Name: In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-02T13:52:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: Lernen Sie die In-vitro-Nukleus-Rekonstitution mit fraktionierten Xenopus-Ei-Extrakten und Spermienchromatin. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Mechanismen der Kernmembranbildung in der Zellbiologie.

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Der vollständige Text Protokoll für diesen experimentellen Ansatz ist in <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb1110/current/abstract ">Current Protocols in Zellbiologie</a> .

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

in vitro nuclear assembly mit fraktionierte xenopus egg auszüge

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Kernmembran Montage ist ein wesentlicher Schritt in der Zellzyklus; dieser Prozess im Reagenzglas durch die Kombination von Xenopus Spermien Chromatin, Cytosol und Licht Membranfraktionen repliziert werden. Komplette Kerne gebildet werden, einschließlich der nuklearen Membranen mit Poren-Komplexe, und diese rekonstituierte Kerne sind in der Lage normale Kernprozesse.

In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

Die Assemblierung der Kernmembran ist ein essenzieller Schritt im Zellteilungszyklus; dieser Prozess kann im Reagenzglas repliziert werden, indem Xenopus-Spermien ...

Xip-Labus-Ei-Extrakte sind nützlich als zytoplasmatisches und Organellen-Material für die in-vitro-Rekonstitution zellulärer Vorgänge wie der Kernassemblierung und des nukleären Proteinimports. Wenn Spermatozoen-Chromatin-DNA entweder rohen oder fraktionierten XUS-Ei-Extrakten hinzugefügt wird, binden sich in dem Extrakt vorhandene Membranvesikel an die Oberfläche des Chromatins, fusionieren und integrieren nukleäre Pore-Komponenten, um voll funktionsfähige synthetische Kerne zu bilden. Die Charakterisierung der molekularen Grundlagen dieser Prozesse ist anschließend durch immunologische Depletion der Extrakte und durch Proteinmodifikation möglich.Hallo, mein Name ist Marie Cross und ich bin Doktorandin im Labor von Dr. Maureen Power am Fachbereich Zellbiologie der Emory University in Atlanta, Georgia. Heute zeigen wir Ihnen, wie man Kerne in vitro unter Verwendung fraktionierter Xenopus-Ei-Extrakte herstellt. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Durchführung der Kernassemblierungsreaktion und Beurteilung der Kernbildung.Beginnen wir nun. Um die Kernassemblierung zu starten, entnehmen Sie eine Aliquot aus fraktioniertem Zytosol und geben Phosphokreatin aus einer 0,2-molaren Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 20 Millimolar zu erreichen. Anschließend geben Sie Kreatinkinase aus einer Stammlösung mit fünf Milligramm pro Milliliter hinzu, um eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen.Fügen Sie abschließend 20 µM ATP unter Verwendung einer 0,2-molaren Stammlösung hinzu. Danach geben Sie die Lichtmembranen im Verhältnis 1 zu 10 zur Cytosollösung hinzu. Dies entspricht ungefähr der Menge an Membranen, die im ursprünglichen Rohextrakt vorhanden war.Mischen Sie alle Komponenten durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren, um die Membranen im Extrakt zu verteilen. Dies muss vor dem Hinzufügen der Spermatozoenchromatin erfolgen. Geben Sie anschließend das Spermatozoenchromatin in die fraktionierte Extraktlösung in der gewünschten Konzentration hinzu und mischen Sie den Extrakt und das Spermatozoenchromatin unverzüglich vorsichtig durch leichtes Auf- und Abpipettieren mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze. Wenn die Spermatozoenchromatin zum Extrakt hinzugegeben wird, beginnt es sofort, sich zu dekondensieren, zu kondensieren und für Scherkräfte empfindlich zu werden. Im Allgemeinen werden diese Reaktionen in 500-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen mit einem Gesamtvolumen von weniger als hundert Mikrolitern durchgeführt. Die Eizellextrakte ermöglichen die Bildung von bis zu 8.000 bis 9.000.Incubieren Sie die Mischung für eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur, um die Bildung der Kerne pro Mikroliter zu ermöglichen. Die Kerne werden mithilfe einer Färbung sichtbar gemacht. Nach etwa 30 Minuten sind die neu gebildeten Kerne klein und oval geformt.Die DNA ist weiterhin stark kondensiert, und der Zellkern sollte im UV-Kanal, während der Hakenrotation beobachtet, aufgrund der DNA-Kondensation ein durchgehend helles Blau erscheinen. Außerdem wird die blaue Färbung weniger homogen sein, wobei schließlich schwarze Lücken sichtbar werden. Die Bildung der Kernmembran kann visualisiert werden, indem man dem Fixansatz ein Mikrogramm pro Männchen des Farbstoffs Diamid oder DHCC hinzufügt.DHCC ist ein fluoreszierender lipophiler Farbstoff, der im Fluorescein-Kanal sichtbar gemacht wird. In den frühen Stadien der Kernassemblierung binden Membranvesikel an der Chromatinoberfläche und beginnen, sich zu Flecken zu verschmelzen. Dies führt zu einem ungleichmäßigen und diskontinuierlichen Erscheinungsbild der sich bildenden Membran.Einmal vollständig gebildet, glättet sich die Membran über der nuklearen Oberfläche und erscheint als gleichmäßiger, durchgehender Rand um die DNA herum. Es wird eine beträchtliche Hintergrundfluoreszenz im umgebenden Cytosol sichtbar sein, verursacht durch Membranvesikel, die noch nicht in die Kerne eingebaut wurden. Soeben haben wir Ihnen die in-vitro-Rekonstitution von Kernen anhand löslicher und leichter Membranfraktionen aus Xenopus-Ei-Extrakt gezeigt.Es ist wichtig zu beachten, dass ein roher Extrakt für die Kernassemblierung verwendet werden kann, jedoch nicht nach Einfrieren und Auftauen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biology

Biologie

Crude und fraktionierte Xenopus Ei Extrakte können verwendet werden, um Zutaten für die Wiedererrichtung zelluläre Prozesse für die morphologische und biochemische Analyse zu liefern. Egg Lyse und differentielle Zentrifugation werden verwendet, um den Rohextrakt, die wiederum in zur fraktionierten Extrakte und Licht Membranpräparationen vorbereiten.

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Dieses Video-Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung...

Herstellung transgener Xenopus laevis Durch Restriktionsenzym-vermittelte Integration und Reaktorsicherheit Transplantation

Produktion von<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

Es wird ein Verfahren zur Analyse von Protein-Abbau unter Verwendung radioaktiv markiert und die Luciferase-Fusionsproteine ​​in Xenopus-Ei-Extrakt und deren Anpassung für Hochdurchsatz-Screening für Kleinmolekül-Modulatoren der Proteinabbaus beschrieben.

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Wir beschreiben Methoden zur Manipulation unreifer Eizellen von Xenopus laevis, zur In-vitro-Reifung von Eizellen zu Eizellen und zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion. Dieses Protokoll ermöglicht den Abbau einiger mütterlicher Proteine und die Überexpression von Genen von Interesse während der Befruchtung und ist daher wertvoll, um die Rolle spezifischer Faktoren in der frühen Embryonalentwicklung zu untersuchen.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Die molekularen Mechanismen der Dekondensation von hochverdichtetem mitotischem Chromatin sind unklar. Wir präsentieren einen zellfreien Assay, der auf mitotischen Chromatinclustern basiert, die aus HeLa-Zellen und Xenopus laevis-Eiextrakt isoliert wurden und den Dekondensationsprozess in vitro originalgetreu rekonstituieren.

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose

Wir beschreiben ein Xenopus-Eizell- und Tierkappensystem für die Expressionsklonierung von Genen, die in der Lage sind, eine Reaktion in kompetentem Ektoderm zu induzieren, und diskutieren Techniken für die anschließende Analyse solcher Gene. Dieses System ist nützlich bei der funktionellen Identifizierung einer Vielzahl von Genprodukten.

Functional Cloning Mit ein<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizellen Expression System

Mechanismen der zellulären und intrazellulären Skalierung bleiben schwer fassbar. Die Verwendung von Xenopus-Embryoextrakten wird immer häufiger, um die Mechanismen der Organellengrößenregulation aufzuklären. Diese Methode beschreibt die Herstellung von Embryonenextrakten und einen neuartigen Kernskalierungsassay, durch den Mechanismen der Kerngrößenregulation identifiziert werden können.

Ein zellfreien Assay unter Verwendung von<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extrahiert Mechanismen der Kerngröße Verordnung zum Studium

Wir präsentieren eine Methode zur Erzeugung von in-vitro- autarken mitotischen Schwingungen auf der Ebene der einzelnen Zelle durch Verkapselung Ei Extrakte von Xenopus Laevis in Wasser-in-Öl-Mikroemulsionen.

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung und Live-Bildgebung von unverdünnten zytoplasmatischen Extrakten aus Xenopus laevis-Eiern .

Xenopus laevis Ei-Extrakt-Zubereitung und Live-Bildgebungsverfahren zur Visualisierung der dynamischen zytoplasmatischen Organisation

Lernen Sie die In-vitro-Nukleus-Rekonstitution mit fraktionierten Xenopus-Ei-Extrakten und Spermienchromatin. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Mechanismen der Kernmembranbildung in der Zellbiologie.

In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

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