Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Hallo, ich untersuche die Koordination verschiedener Lipidsynthesewege im Zusammenhang mit Gedächtnis und Biogenese. Es ist hilfreich, ein experimentelles System zu haben, in dem Membranbiogenese schnell und induzierbar abläuft. Wir fanden heraus, dass die Phagozytose von Latexkügelchen für solche Studien besonders nützlich ist, da die Zellen sehr schnell neue Membranen synthetisieren, um die zu ersetzen, die während des Einkapselungsprozesses frühzeitig als Hüllmaterial verloren gehen.

In diesem Video wird mein Kollege Ong Zang die Verfahren demonstrieren, die verwendet wurden, um phagozytoseinduzierte Veränderungen in der Genexpression mithilfe eines auf Luciferase basierenden Reportergen-Assay-Ansatzes zu untersuchen, wobei, Hallo, ich bin X vom Leverage of Exon North in der Abteilung für molekulare und zelluläre Biologie an der Harvard University. Heute zeige ich Ihnen, wie man ein Reportergen-Assay verwendet, um die Regulation von Genen zu analysieren, die an der Membranbiogenese nach Phagozytose beteiligt sind. Beginnen wir also.

Für dieses Verfahren verwenden wir Kulturen von menschlichen embryonalen Nieren-293-Zellen. Diese Zellen werden in einer 10 cm Kulturschale in Medium A kultiviert, das aus dem modifizierten Eagle-Medium (DMEM) besteht, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und einer Antibiotikacocktail-Lösung. Mithilfe einer Standardisierungstechnik werden die Zellen vom Boden der Schale gelöst, gezählt und anschließend auf mit Polylysin beschichteten 96-Well-Platten ausgesät, wo sie 24 Stunden lang wachsen, bis die Transfektion beginnt.

Für unsere Transfektion führen wir routinemäßig alle Bedingungen im Dreifachen durch und verwenden insgesamt 50 bis 100 Nanogramm Plasmid-DNA pro Vertiefung. Die Plasmidmischungen sollten mindestens den Reporterkonstrukt, der Firefly-Luciferase exprimiert, sowie das Kontrollplasmid, das Renilla-Luciferase unter einem konstitutiven Promotor exprimiert, enthalten. Bereiten Sie zunächst eine Mischung aus serumfreiem und antibiotikafreiem DMEM mit dem Transfecting-Reagenz Trans 293 vor. Verwenden Sie 10 Mikroliter DMEM für jede zu transfizierende Vertiefung und 3 Mikroliter Trans 293-Reagenz pro Mikrogramm Plasmid-DNA.

Beispielsweise, wenn jeweils 20 Vertiefungen mit 50 Nanogramm DNA bei drei Mikroliter Trans 2 9 3 Reagenz auf 200 Mikroliter DM EM transfiziert werden sollen. Die Lösung wird durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren gemischt und anschließend mindestens fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ungestört stehengelassen. Als Nächstes wird die DNA in separate Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert. Die Konzentrationen unserer Plasmid-Stammlösungen liegen gewöhnlich zwischen 10 und 100 Nanogramm pro Mikroliter.

Nachdem das DM M-Transit-Gemisch fünf Minuten lang inkubiert wurde, wird es in das DNA-Röhrchen überführt und die Lösung erneut per Pipette gemischt. Anschließend werden die Proben 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Während der 20-minütigen Inkubation wird das Medium aus der 96-Well-Kulturplatte entfernt und durch 19 Mikroliter frisches Medium A ersetzt. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, werden 10 Mikroliter der D-M-M-D-N-A-Übersetzungs-mischung in jedes der Wells gegeben.

Die Mischung sollte direkt in die vorhandene Flüssigkeit pipettiert werden. Lassen Sie die Pipettenspitze nicht die Wand des Röhrchens berühren. Es ist außerdem wichtig, drei Vertiefungen mit Zellen einzuschließen, die unbehandelt belassen und nicht untersucht werden.

Die durchschnittliche Luciferase-Aktivität in diesen Wells wird später als Hintergrund abgezogen; stellen Sie die 96-Well-Platte in den 37 °C-Inkubator und kultivieren Sie die Zellen 24 Stunden lang. Sobald die 24-stündige Inkubation abgeschlossen ist, fahren wir mit der Induktion der Membranbiosynthese, der Biosynthese der Lax-Perlen, fort. Bereiten Sie zunächst eine Suspension aus Zellkulturmedium und Lax-Perle vor.

Bereiten Sie hierzu Medium B vor, das aus einer 1:1-Mischung aus DMEM und Ham’s F10-Medium plus Antibiotika und 10 % FBS besteht. Geben Sie anschließend die 0,75 µm großen Latexkügelchen in Konzentrationen von bis zu einem Milligramm pro Milliliter hinzu. Natürlich sollte jedes Experiment Kontrollen umfassen, bei denen keine Kügelchen hinzugefügt werden.

Als Nächstes entfernen Sie das Medium aus der 96-Well-Kulturplatte und ersetzen jedes Loch durch 100 Mikroliter der Perlsuspension. Nachdem die Suspension hinzugefügt wurde, zentrifugieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei 1000 ×g. Dies hilft, die Perlen am Boden des Wells zu konzentrieren und erleichtert die Phagozytose. Danach inkubieren Sie die Zellen 6 bis 16 Stunden bei 37 Grad C.

Abhängig von den Bedingungen und dem verwendeten Promotor kann die Promotor-Genexpression nach ein bis drei Stunden detektiert werden, die die Luciferase-Aktivität erhöhen. Für bestimmte Experimente kann es notwendig sein, fal von der Lipidsynthese zu entkoppeln, beispielsweise um die Wirkung bestimmter Medikamente auf die Lipidsynthese zu untersuchen, ohne die Partikelbildung zu beeinflussen. In solchen Fällen inkubieren Sie die Zellen mit dem Beat für 30 bis 16 Minuten, um den Zellen Zeit zu geben, die Perlen aufzunehmen.

Nach dieser Inkubation werden die Zellen zwei Mal mit PBS gewaschen, um nicht eingebaute Kügelchen zu entfernen. Anschließend wird frisches Medium zugegeben, und die Zellen werden sechs bis 16 Stunden zur Expression des Reportergens inkubiert. Nun sind wir bereit, mit den Ferrous-Assays fortzufahren.

Um die Lucifer-Assays zu beginnen, bereiten Sie einen xis-Puffer vor, der 20 Millionen molare Bäume, HCl pH 7,8, 10 % (Volumen/Volumen) Glycerin und 0,5 % (Volumen/Volumen) Triton X-100 enthält. Stellen Sie vor der Verwendung die für das Experiment benötigte Menge her. Fügen Sie anschließend einen Mikroliter pro Milliliter eines einmolaren DTT hinzu. Verwenden Sie die restliche DTT-Lösung nicht erneut.

Als Nächstes ein Proteaseinhibitorcocktail auf eine Endkonzentration von 0,5 bis einemfach hinzufügen, wenn das Dual-Glow-Kit zum ersten Mal verwendet wird. Bereiten Sie das Firefly-Luciferase-Reagenz vor, indem Sie den gesamten Inhalt einer Flasche Dual-Glow-Luciferase-Puffer in eine Flasche Dual-Glow-Luciferase-Substrat umpipettieren. Teilen Sie das ungenutzte Luciferase-Reagenz in 10 mm-Gläser auf und lagern Sie es bei minus 20 Grad C. Sobald das Luciferase-Reagenz bereit ist, nehmen Sie die 96-Loch-Platte aus dem Zellkulturinkubator und stellen Sie sie auf Eis. Entfernen Sie anschließend das Medium durch Absaugen und geben Sie 40 Mikroliter pro Loch Lysepuffer hinzu. Lassen Sie die Platte 30 Minuten auf Eis stehen.

Danach je 15 µL Lucifer-Reagenz pro Vertiefung. In einer weißen undurchsichtigen 96-Vertiefungs-Platte verwenden wir die Perkin S optive plate 96. Anschließend je 15 µL Zelllysat hinzufügen und die Platte 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach 10 Minuten die Lumineszenz in einem Mikroplatten-Reader messen. Anschließend den klassischen Luciferase-Assay durchführen, um Daten für das Kontrollplasmid zu erhalten. Dazu unmittelbar vorher die geeignete Menge Luciferase-Substratlösung herstellen, indem man eine Portion Dual-Glo®-Stop-and-Glo®-Reagenz zu 100 Teilen hinzugibt.

Dual-Glow-, Stop- und Glow-Puffer. Geben Sie anschließend 15 µL Substratlösung zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten bei Raumtemperatur und messen Sie danach erneut die Lumineszenz.

Bitte beachten Sie, dass wir den vom Hersteller empfohlenen Protokoll für diese dualen Glow-eisenbasierten Assays geändert haben. Um die Menge an benötigten Reagenzien zu reduzieren, kann die Probe nun erneut mit einem Plattenlesegerät analysiert werden. Sobald die Daten mit dem Mikroplattenreader erfasst wurden, können sie zur weiteren Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm wie Microsoft Excel übertragen werden.

Zunächst berechnen Sie den Durchschnittswert der drei nicht resezierten Wells und ziehen diesen Wert von jedem der Datenpunkte ab. Danach teilen Sie für jedes transfizierte Well den Wert für Firefly-Luciferase. Tun Sie dies für Luciferase und berechnen Sie anschließend für jeden Satz von triplikaten Proben den Durchschnitt, dann die Abweichung und den Variationskoeffizienten.

In unserem Beispiel verwenden wir die verschiedenen Konzentrationen von Kügelchen, die auf der x-Achse gegen das Verhältnis der Feuerfliegen-Luciferase-Aktivität zur Vanille-Luciferase-Aktivität aufgetragen wurden. Wie Sie sehen, zeigt sich eine dosisabhängige Zunahme dieses Verhältnisses. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man einen auf Luciferase basierenden Reportergen-Assay verwendet, um die Expression des LDL-Rezeptor-Promotors als Reaktion auf die Phagozytose von Latexkügelchen zu messen.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Zellen zum Zeitpunkt der Transfektion nur zu 80 bis 90 % konfluent sind. Das war’s. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.