfe von Sigma universelle Protease-Aktivität-Assay. Darüber hinaus ist dieser Test nützlich, um sicherzustellen, dass unsere Proteasen haben genau Aktivität bestimmt, bevor Sie sie erhalten für Ihre Experimente. Wie Sie gesehen haben, wenn Sie diese Prozedur, ist es von größter Wichtigkeit zu erinnern, um sowohl das Kasein und Tyrosin-Lösungen Wärme langsam und nicht zu kochen. Außerdem ist es wichtig, verschiedene Rohlinge für Ihre Ansprüche und für jede Probe, die Sie vorbereiten.

<table><tbody><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumphosphat, Trihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Trichloressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Phenolreagenz nach Folin &amp;amp; Ciocalteu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonat, wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat, Trihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Calciumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosin, freie Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Profiler-Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenznachweiskit für Proteasen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

sigma unspezifische protease activity assay - casein als substrat

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteasen bauen Peptidbindungen. Im Labor ist es oft notwendig, um zu messen und / oder vergleichen Sie die Aktivität von Proteasen. Sigma ist nicht-spezifische Protease-Aktivität Test kann als ein standardisiertes Verfahren eingesetzt werden, um die Aktivität der Proteasen, die das, was wir während unserer Qualitätskontrolle zu tun ist zu bestimmen. In diesem Test wirkt Casein als Substrat. Wenn die Protease testen wir Casein verdaut, ist die Aminosäure Tyrosin befreit zusammen mit anderen Aminosäuren-und Peptid-Fragmente. Folin und Ciocalteus Phenol oder Folin-Reagenz in erster Linie reagiert mit freiem Tyrosin zu einer blau gefärbten Chromophor, die quantifizierbar und gemessen als OD-Wert auf dem Spektralphotometer ist zu produzieren. Je mehr Tyrosin, die aus Kasein freigesetzt wird, desto mehr Chromophore erzeugt und desto stärker ist die Aktivität der Protease. Extinktionswerte durch die Aktivität der Protease erzeugt werden, um eine Standardkurve, die durch Umsetzung von bekannten Mengen von Tyrosin mit dem FC-Reagenz auf Veränderungen in der Absorption mit der Menge an Tyrosin in Mikromol korrelieren erzeugt wird verglichen. Von der Standardkurve der Aktivität der Protease Proben können in Bezug auf die Einheiten, die über den Betrag in Mikromol Tyrosin-Äquivalente aus Kasein pro Minute freigesetzt bestimmt werden. Um diesen Artikel in Chinesisch, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">klicken Sie hier</a>

Proteasen bauen Peptidbindungen. Im Labor ist es oft notwendig, um zu messen und / oder vergleichen Sie die Aktivität von Proteasen. Sigma ist nicht-spezifische Protease-Aktivität Test kann als ein standardisiertes Verfahren eingesetzt werden, um die Aktivität von Proteasen zu bestimmen.

Sigma Unspezifische Protease Activity Assay - Casein als Substrat

Proteasen spalten Peptidbindungen. Im Labor ist es häufig notwendig, die Aktivität von Proteasen zu messen und/oder zu vergleichen. Die unspezifische Protease von Sigma ...

Proteasen spalten Peptidbindungen im Labor. Es ist oft notwendig, die Aktivität von Proteasen von Sigma zu messen und/oder zu vergleichen. Der universelle Protease-Aktivitäts-Assay kann als standardisiertes Verfahren zur Bestimmung der Protease-Aktivität verwendet werden, was wir auch in unseren Qualitätskontrollverfahren tun.In diesem Assay fungiert Casian als Substrat, wenn die Protease, die wir testen, Casian spaltet. Das Aminosäuretyrosin wird zusammen mit anderen Aminosäuren und Peptidfragmenten freigesetzt. Freies Tyrosin reagiert anschließend mit Follin und Cylcals Phenol oder Follin-Reagenz, um einen blau gefärbten Chromophor zu bilden, der quantifizierbar ist und als Absorptionswert am Spektrophotometer gemessen wird.Je mehr Tyrosin aus Casian freigesetzt wird, desto mehr Chromophore entstehen und desto stärker ist die Aktivität der Protease. Die durch die Protease-Aktivität erzeugten Extinktionswerte werden mit einer Standardkurve verglichen, die durch die Umsetzung bekannter Tyrosinmengen mit dem FC-Reagenz erstellt wurde, um Änderungen der Extinktion zu korrelieren. Anhand der Tyrosinmenge in Mikromol aus der Standardkurve kann die Aktivität der Proteaseproben in Einheiten angegeben werden, wobei eine Einheit der Menge an Mikromol Tyrosinäquivalent entspricht, die pro Minute aus Cain freigesetzt wird. Hallo, mein Name ist Carrie Cup Vineyard und ich bin Wissenschaftlerin in unserer Sigma Aldridge DeKalb-Einrichtung hier in St. Louis, Missouri.Heute zeige ich Ihnen eine universell anwendbare Methode, um die Proteaseaktivität bei Sigma Aldridge zu testen. Wir verwenden diesen Assay hauptsächlich in unserem Qualitätskontrollbereich, um sicherzustellen, dass unsere Protease ausreichende Aktivität besitzt, bevor wir sie direkt an Ihr Labor versenden. Vor Beginn des Assays müssen wir sicherstellen, dass die folgenden Reagenzien korrekt zubereitet wurden.Ein 50 Millimolarer Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5. Die Lösung wird vor Gebrauch auf 37 Grad Celsius gebracht, sowie eine 0,65 Gewichtsprozentige Kasian-Lösung hergestellt, indem 6,5 Milligramm pro Milliliter in einem Liter gemischt werden. Die Lösungstemperatur wird unter sanftem Rühren allmählich auf 80 bis 85 Grad Celsius über etwa 10 Minuten erhöht, bis eine homogene Dispersion erreicht ist.Es ist sehr wichtig, die Lösung nicht zu kochen. Der pH-Wert wird anschließend bei Bedarf mit Natriumhydroxid und Salzsäure eingestellt. Eine 110 Millimolar-Trichloressigsäure-Lösung wird hergestellt, indem ein 6,1 normales Stammlösung im Verhältnis 1 zu 55 mit gereinigtem Wasser verdünnt wird, 0,5 Millimolar, gefälltes und versiegeltes Calts oder gefälltes Phenolreagenz, das ist die Lösung, die mit Tyrosin reagiert, um eine messbare Farbänderung zu erzeugen.Das steht in direktem Zusammenhang mit der Aktivität von Proteasen. Eine 500 Millimolar Natriumcarbonatlösung, hergestellt aus 53 Milligramm pro Milliliter wasserfreiem Natriumcarbonat in gereinigtem Wasser, sowie eine Enzymlöse, die aus 10 Millimolar Natriumacetatpuffer mit 5 Millimolar Calcium bei pH 7,5 bei 37 Grad Celsius besteht. Mit dieser Lösung lösen wir feste Proteasenproben oder verdünnen Enzymlösungen.Die Standard-Stammlösung von L-Tyrosin, die eine Anfangskonzentration von 1,1 Millimolar, also eine Lösung von 0,2 Milligramm pro Milliliter L-Tyrosin, aufweisen sollte, wird in gereinigtem Wasser hergestellt und vorsichtig erwärmt, bis das Tyrosin gelöst ist. Wie bei der Casian-Lösung darf diese Lösung nicht gekocht werden. Lassen Sie die L-Tyrosin-Standardlösung auf Raumtemperatur abkühlen.Diese Lösung wird gegebenenfalls weiter verdünnt, um unsere Standardkurve herzustellen, sowie eine feste Proteaseprobe mit vorbestimmter Aktivität, die mit Enzymverdünnungsmittel auf 0,1 bis 0,2 Einheiten pro Milliliter gelöst wird. Diese Lösung dient als positiver Kontrollwert für den Qualitätskontrolltest und zur Validierung der Berechnungen, die wir zur Bestimmung der Enzymaktivität durchführen werden. Nachdem wir unsere Reagenzien vorbereitet und auf die korrekte Temperatur gebracht haben, beginnen wir nun mit unserem Proteasetest.Um diesen Assay zu beginnen, besorgen Sie geeignete Gefäße, die etwa 15 Milliliter fassen. Für jedes Enzym, das Sie testen werden, benötigen Sie vier Gefäße. Ein Gefäß dient als Blindprobe, die drei anderen werden zur Bestimmung der Aktivität von drei Proben verwendet.Die Verdünnung der Protease in drei Verdünnungsstufen ist nützlich, wenn unsere Endberechnungen gegeneinander überprüft werden, um jedem Satz von vier Vials fünf Milliliter unserer 0,65 %igen Kasian-Lösung zuzusetzen und sie etwa fünf Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius equilibrieren zu lassen. Danach werden unterschiedliche Konzentrationen unserer Enzymlösung zu drei der Testprobe-Vials, jedoch nicht zum Blindansatz, hinzugefügt. Diese werden durch Schwenken gemischt und genau 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.Die Proteaseaktivität und die daraus resultierende Freisetzung von Tyrosin während dieser Inkubationszeit werden zwischen unseren Testproben gemessen und verglichen. Nach dieser 10-minütigen Inkubation fügen Sie fünf Milliliter der TCA-Reagenzlösung zu jedem Reaktionsgefäß hinzu. Anschließend wird eine geeignete Menge der Enzymlösung zu jedem Gefäß, auch zum Blindansatz, zugegeben, sodass das Endvolumen der Enzymlösung in jedem Gefäß ein Milliliter beträgt.Dies geschieht, um den Absorptionswert des Enzyms selbst zu berücksichtigen. Inkubieren Sie nun die Lösungen 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Während dieser 30-minütigen Inkubation können Sie Ihre Tyrosin-Standardverdünnungen vorbereiten, die unter Verwendung von sechs DR-Gefäßen durchgeführt wird.Dieser kann problemlos acht Milliliter auf sechs Vials verteilen. Die 1,1-Millimolar-Tyrosin-Standardsalzlösung wird in den folgenden Volumina in Milliliter hinzugefügt: 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 und 0,5. Zum Blindansatz wird kein Tyrosin-Standard hinzugefügt.Für IPU-Testproben, die nur eine geringe Farbänderung zeigen, können niedrigere Standards erforderlich sein. Nachdem die Tyrosin-Standardlösung hinzugefügt wurde, eine geeignete Menge gereinigtes Wasser zu jedem der Standards hinzufügen, um das Volumen auf zwei Milliliter aufzufüllen. Nach der Inkubation jede der Testlösungen sowie die Blindprobe filtrieren.Unter Verwendung eines 0,45-Mikrometer-Spritzenfilters werden anschließend zwei Milliliter der Testproben und des blanken Filtrats in vier DR-Gefäße gegeben, die mindestens acht Milliliter fassen können. Sie können denselben Gefäßtyp verwenden, in dem die Standards hergestellt wurden. In alle Gefäße mit den Standards und dem Standard-Blanko werden fünf Milliliter Natriumcarbonat gegeben. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, wird das abgesetzte Reagenz unmittelbar danach hinzugefügt. Anschließend wird Natriumcarbonat zu den Testproben und dem Test-Blanko gegeben. Sie werden bemerken, dass diese Lösungen nach der Zugabe von Natriumcarbonat trüb werden.Danach wird das abgesetzte Reagenz hinzugefügt, das mit freiem Tyrosin reagiert. Die DRAM-Probenfläschchen werden anschließend durch Schwenken gemischt und nach dieser Inkubation 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Sie sollten bemerken, dass die Standards eine Farbabstufung aufweisen, die mit der Menge des zugesetzten Tyrosins korreliert, wobei die höchsten Tyrosinkonzentrationen am dunkelsten erscheinen.Sie können auch eine deutliche Farbänderung in unseren Testproben bemerken. Zwei Milliliter dieser Lösungen werden mit einem 0,45-Mikron-Spritzenfilter und geeigneten Küvetten filtriert. Nachdem wir unseren Assay abgeschlossen haben, begeben wir uns nun zum Spektrophotometer und nehmen unsere Extinktionswerte auf.Die Absorption unserer Proben wird mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 660 Nanometern gemessen. Der Lichtweg wird auf einen Zentimeter eingestellt, und die Absorptionswerte für den Standard, die Standardblindprobe, die verschiedenen Testproben und die Testblindprobe werden aufgezeichnet. Sobald alle Daten gesammelt wurden, können wir unsere Eichkurve erstellen.Um die Kurve zu erstellen, muss die Differenz der Extinktion zwischen dem Standard und dem Standard-Blanko berechnet werden. Dieser Extinktionswert entspricht der Menge an Tyrosin in den Standardlösungen. Nach dieser einfachen Berechnung erstellen wir unsere Eichkurve, indem wir die Extinktionsänderung unserer Standards auf der Y-Achse gegen die jeweilige Menge in Mikromol für jeden unserer fünf Standards auf der X-Achse auftragen.Nachdem wir unsere Datenpunkte eingegeben und eine Ausgleichsgerade erstellt haben, ermitteln wir die Änderung der Absorption in unseren Testproben, indem wir die Differenz zwischen der Absorption unserer Testprobe und der Absorption unseres Test-Blanks berechnen. Anhand unserer Standardkurve identifizieren wir den Absorptionswert einer unserer Testproben auf der Y-Achse. Nun zeichnen wir eine Linie parallel zur X-Achse und halten an dem Punkt an, an dem wir auf unsere Standardkurve treffen.Dann ergibt sich aus der X-Koordinate, die an diesem Punkt abgelesen wird, die Menge an freigesetztem Tyrosin in Mikromol während dieser spezifischen proteolytischen Reaktion. Um die Enzymaktivität in Einheiten pro Milliliter zu ermitteln, führen Sie die folgende Berechnung durch: Nehmen Sie die Anzahl der freigesetzten Tyrosin-Äquivalente in Mikromol, ermittelt aus der Standardkurve, und multiplizieren Sie diesen Wert mit dem Gesamtvolumen des Assays in Millilitern, das in unserem Fall 11 Milliliter beträgt. Anschließend teilen Sie diesen Wert durch drei weitere Größen.Die Dauer des Assays, der zehn Minuten lang durchgeführt wurde, das Volumen des im Assay verwendeten Enzyms, das variiert wurde. Verwenden wir ein Milliliter. Das Volumen an Millilitern, das bei der chlorimetrischen Detektion verwendet wurde, das je nach Ihrem Q vet variieren kann.Wir verwenden zwei Milliliter. Mikromol Tyrosin geteilt durch die Zeit in Minuten ergibt unsere Messgröße der Proteaseaktivität, die wir als Einheiten bezeichnen. Wir können die Volumeneinheiten im Zähler und Nenner gegeneinander kürzen und erhalten somit eine Messgröße der Enzymaktivität in Einheiten pro Milliliter.Um die Aktivität einer festen Proteaseprobe, die in Enzympuffer verdünnt wurde, zu bestimmen, dividieren wir die Aktivität in Einheiten pro Milliliter durch die Konzentration des festen Stoffes, die ursprünglich in Milligramm pro Milliliter in diesem Assay verwendet wurde, sodass wir die Aktivität in Einheiten pro Milligramm erhalten. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man die Proteaseaktivität mithilfe des universellen Proteaseaktivitätsassays von Sigma analysiert. Wie Sie beim Durchführen dieses Verfahrens gesehen haben, ist es entscheidend, daran zu denken, sowohl die Casin- als auch die Tyrosinlösung langsam zu erhitzen und sie nicht zum Kochen zu bringen.Außerdem ist es wichtig, unterschiedliche Blindproben sowohl für Ihre Standards als auch für jede Testprobe vorzubereiten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Proteaseaktivitäten.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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