Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording

Dieser Vorgang beginnt mit der Positionierung der Pipettenspitze in der Nähe des Polierfilaments bei 100-facher Vergrößerung. Schalten Sie dann den Luftdruck und die Heizung ein. Das Filament.

Die Pipettenspitze dehnt sich aus und bildet eine stumpfe Spitze. Schalten Sie die Hitze aus, um eine kleinere Spitzenöffnung zu erhalten. Schalten Sie den Druck aus und erhitzen Sie wieder.

Hallo, ich bin Brandon Johnson aus dem Labor von Dr. Miriam Goodman in der Abteilung für Molekulare und Zelluläre Physiologie an der Stanford University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zum Druckpolieren von Patch-Pipetten. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Ionenkanäle und Membranfelder sowie Neuronen von NC-Elganen zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Ziehen Sie einen Satz von sechs bis 10 Patch-Pipetten. Wenden Sie sich an einen Experten vor Ort oder an unser visualisiertes Experiment, bei dem Patch-Pipetten und scharfe Elektroden mit einer programmierbaren Polung hergestellt werden.

Um den Vorgang zu starten, stellen Sie einen komprimierten Luftdruck auf ca. 40 PS ein. Dann verbinde ich die komprimierte Leitung mit einem Vierwege-Regelventil. Schließen Sie ein Stück Kunststoffschlauch an das Vierwegeventil an und befestigen Sie einen Hochdruckpipettenhalter am losen Ende des Kunststoffschlauchs. Verwenden Sie ein Mikroschmiedegerät, um das Polieren durchzuführen.

Wir verwenden das Ccpm two Kit von einem LA Scientific. Dieses Rig verfügt über einen Hochdruck-Pipettenhalter, ein Platin-Heizfilament, das über ein Fußpedal gesteuert wird, und ein Mikroskop, das mit einer niedrigen und hohen Vergrößerung von 10 mal in 100 mal Länge ausgestattet ist. Luftobjektive mit Arbeitsabstand sind ideal, da es wichtig ist, die Pipettenöffnung während des Protokolls beobachten zu können.

Überprüfen Sie anschließend, ob sich das Druckventil in der Aus-Position befindet. Setzen Sie dann eine Pipette in den Pipettenhalter ein und ziehen Sie die Armatur zur Sicherheit des Labors fingerfest an. Vergewissern Sie sich, dass die Pipette fest in der Pipettenhalterung sitzt.

Andernfalls führt der Luftdruck dazu, dass die Pipette aus der Halterung ausgeworfen wird. Als optionaler Schritt können Sie die Pipette mit einem hydrophoben Isolator wie Wachs beschichten, um die Kapazität zu verringern und die Geräuscheigenschaften zu verbessern. Platzieren Sie nun die Pipette in der Halterung in der Mikroschmiede, positionieren Sie den Pipettenhalter so auf dem Mikroskoptisch, dass sowohl die Spitze als auch das Polierfilament bei geringer 10-facher Leistung an der Mikroschmiede sichtbar sind.

Bringen Sie die Spitze etwa 50 Mikrometer vom Filament entfernt und wechseln Sie dann zum Hochleistungsobjektiv 100, wobei sowohl die Pipettenspitze als auch das Polierfilament scharf und im Sichtfeld sein sollten. Wenn nicht, passe die Höhe des Filaments an. Da die Pipettenposition nicht eingestellt werden kann, sollten sich Pipettenspitze und Filament auf den gegenüberliegenden Seiten des Sichtfeldes befinden.

Vermeide es, die Pipettenspitze zu nah am Filament zu positionieren, da sie sich beim Erhitzen ausdehnt und gegen deine Pipette stoßen könnte. Sobald die Spitze und das Filament richtig positioniert sind, drehen Sie das Ventil, um Druckluft in die Pipette zu leiten und die Pipettenspitze zu erhitzen, bis sich die Verjüngung hinter der Spitze nach außen zu ballern beginnt. Stoppen Sie das Erhitzen, bevor sich die Spitze zu stark aufbläht.

Experimente sind erforderlich, um den geeigneten Abstand, die Wärme und die Zeit für die gewünschte Form zu bestimmen. Optional können Sie die Spitze auch ohne Druck polieren, um den Öffnungsdurchmesser der Spitze zu reduzieren. Denken Sie auch daran, dass diese Polierschritte bis zum Feinschliff wiederholt werden können.

Passen Sie sowohl die Form als auch die Abmessungen der Pipettenspitze an. Wenn die Politur abgeschlossen ist. Schalten Sie den Druckpunkt der Pipettenspitze in eine sichere Richtung aus.

Entfernen Sie die Pipette und legen Sie sie in eine saubere Aufbewahrungsbox, wo sie vor Staub geschützt ist. Stellen Sie zur Sicherheit des Labors sicher, dass Sie den Druck ausschalten, bevor Sie die Pipette entfernen. Andernfalls kann es aus dem Pipettenhalter ausgeworfen werden.

Nach der Entnahme haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Pipetten unter Druck polieren können, um die Aufnahmen mit der Patch-Klemme zu verbessern. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Polierspirale mit Glas mit hoher Schmelztemperatur zu beschichten, um die Ablagerung von verdampftem Metall auf den Pipetten zu minimieren. Und seien Sie vorsichtig, wenn Pipetten Druckluft ausgesetzt sind.

Vergewissern Sie sich, dass die Pipette fest in der Halterung sitzt und die Luft abschaltet, bevor Sie die Pipette aus der Halterung nehmen. Das war's also. Danke fürs Zuschauen.

Viel Spaß beim Druckpolieren und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.