Mit Laser-Pinzette zur Manipulation isolierter Neuronen In Vitro

Ashkin war der Erste, der zeigte, dass Lasertweezers oder optische Fallen ein leistungsfähiges Werkzeug zur Manipulation mikroskopisch kleiner lebender Objekte sind. In diesem Video zeigen wir, wie wir diese Technologie zum Einfangen und Bewegen von Neuronen angewendet haben. Dies ist die Arbeitsstation für optische Fallen.

Die grünen Pfeile zeigen den Weg des Laserstrahls durch die Optik des Mikroskops. Wenn ein vom Objektiv des Mikroskops fokussierter Laserstrahl von einer Zelle gebrochen wird, wirkt die Kraft, die die Richtung des Lichtstrahls verändert, auf die Zelle und bewegt sie in Richtung des Fokussierungszentrums.

Dies erzeugt Pikonewton an Kraft, die ausreichen, um eine Zelle durch das Medium zu ziehen. In diesem Video werden wir über die Herstellung von Petrischalen, die Vorbereitung von Netzhautzellen, das Aufbringen von Zellen auf Kulturschalen, die Manipulation mit optischem Pinzette sowie die Beobachtung des Zellwachstums sprechen. Da Zellen an Glas haften, mussten wir einen zellenabstoßenden Bereich schaffen, in dem Zellen leicht mit der Pinzette eingefangen werden können.

Die eine Hälfte der Petrischale war mit Poly-Hema, einem zellenabstoßenden Polymer, beschichtet. Die andere Hälfte war mit CellOne, einem Substrat, das das Wachstum unserer Zellen unterstützt, beschichtet. Zunächst wird eine Zelle auf der zelladhäsiven Seite der Schale identifiziert.

Anschließend wird eine weitere Zelle auf der Polymerschicht erfasst und auf die adhesive Seite transportiert, wo beide Zellen gepaart werden. Zum Vorbereiten der Schalen verwenden wir blasgereinigte sterilisierte Polystar-Kulturschalen mit 35 Millimeter Durchmesser. Zunächst schneiden wir mit einer kleinen Drehbank oder einer Standbohrmaschine ein ein Zentimeter großes Loch in den Boden.

Nehmen Sie säuregereinigte Deckgläser und stellen Sie sie aufrecht in einer staubfreien Umgebung, beispielsweise in einem Abzug, ab. Nehmen Sie die in 95 % Alkohol gelöste Polyus-Lösung und geben Sie einige Tropfen nahe dem oberen Rand des Deckglases nur auf eine Hälfte. Lassen Sie das Poly-HEMA trocknen. Kennzeichnen Sie die Seite des Deckglases mit der Polyus-Beschichtung.

Platzieren Sie die S-Abdeckung um das Loch im Boden der Kulturschale herum. Kleben Sie das Deckglas mit der S-Abdeckung an die Schale. Achten Sie darauf, dass das Polyamid innen liegt, und stellen Sie sicher, dass keine Leckagen durch Spalten in der S-Abdeckung treten.

Platzieren Sie das Deckglas so, dass die Kante der Poly-Hema-Beschichtung in der Mitte der Schale verläuft. Lassen Sie die Schale zwei bis drei Tage trocknen und ritzen Sie danach mit einem Diamantschreiber Markierungen an den Boden der Schale, die als Referenzpunkte zur Positionierung der Schale auf dem Mikroskopständer dienen werden. Stellen Sie die Schalen in die Sterilwerkbank und sterilisieren Sie sie unter UV-Licht.

Geben Sie ein oder zwei Tropfen der Ziegen-Anti-US-Antikörperlösung auf die Seite der Petrischale, die nicht den Polypus enthält, und achten Sie darauf, dass die Lösung nicht auf die polyhämische Beschichtung gelangt. Lassen Sie die Lösung etwa drei Stunden einwirken. Entfernen Sie sie anschließend und waschen Sie mit steriler Ringer-Lösung. Geben Sie dann die Zell-1-Antikörperlösung auf denselben Bereich und inkubieren Sie über Nacht, um die Probe am nächsten Tag für das Experiment vorzubereiten.

Die Zellen in unserem Labor stammen von Netzhäuten erwachsener salamander im aquatischen Stadium. Die Netzhäute werden präpariert und entfernt, mit Enzymen verdaut und anschließend in einer Kulturschale ausgesät. Die kultivierte Schale kann dann mit isolierten Zellen beimpft werden.

Die Augen werden entfernt. Die Hornhaut wird präpariert und entfernt. Die Augenschale wird in sterile Ringer-Lösung gegeben.

Die Netzhaut wird mithilfe der Kante einer gebogenen Pinzette aus der Augenschale herausgeschabt. Kohlendioxid und Sauerstoff werden in eine Ringer-Lösung, die Propan enthält, eingeleitet und anschließend durch einen ultradünnen 0,2-Mikron-Filter sterilisiert. Die Netzhäute werden in die Enzymlösung gegeben und unter Rühren etwa 40 Minuten lang verdaut, um das Gewebe aufzulösen.

Nach dreimaligem Waschen werden die Netzhäute durch Tri dissociiert. Mit einer Pipette mit drei Millimeter Kugeldurchmesser sind die isolierten Zellen vor dem Aufbringen bereit zum Platten. Die Kulturschale, die das Medium enthält, wird auf den Mikroskopständer gestellt und mithilfe der Kratzmarkierungen auf der Unterseite der Schale entsprechend ausgerichtet.

Dadurch kann die genaue Position der Schale zu einem späteren Zeitpunkt exakt reproduziert werden. Die Zellen werden dann sowohl auf der Poly-hema- als auch auf der Cell-one-Seite der Schale ausplattiert. Die Position der Schale auf dem Mikroskopstadium sowie die Laserleistung werden über den Joystick gesteuert.

Zunächst identifizierten wir eine Zelle, die an einer Seite der Schale haftet. Dabei handelt es sich um eine multipolare Netzhautzelle, erkennbar an ihren Dendriten. Die Koordinaten der Position der Zelle werden gespeichert.

Dies ist eine Stäbchenphotorezeptorzelle auf der polyus-abstoßenden Seite der Petrischale. Die Schale wird abgesenkt, und die Zelle wird durch den Laser erfasst und von dem Boden der Schale angehoben. Die Zelle wird nun zur anderen Seite der Schale an die Koordinaten der multipolaren Zelle transportiert.

In Wirklichkeit ist die Zelle stationär. Es ist die Schale, die sich bewegt. Die Zelle bewegt sich nun über die Kante der Poly-Häm-Beschichtung hinweg.

Der Fortsatz, der sich von der Zelle erstreckt, ist das Axonende. Die Zelle befindet sich deutlich entfernt von jeglichem Zelltrümmern und anderen Zellen am Boden der Petrischale, die ihre Bewegung behindern könnten. Im Hintergrund sind die Defokus-Bilder von Zellen am Boden der Petrischale sichtbar.

Die Stäbchenzelle gelangt zur mehrpoligen Zelle und kann präzise an dem gewünschten Punkt und in dem gewünschten Abstand zu dieser Zelle positioniert werden. Die Petrischale wird angehoben, und die Zelle haftet an dem Zellsubstrat. Die wesentlichen Vorteile dieses Verfahrens bestehen darin, dass man auswählen kann, welche Zellen bewegt werden sollen, und dass die Manipulationen in einem geschlossenen, sterilen Experiment durchgeführt werden können.

Zell-Zell-Interaktionen können mittels zeitraffender Videotechnik oder digitaler Fotografie überwacht werden. Laser-Tweezers können mit jeder biologischen Methode kombiniert werden. Hier beispielsweise zeigt eine Fluoreszenzmethode das Vorhandensein synaptischer Proteine an den Kontaktstellen zwischen Zellen an, die mit den Tweezers bewegt wurden.