Name: Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Lernen Sie die Luciferase-basierte Reportergen-Analyse zur Untersuchung der Membranbiogenese nach Phagozytose. Diese Methode ermöglicht die Analyse genetischer Regulation bei schneller Membransynthese.

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Cell Culture <ol><li> Stammkulturen von humanen embryonalen Nierenzellen 293 (HEK293-Zellen) sind in 10-cm Kulturschalen in &quot;Medium A &#39;, bestehend aus Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit einem Cocktail von Antibiotika (100 Einheiten pro ml Penicillin und 100 ug ergänzt gewachsen pro ml Streptomycin-Sulfat) und 10% fötalem Rinderserum (FBS). </li><li> Zum Einrichten Zellen für ein Experiment, das Medium wird abgesaugt, und die Zellen werden zweimal mit 5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)-Lösung. </li><li> Das PBS wird dann entfernt und durch 0,6 ml einer Lösung mit 0,25% Trypsin. </li><li> Das Gericht wird bei 37 ˚ C für ca. 2 min inkubiert, bis die Zellen begonnen haben, zu lösen. </li><li> 5,5 ml Medium A zugesetzt wird, um das Trypsin zu neutralisieren und die Zellen mit einer Zählkammer gezählt. </li><li> Die Zellen werden auf 320.000 Zellen pro ml verdünnt und verzichtet auf 0,1 ml pro Vertiefung in einem Polylysin-beschichteten 96-well-Kulturplatte. </li><li> Setzen Sie die Schüssel in einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ˚ C mit einer Atmosphäre, die 8,8% CO2 und wachsen für 24 Stunden. </li></ol> Transfektionen <ol><li> In Vorbereitung für Transfektionen, sollte überlegt werden, wie viele Wiederholungen sind pro experimentellen Bedingungen durchgeführt werden und welche Mengen von Plasmid wird transfiziert werden. Wir routinemäßig alle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung und transfizieren insgesamt 50 bis 100 ng Plasmid-DNA pro Vertiefung. Plasmid vermischt sollte mindestens ein Reporter Ausdruck Glühwürmchenluciferase und eine Kontroll-Plasmid Ausdruck Renilla Luziferase aus einem konstitutiven Promotor-Konstrukts. </li><li> Plasmid-Lösungen sind in 1,5-ml Reaktionsgefäße pipettiert und ergänzt mit 10 ul pro Probe von Serum-freien und Antibiotika-freien DMEM. Zum Beispiel, wenn 20 Vertiefungen mit 50 ug DNA transfiziert werden, fügen Sie 200 ul DMEM auf 1 pg DNA. </li><li> Um das DMEM / DNA-Lösung add 3 ul &#39;Transit 293 Reagenz &quot;(Mirus) pro pg DNA. Mix durch Pipettieren up &amp; down und lassen Sie die Proben bei Raumtemperatur stehen für mindestens 10 min. </li><li> Während dieser Zeit, entfernen Sie die Medien aus dem 96-Loch-Kulturplatte und ersetzen mit 90 ml frisches Medium A. </li><li> Zu jedem Well 10 ul der DMEM / DNA / Transit 293 Mischung. </li><li> Setzen Sie die Schüssel in einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ˚ C mit einer Atmosphäre, die 8,8% CO2 und wachsen für 24 Stunden. </li></ol> Phagozytose <ol><li> Bereiten Suspensionen, die mittel-B (ein 1:1-Gemisch von DMEM und Hams F12-Medium plus Antibiotika und 10% FBS) plus 0,75-um Latexkügelchen auf Null zu 1 mg pro ml. </li><li> Entfernen Sie die Medien aus dem 96-Loch-Kulturplatte und ersetzen mit 0,1 ml Bead-Suspensionen in Medium B </li><li> Drehen Sie die Platte für 2 min bei 1000 x g. </li><li> Die Zellen werden dann bei 37 ˚ C für 6 bis 16 Stunden kultiviert. Abhängig von den Bedingungen und der Promotor verwendet werden, um Laufwerk Luciferase, erhöhte Expression des Reportergens nach 1 bis 3 Stunden nachgewiesen werden können. </li><li> In denselben Fällen kann es erforderlich sein, um die Zellen mit Perlen für 30-60 min inkubieren, dann 2 Wäschen mit PBS auf unincorporated Perlen zu entfernen, und fügen Sie neue Medien vor Inkubation der Zellen für zusätzliche Zeiträume. </li></ol> Dual-GloTM Luciferase Assay <ol><li> Hinweis: unser Protokoll für die Verwendung dieses Kit unterscheidet sich in einigen Punkten von dem vom Hersteller empfohlen. Es wurde geändert, um die Menge an Reagenzien pro Probe zu reduzieren. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung von 1 M DTT, teilen sich in mehrere kleine Portionen und bei -20 ˚ C. </li><li> Bereiten Sie eine Lyse-Puffer mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10% (v / v) Glycerin und 0,5% (v / v) Triton X-100. Vor dem Gebrauch aliquoten Betrag für das Experiment benötigte und fügen Sie 1 ul pro ml von 1 M DTT und Protease-Inhibitor-Cocktail auf eine Endkonzentration von 0,5 bis 1x. Nicht wiederverwenden Überbleibsel DTT-Lösung. </li><li> Bei Verwendung der Dual-GloTM Kit zum ersten Mal, bereiten Sie die (firefly) Luciferase-Reagenz durch die Übertragung der gesamte Inhalt einer Flasche Dual-Luciferase GloTM Buffer (im Lieferumfang des Kits), um eine Flasche Dual-GloTM Luciferase Substrat (vorausgesetzt, mit dem Kit). Teilen Sie die unbenutzten Luciferase-Reagenz in 10-ml-Portionen und bei -20 ˚ C. </li><li> Entfernen Sie die 96-Well-Platte aus der Gewebekultur-Inkubator und legen Sie sie auf Eis. Entfernen Sie die Medien durch Aspiration, dann werden 40 ul pro Well Lysepuffer, und dann lassen Sie die Platte auf Eis für 30 min. </li><li> In einem weißen, undurchsichtigen 96-Well-Platte (OptiplateTM-96, Perkin Elmer Bestellnummer 6005290) Aliquot 15 ul pro Well Luciferase Reagenz, und fügen Sie dann 15 ul Zelllysat. </li><li> Die Platte bei Raumtemperatur für 10 min und lesen Sie dann die Lumineszenz in einem Mikroplatten-Reader. </li><li> Unmittelbar vor dem Gebrauch vorbereiten eine entsprechende Menge an Renilla Luciferase-Substrat-Lösung durch Zugabe von 1 Teil Dual-GloTM Stop &amp; Glo ®; Reagent (im Lieferumfang des Kits) und 100 Teile Dual-GloTM Stop &amp; Glo ® Buffer (im Lieferumfang des Kits). </li><li> Zu jedem Well 15 ul pro Well der Renilla Luciferase-Substrat-Lösung bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren und messen Sie dann die Lumineszenz wieder. </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

studieren membrane biogenesis mit einem luciferase-based reporter gene assay

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Zur Untersuchung der Koordination der verschiedenen Lipid-Synthesewege in Membran-Biogenese ist es sinnvoll, mit einem experimentellen System, in dem Membran-Biogenese erfolgt schnell und in einem induzierbaren Weise zu arbeiten. Wir haben festgestellt, dass die Phagozytose von Latex-Beads praktisch für diese Zwecke als Zellen schnell synthetisieren Membranlipide zu Membran-Pools als Verpackungsmaterial während Partikel engulfment verloren aufzufüllen. Hier beschreiben wir Verfahren für die Untersuchung von Veränderungen in Phagozytose-induzierte Genexpression mit einem Luciferase-basierten Reportergen-Ansatz mit dem Dual-Glo Luciferase Assay System von Promega.

Hier beschreiben wir Verfahren für die Untersuchung von Veränderungen in Phagozytose-induzierte Genexpression mit einem Luciferase-basierten Reportergen-Ansatz mit dem Dual-GloTM Luciferase Assay System von Promega.

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Um die Koordination verschiedener Lipid-Synthesewege während der Membranbiogenese zu untersuchen, ist es hilfreich, mit einem experimentellen System zu arbeiten, in dem Membranen ...

Hallo, ich untersuche die Koordination verschiedener Lipidsynthesewege im Zusammenhang mit Gedächtnis und Biogenese. Es ist hilfreich, ein experimentelles System zu haben, in dem Membranbiogenese schnell und induzierbar abläuft. Wir fanden heraus, dass die Phagozytose von Latexkügelchen für solche Studien besonders nützlich ist, da die Zellen sehr schnell neue Membranen synthetisieren, um die zu ersetzen, die während des Einkapselungsprozesses frühzeitig als Hüllmaterial verloren gehen.In diesem Video wird mein Kollege Ong Zang die Verfahren demonstrieren, die verwendet wurden, um phagozytoseinduzierte Veränderungen in der Genexpression mithilfe eines auf Luciferase basierenden Reportergen-Assay-Ansatzes zu untersuchen, wobei, Hallo, ich bin X vom Leverage of Exon North in der Abteilung für molekulare und zelluläre Biologie an der Harvard University. Heute zeige ich Ihnen, wie man ein Reportergen-Assay verwendet, um die Regulation von Genen zu analysieren, die an der Membranbiogenese nach Phagozytose beteiligt sind. Beginnen wir also.Für dieses Verfahren verwenden wir Kulturen von menschlichen embryonalen Nieren-293-Zellen. Diese Zellen werden in einer 10 cm Kulturschale in Medium

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mit dem wachsenden Interesse an Stammzelltherapien, sind molekulare Bildgebungsverfahren ideal für die Überwachung Stammzellen Verhalten nach der Transplantation. Luciferase Reporter Gene nicht-invasive, repetitive Beurteilung der das Überleben der Zelle, den Standort und Verbreitung in vivo ermöglicht. Dieses Video wird gezeigt, wie man hESC Proliferation in einer lebenden Maus zu verfolgen.

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

Circadiane Uhren funktionieren innerhalb einzelner Zellen, dh sie sind zellautonome. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Zell-autonome Uhrenmodelle mit nicht-invasiven, Luciferase-basierte Echtzeit-Biolumineszenz-Technologie. Reporter Zellen bereitzustellen gefügig, funktionales Modell für das Studium zirkadianen Biologie.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

Das Video zeigt den Luciferase-Assay, der zur Quantifizierung von Luciferase-markierten Proteinen verwendet wird. Der Assay verwendet ein künstlich hergestelltes Luciferase-Enzym, das aus einem großen Fragment besteht, das an das kleine Fragment bindet, das mit einem Protein von Interesse konjugiert ist. Die gebundenen Untereinheiten bilden ein aktives Enzym, das in Gegenwart des Substrats ein Lumineszenzsignal freisetzt. Dieses Signal wird dann mit einem Luminometer quantifiziert.

Der Luciferase-Assay: Ein Hochdurchsatz-Assay zur Messung von Lumineszenzsignalen mit Hilfe von Bioreportern auf Basis von Nanoluziferase-Systemen

Dieses Video zeigt den Split-Luciferase-Komplementationsassay zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen. In diesem Assay werden die Proteine von Interesse an kleine und große Fragmente des Luciferase-Enzyms getaggt. Wenn die Proteine interagieren, verbinden sich die großen und kleinen Fragmente zu einem aktiven Enzymkomplex, der in Gegenwart eines bestimmten Substrats eine helle Lumineszenz freisetzt, die gemessen werden kann.

Split-Luciferase-Komplementationsassay zur Identifizierung spezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

Das Erreichen einer Systemebene Verständnis zellulärer Prozesse ist ein Ziel der modernen Zellbiologie. Wir beschreiben hier Strategien zum Multiplexen Luciferase Reporter von verschiedenen zellulären Funktion Endpunkte zur Genfunktion mit genomweiten RNAi-Bibliotheken zu verhören.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Ein in-vitro- Biolumineszenz-Assay zellulären zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen bestimmen wird vorgestellt. Diese Methode nutzt Säugerzelle Reporter Plasmide destabilisierte Luciferase unter der Kontrolle des Veranstalters Periode 2 gen zum Ausdruck zu bringen. Es kann zu anderen Zelltypen auszuwertende Organ-spezifischen Auswirkungen auf die zirkadianen Rhythmus angepasst werden.

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

Genetisch codierte Luciferase ist eine beliebte nicht-invasive Reporter der Genexpression. Eine automatisierte längs Luciferase imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR) können längs Aufnahme von Biolumineszenz Zellen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Hier zeigen wir, wie ALLIGATOR im Rahmen des circadianen Rhythmus Forschung verwendet werden können.

Flexible Messung der Biolumineszenz Reporter mit einer automatisierten längs Luciferase Imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR)

Neurale Stamm-/Vorläuferzellen weisen verschiedene Expressionsdynamiken von Notch-Signalkomponenten auf, die zu unterschiedlichen Ergebnissen zellulärer Ereignisse führen. Eine solche dynamische Expression kann durch Echtzeitüberwachung und nicht durch statische Analyse mit einem hochempfindlichen Biolumineszenz-Bildgebungssystem, das die Visualisierung schneller Veränderungen von Genausdrücken ermöglicht, aufgedeckt werden.

Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der murinen Neurogenese

Wir entwickelten einen intronischen microRNA-Biogenese-Reporter-Assay für den Einsatz in Zellen in vitro mit vier Plasmiden: eines mit intronischer miRNA, eines mit dem Ziel, eines zur Überexprimierung eines regulatorischen Proteins und eines für Renilla luciferase. Die miRNA wurde verarbeitet und konnte die Luciferase-Expression durch Bindung an die Zielsequenz steuern.

Ein Reporter-Assay zur Analyse der intronischen microRNA-Reifung in Säugetierzellen

Zirkadiane Rhythmen, die in den meisten Organismen vorkommen, regulieren die zeitliche Organisation biologischer Prozesse. 3D-Organoide haben sich in jüngster Zeit als physiologisch relevantes In-vitro-Modell herauskristallisiert. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von biolumineszierenden Reportern zur Beobachtung zirkadianer Rhythmen in Organoiden, was in vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen ermöglicht.

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Lernen Sie die Luciferase-basierte Reportergen-Analyse zur Untersuchung der Membranbiogenese nach Phagozytose. Diese Methode ermöglicht die Analyse genetischer Regulation bei schneller Membransynthese.

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

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