In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

Xip-Labus-Ei-Extrakte sind nützlich als zytoplasmatisches und Organellen-Material für die in-vitro-Rekonstitution zellulärer Vorgänge wie der Kernassemblierung und des nukleären Proteinimports. Wenn Spermatozoen-Chromatin-DNA entweder rohen oder fraktionierten XUS-Ei-Extrakten hinzugefügt wird, binden sich in dem Extrakt vorhandene Membranvesikel an die Oberfläche des Chromatins, fusionieren und integrieren nukleäre Pore-Komponenten, um voll funktionsfähige synthetische Kerne zu bilden. Die Charakterisierung der molekularen Grundlagen dieser Prozesse ist anschließend durch immunologische Depletion der Extrakte und durch Proteinmodifikation möglich.

Hallo, mein Name ist Marie Cross und ich bin Doktorandin im Labor von Dr. Maureen Power am Fachbereich Zellbiologie der Emory University in Atlanta, Georgia. Heute zeigen wir Ihnen, wie man Kerne in vitro unter Verwendung fraktionierter Xenopus-Ei-Extrakte herstellt. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Durchführung der Kernassemblierungsreaktion und Beurteilung der Kernbildung.

Beginnen wir nun. Um die Kernassemblierung zu starten, entnehmen Sie eine Aliquot aus fraktioniertem Zytosol und geben Phosphokreatin aus einer 0,2-molaren Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 20 Millimolar zu erreichen. Anschließend geben Sie Kreatinkinase aus einer Stammlösung mit fünf Milligramm pro Milliliter hinzu, um eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen.

Fügen Sie abschließend 20 µM ATP unter Verwendung einer 0,2-molaren Stammlösung hinzu. Danach geben Sie die Lichtmembranen im Verhältnis 1 zu 10 zur Cytosollösung hinzu. Dies entspricht ungefähr der Menge an Membranen, die im ursprünglichen Rohextrakt vorhanden war.

Mischen Sie alle Komponenten durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren, um die Membranen im Extrakt zu verteilen. Dies muss vor dem Hinzufügen der Spermatozoenchromatin erfolgen. Geben Sie anschließend das Spermatozoenchromatin in die fraktionierte Extraktlösung in der gewünschten Konzentration hinzu und mischen Sie den Extrakt und das Spermatozoenchromatin unverzüglich vorsichtig durch leichtes Auf- und Abpipettieren mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze.

Wenn die Spermatozoenchromatin zum Extrakt hinzugegeben wird, beginnt es sofort, sich zu dekondensieren, zu kondensieren und für Scherkräfte empfindlich zu werden. Im Allgemeinen werden diese Reaktionen in 500-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen mit einem Gesamtvolumen von weniger als hundert Mikrolitern durchgeführt. Die Eizellextrakte ermöglichen die Bildung von bis zu 8.000 bis 9.000.

Incubieren Sie die Mischung für eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur, um die Bildung der Kerne pro Mikroliter zu ermöglichen. Die Kerne werden mithilfe einer Färbung sichtbar gemacht. Nach etwa 30 Minuten sind die neu gebildeten Kerne klein und oval geformt.

Die DNA ist weiterhin stark kondensiert, und der Zellkern sollte im UV-Kanal, während der Hakenrotation beobachtet, aufgrund der DNA-Kondensation ein durchgehend helles Blau erscheinen. Außerdem wird die blaue Färbung weniger homogen sein, wobei schließlich schwarze Lücken sichtbar werden. Die Bildung der Kernmembran kann visualisiert werden, indem man dem Fixansatz ein Mikrogramm pro Männchen des Farbstoffs Diamid oder DHCC hinzufügt.

DHCC ist ein fluoreszierender lipophiler Farbstoff, der im Fluorescein-Kanal sichtbar gemacht wird. In den frühen Stadien der Kernassemblierung binden Membranvesikel an der Chromatinoberfläche und beginnen, sich zu Flecken zu verschmelzen. Dies führt zu einem ungleichmäßigen und diskontinuierlichen Erscheinungsbild der sich bildenden Membran.

Einmal vollständig gebildet, glättet sich die Membran über der nuklearen Oberfläche und erscheint als gleichmäßiger, durchgehender Rand um die DNA herum. Es wird eine beträchtliche Hintergrundfluoreszenz im umgebenden Cytosol sichtbar sein, verursacht durch Membranvesikel, die noch nicht in die Kerne eingebaut wurden. Soeben haben wir Ihnen die in-vitro-Rekonstitution von Kernen anhand löslicher und leichter Membranfraktionen aus Xenopus-Ei-Extrakt gezeigt.

Es ist wichtig zu beachten, dass ein roher Extrakt für die Kernassemblierung verwendet werden kann, jedoch nicht nach Einfrieren und Auftauen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.