Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording
22. Oktober 2008
Dies ist eine Anleitung zum Ändern der Form von Glas-Mikropipetten. Insbesondere durch Anwendung von Wärme und Luftdruck der Verjüngung ist ohne Erhöhung des Bahnöffnung verbreitert, was zu niedrigeren Pipette Widerstand. Dies ist entscheidend für rauscharme Aufnahmen von kleinen Zellen zu erhalten, sondern ist in vielen Anwendungen.
Dieser Vorgang beginnt mit der Positionierung der Pipettenspitze in der Nähe des Polierfilaments bei 100-facher Vergrößerung. Schalten Sie dann den Luftdruck und die Heizung ein. Das Filament.
Die Pipettenspitze dehnt sich aus und bildet eine stumpfe Spitze. Schalten Sie die Hitze aus, um eine kleinere Spitzenöffnung zu erhalten. Schalten Sie den Druck aus und erhitzen Sie wieder.
Hallo, ich bin Brandon Johnson aus dem Labor von Dr. Miriam Goodman in der Abteilung für Molekulare und Zelluläre Physiologie an der Stanford University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zum Druckpolieren von Patch-Pipetten. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Ionenkanäle und Membranfelder sowie Neuronen von NC-Elganen zu untersuchen.
Also lasst uns loslegen. Ziehen Sie einen Satz von sechs bis 10 Patch-Pipetten. Wenden Sie sich an einen Experten vor Ort oder an unser visualisiertes Experiment, bei dem Patch-Pipetten und scharfe Elektroden mit einer programmierbaren Polung hergestellt werden.
Um den Vorgang zu starten, stellen Sie einen komprimierten Luftdruck auf ca. 40 PS ein. Dann verbinde ich die komprimierte Leitung mit einem Vierwege-Regelventil. Schließen Sie ein Stück Kunststoffschlauch an das Vierwegeventil an und befestigen Sie einen Hochdruckpipettenhalter am losen Ende des Kunststoffschlauchs. Verwenden Sie ein Mikroschmiedegerät, um das Polieren durchzuführen.
Wir verwenden das Ccpm two Kit von einem LA Scientific. Dieses Rig verfügt über einen Hochdruck-Pipettenhalter, ein Platin-Heizfilament, das über ein Fußpedal gesteuert wird, und ein Mikroskop, das mit einer niedrigen und hohen Vergrößerung von 10 mal in 100 mal Länge ausgestattet ist. Luftobjektive mit Arbeitsabstand sind ideal, da es wichtig ist, die Pipettenöffnung während des Protokolls beobachten zu können.
Überprüfen Sie anschließend, ob sich das Druckventil in der Aus-Position befindet. Setzen Sie dann eine Pipette in den Pipettenhalter ein und ziehen Sie die Armatur zur Sicherheit des Labors fingerfest an. Vergewissern Sie sich, dass die Pipette fest in der Pipettenhalterung sitzt.
Andernfalls führt der Luftdruck dazu, dass die Pipette aus der Halterung ausgeworfen wird. Als optionaler Schritt können Sie die Pipette mit einem hydrophoben Isolator wie Wachs beschichten, um die Kapazität zu verringern und die Geräuscheigenschaften zu verbessern. Platzieren Sie nun die Pipette in der Halterung in der Mikroschmiede, positionieren Sie den Pipettenhalter so auf dem Mikroskoptisch, dass sowohl die Spitze als auch das Polierfilament bei geringer 10-facher Leistung an der Mikroschmiede sichtbar sind.
Bringen Sie die Spitze etwa 50 Mikrometer vom Filament entfernt und wechseln Sie dann zum Hochleistungsobjektiv 100, wobei sowohl die Pipettenspitze als auch das Polierfilament scharf und im Sichtfeld sein sollten. Wenn nicht, passe die Höhe des Filaments an. Da die Pipettenposition nicht eingestellt werden kann, sollten sich Pipettenspitze und Filament auf den gegenüberliegenden Seiten des Sichtfeldes befinden.
Vermeide es, die Pipettenspitze zu nah am Filament zu positionieren, da sie sich beim Erhitzen ausdehnt und gegen deine Pipette stoßen könnte. Sobald die Spitze und das Filament richtig positioniert sind, drehen Sie das Ventil, um Druckluft in die Pipette zu leiten und die Pipettenspitze zu erhitzen, bis sich die Verjüngung hinter der Spitze nach außen zu ballern beginnt. Stoppen Sie das Erhitzen, bevor sich die Spitze zu stark aufbläht.
Experimente sind erforderlich, um den geeigneten Abstand, die Wärme und die Zeit für die gewünschte Form zu bestimmen. Optional können Sie die Spitze auch ohne Druck polieren, um den Öffnungsdurchmesser der Spitze zu reduzieren. Denken Sie auch daran, dass diese Polierschritte bis zum Feinschliff wiederholt werden können.
Passen Sie sowohl die Form als auch die Abmessungen der Pipettenspitze an. Wenn die Politur abgeschlossen ist. Schalten Sie den Druckpunkt der Pipettenspitze in eine sichere Richtung aus.
Entfernen Sie die Pipette und legen Sie sie in eine saubere Aufbewahrungsbox, wo sie vor Staub geschützt ist. Stellen Sie zur Sicherheit des Labors sicher, dass Sie den Druck ausschalten, bevor Sie die Pipette entfernen. Andernfalls kann es aus dem Pipettenhalter ausgeworfen werden.
Nach der Entnahme haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Pipetten unter Druck polieren können, um die Aufnahmen mit der Patch-Klemme zu verbessern. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Polierspirale mit Glas mit hoher Schmelztemperatur zu beschichten, um die Ablagerung von verdampftem Metall auf den Pipetten zu minimieren. Und seien Sie vorsichtig, wenn Pipetten Druckluft ausgesetzt sind.
Vergewissern Sie sich, dass die Pipette fest in der Halterung sitzt und die Luft abschaltet, bevor Sie die Pipette aus der Halterung nehmen. Das war's also. Danke fürs Zuschauen.
Viel Spaß beim Druckpolieren und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieser Leitfaden beschreibt die Modifikation der Form von Glas-Mikropipetten mithilfe von Wärme und Luftdruck. Das Verfahren ermöglicht eine Verbreiterung der Abschrägung, ohne die Öffnung der Spitze zu vergrößern, was für die Erzielung von geräuscharmen Aufnahmen bei Anwendungen an kleinen Zellen unerlässlich ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Mikropipetten-Herstellung
Hintergrund
- Glasmikropipetten sind entscheidende Werkzeuge in elektrophysiologischen Ableitungen.
- Ein niedrigerer Pipettenwiderstand ist für Aufzeichnungen hoher Qualität erforderlich.
- Die Modifikation der Form kann die Leistungsfähigkeit für verschiedene Anwendungen verbessern.
- Diese Technik ist besonders vorteilhaft für die Ableitung an kleinen Zellen.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Formung von Glas-Mikropipetten bereitstellen.
- Den Pipettenwiderstand verringern, ohne die Tippöffnung zu vergrößern.
- Die Qualität der Ableitungen von kleinen Zellen verbessern.
Verwendete Methoden
- Positionieren der Pipettenspitze in der Nähe eines Polierfadens bei hoher Vergrößerung.
- Anlegen von Luftdruck und Wärme, um die Pipettenspitze zu erweitern.
- Ausschalten der Wärmezufuhr, um eine kleinere Öffnung der Spitze zu erreichen.
- Endgültige Feinabstimmung durch Abschalten von Druck und Wärme.
Hauptergebnisse
- Die Pipettenspitze kann effektiv zu einer stumpfen Form umgeformt werden.
- Ein geringerer Widerstand wird erreicht, ohne die Spitzengröße zu erhöhen.
- Diese Methode verbessert die Aufnahmequalität von kleinen Zellen.
- Zeigt einen praktischen Ansatz für die Modifikation von Mikropipetten.
Schlussfolgerungen
- Die Formung von Glas-Mikropipetten ist eine wertvolle Technik in der Neurowissenschaftsforschung.
- Verbesserte Pipettendesigns führen zu einer besseren Datengüte.
- Diese Methode kann in verschiedenen elektrophysiologischen Studien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Druckpolieren von Pipetten verringert den elektrischen Widerstand bei Patch-Clamp-Aufnahmen, ohne den Nadeldurchmesser zu verändern, und ermöglicht somit Messungen von Ionenkanälen mit höherer Genauigkeit an kleinen neuronalen Populationen. Diese technische Verbesserung unterstützt die Zielvalidierung in der neurowissenschaftlichen Arzneimittelforschung, indem sie die Signal-Rausch-Verhältnisse in elektrophysiologischen Assays verbessert. Eine verbesserte Aufnahmequalität erhöht die Vorhersagesicherheit in frühen mechanistischen Studien zur neuronalen Erregbarkeit und synaptischen Funktion.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Ionenkanalfunktion in Neuronen mit kleinem Durchmesser, die für neuropathische Schmerzen und Epilepsie-Ziele von entscheidender Bedeutung sind.
- Operativer Wert: Verringert die Variabilität bei Einzelkanalaufnahmen, indem pipettenbedingtes Rauschen minimiert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte Pipettengeometrien für reproduzierbare elektrophysiologische Screening-Panels.
- Operationaler Wert: Kompatibel mit sowohl weichen als auch harten Glas-Mikropipetten, was eine flexible Assay-Entwicklung über verschiedene Zielklassen hinweg ermöglicht.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt Perforated-Patch-Clamp-Anwendungen, indem stumpfe Spitzen erzeugt werden, die die Bildung von Membran-Blebs für antibiotische Perforatoren erhöhen.
- Operativer Wert: Verlängert die Aufzeichnungsdauer in primären neuronalen Kulturen und verbessert so den Durchsatz für Studien zur Optimierung von Wirkstoffkandidaten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in frühe Entdeckungsworkflows ein, in denen die elektrophysiologische Phänotypisierung die Zielwahl und das Profiling von Leitverbindungen unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Ionenkanal-Targets in krankheitsrelevanten neuronalen Modellen.
- Screening: Bietet pipetten mit geringem Widerstand für hochpräzise Wirkstoffscreenings in Patch-Clamp-Plattformen.
- Analytik: Erzeugt quantitative Strom- und Leitfähigkeitsmessungen mit verbesserter Signalstabilität.
- Translationale Forschung: Ermöglicht Langzeit-Aufzeichnungen in akuten Schnitten und kultivierten Neuronen zur Modellierung von pharmakokinetisch-pharmakodynamischen Zusammenhängen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Erfordert lediglich ein Upgrade durch einen Mikroschmelzofen und stellt somit eine skalierbare, kostengünstige Verbesserung der bestehenden Elektrophysiologie-Infrastruktur dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung durch sauberere elektrophysiologische Phänotypen.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit von Assays zwischen verschiedenen Standorten und Bedienern durch die Standardisierung der Pipettengeometrie.
- Strategischer Wert: Verringert falsch-negative Ergebnisse bei der Ionenkanalscreening, indem technisches Rauschen minimiert wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen in präklinischen Programmen, die auf die neuronale Erregbarkeit abzielen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Mikropipetten und der Elektrophysiologie.
- Benötigt einen Mikroschleifer mit Hochdruckventil, Heizfaden und vergrößernden Optiken.
- Setzt eine Standardisierung der Druck-, Heiz- und Zeitparameter über verschiedene Anwender hinweg voraus.
- Muss Unterschiede in der Glasart (Natronkalk- vs. Borosilikatglas) hinsichtlich der Polierempfindlichkeit berücksichtigen.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit manueller Spitzenpositionierung und die Abhängigkeit von der Geschicklichkeit des Bedieners, um eine Überdehnung zu vermeiden.
