Name: Detección de fármacos de moléculas pequeñas de alto rendimiento para trastornos del sueño relacionados con la edad con Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Aprende a realizar cribado de fármacos de alto rendimiento para trastornos del sueño relacionados con la edad utilizando Drosophila melanogaster. Este protocolo mejora la precisión en la medición del comportamiento del sueño mediante detección de infrarrojos.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio del Prof. Junhai Han por su discusión y comentarios. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 32170970 a Y.T y el "Proyecto Azul de Cianina" de la provincia de Jiangsu a Z.C.Z.

Este protocolo utiliza las moscas w1118 de 30 días de edad del Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, ver Tabla de Materiales).
1. Preparación de las moscas de la fruta envejecidas
<ol><li>Preparación de alimentos<ol><li>Prepare un medio de cultivo estándar de almidón de maíz mezclando 50 g/L de copos de maíz, 110 g/L de azúcar, 5 g/L de agar y 25 g/L de levadura. Calentar los copos de maíz y la levadura con agua para gelatinizar, y luego disolver completamente todas las sustancias.</li>
		<li>Cuando el medio se enfríe a 50-60 °C, agregue 6 ml/l de ácido propiónico y envase rápidamente en frascos de cultivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Cría de moscas y preparación de moscas envejecidas<ol><li>Criar la cepa de mosca w1118en frascos que contengan un medio de cultivo estándar de almidón de maíz y colocar los frascos en una incubadora de temperatura constante a 25 ° C, 68% de humedad relativa, condiciones de iluminación de 500-1000 lux y un ciclo de luz: oscuridad de 12 h: 12 h.</li>
		<li>Transfiera las moscas a una nueva botella cada 7 días de acuerdo con el ciclo de crecimiento de las moscas, manteniendo constante la edad de los individuos en la misma botella.</li>
		<li>Recoja el nuevo lote de moscas que eclosionan de la botella original 3 días después de transferirlas y colóquelas en una botella nueva. Siguiendo el principio de cambiar el frasco cada 7 días, se cultivarán hasta alrededor de los 30 días de edad.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación de alimentos medicinales y tubos de vidrio para monitoreo
NOTA: El procedimiento para la preparación de tubos de vidrio sigue el trabajo de Jin et al. con modificaciones34.
<ol><li>Limpieza y secado de tubos de vidrio<ol><li>Coloque el tubo de vidrio (5 mm de diámetro x 65 mm de largo, consulte la tabla de materiales) en un vaso de precipitados grande, sumérjalo y hiérvalo con agua destilada doble durante 20 minutos. Repita 3 veces.</li>
		<li>Retire y agrupe el tubo de vidrio, enjuague el interior con agua destilada doble de 3 a 5 veces y colóquelo en un horno para que se seque.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del medio de cultivo simple (100 mL)<ol><li>Disuelva 1,5 g de agar y 5 g de sacarosa en agua bidestilada, caliente y concentre hasta 100 ml.</li>
		<li>Añadir 600 μL de ácido propiónico cuando el medio se enfríe a unos 70 °C, evitando que se solidifique con un baño de agua a temperatura constante.</li>
		<li>Agregue aproximadamente 4 ml de medio simple y reserpina (ver Tabla de materiales) en un vaso de precipitados pequeño de 10 ml hasta que el fármaco alcance 20 μM o 50 μM. Agregue dimetilsulfóxido (DMSO) a la concentración de 0.2% en el grupo de control negativo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de los tubos de vidrio que contienen medicamentos<ol><li>Para facilitar el flujo del medio, inserte con cuidado una longitud adecuada de tubo de vidrio en un vaso de precipitados pequeño. El medio entrará naturalmente en el tubo de vidrio debido a la presión atmosférica.</li>
		<li>Saque el tubo de vidrio cuando el medio de cultivo esté completamente solidificado y limpie la pared exterior para obtener un tubo de vidrio de monitoreo con un medio de cultivo que contenga medicamentos en un extremo.</li>
		<li>Calentar la parafina sólida en un vaso de precipitados hasta que se derrita a 70 °C, acercar el extremo del tubo de vidrio a los alimentos en el líquido de parafina durante unos 5 mm y retirarlo rápidamente. Espere a que la parafina se solidifique para sellar el extremo alimenticio del tubo de vidrio.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Diseño experimental y tratamiento de moscas
<ol><li>Diseñar el experimento para el tratamiento con mosca siguiendo la Tabla 1.</li>
</ol>4. Montaje de Drosophila y monitorización del sueño
NOTA: El procedimiento para el ensamblaje de Drosophila sigue el trabajo de Jin et al.34 con modificaciones.
<ol><li>Anestesiar las moscas con gas CO2 , colocarlas en tubos de vidrio sellados con parafina (uno por tubo) y bloquear el extremo no alimentario con una bola de algodón absorbente para evitar que las moscas se escapen y asegurar la circulación del aire.</li>
	<li>Cargue los tubos en el monitor infrarrojo para monitorearlos.<ol><li>Ensamble los tubos de vidrio que contienen moscas en un monitor infrarrojo en la misma dirección y registre el número de monitor y el número de orificio correspondiente a cada medicamento.</li>
		<li>Ajusta la alineación de cada tubo y haz que los rayos infrarrojos pasen verticalmente por el centro del rango de actividad de la mosca.</li>
		<li>Coloque el monitor dentro de una incubadora a 25 °C ubicada en el cuarto oscuro del sueño de moscas, siguiendo la configuración especificada: temperatura de 25 °C, Zeitgeber 12 (ZT12) (equivalente a la hora local de las 08:00 p.m.) y ZT24 (equivalente a la hora local de las 08:00 a.m.). Esta configuración asegura que las moscas experimenten períodos alternos de 12 h de luz y oscuridad. NOTA: Trate de no abrir la puerta hasta que se complete la recopilación de datos de monitoreo para mantener un ambiente estable en la incubadora durante el monitoreo.</li>
		<li>Inicie la supervisión utilizando el sistema DAM2 (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Una vez que se complete el monitoreo, descargue los datos recopilados en formato .txt del sistema.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Tratamiento de datos
NOTA: El procesamiento de datos utilizando el sistema DAM, DAMFileScan107 y SCAMP se realizó de acuerdo con las instrucciones de sus sitios web oficiales (ver Tabla de Materiales).
<ol><li>Importe el archivo txt anterior al software DAMFileScan107 para escanearlo y divídalo según sea necesario para obtener los datos de sueño.<ol><li>Establezca la hora de inicio de los datos de segmentación en 8:01 (segmentación de 1 minuto) u 8:00 (segmentación de 30 minutos) de la tercera mañana después de iniciar los monitores, y la hora de finalización es a las 8:00 a.m. tres días después de la hora de inicio (Figura 2A1). NOTA: Las moscas deben adaptarse al entorno de monitoreo durante al menos un día. Por lo tanto, se puede establecer la hora de inicio de los datos divididos a las 8 a.m. del tercer día después de que comience el monitor.</li>
		<li>Divida los datos a intervalos de 1 min y 30 min. Cambie la opción "Longitud del contenedor" a 1 minuto, cambie la opción "Tipo de archivo de salida" a Archivos de canal, cambie el nombre y la salida. El método de segmentación de datos de 30 minutos es el mismo que el anterior (Figura 2A2-5). NOTA: Al realizar la segmentación de datos a intervalos de 1 minuto y 30 minutos, el cambio de nombre final de los dos archivos debe ser coherente; de lo contrario, puede ser ilegible durante el procesamiento posterior de Matlab. Si es necesario, el nombre del archivo se puede cambiar después de la salida para facilitar la diferenciación.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamiento de datos mediante SCAMP2020<ol><li>Abra el paquete del programa SCAMP2020 en Matlab y haga doble clic en Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (Figura 2B).</li>
		<li>Agregue su subcarpeta "Vecsey SCAMP Scripts" a la ruta, busque el archivo "scamp.m" en esa carpeta y ejecútelo. En la siguiente ventana emergente, seleccione las carpetas de proceso de 1 minuto y 30 minutos en secuencia (Figura 2C, D).</li>
		<li>Seleccione un monitor, haga clic en Cargar gráficos de visualización individuales para obtener una vista previa (Figura 3A1) y verifique la imagen que aparece. Desmarque el canal correspondiente de moscas muertas (Figura 3A2, Figura 3B).</li>
		<li>Repita los pasos anteriores para comprobar todos los monitores.</li>
		<li>Cambie el nombre de cada canal de cada monitor en función del fármaco correspondiente que se va a probar (Figura 3A3), seleccione todos los monitores y haga clic en ANALIZAR datos seleccionados para el análisis (Figura 3A4).</li>
		<li>De forma predeterminada en la opción seleccionada, haga clic en Analizar para la ubicación elegida, marque Exportar datos y, finalmente, haga clic en GRÁFICO 30 minutos Tipos de datos para todos los días para grupos seleccionados y EXPORTAR todos los datos para generar los resultados (Figura 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Seleccione el archivo denominado s30 del archivo CSV, busque el valor medio correspondiente y los datos de error estándar para cada monitor, haga una copia de seguridad en Excel para modificarlo y ajustarlo, y péguelo en GraphPad Prism (consulte la Tabla de materiales) para dibujar un diagrama de estado de suspensión (Figura 4A, B).</li>
	<li>Busque el archivo llamado "stdur" y calcule los valores promedio de sueño diurno, nocturno y total para cada mosca dentro de los tres días (Figura 4A, C). Pegue los datos en el software Prism para completar la prueba de diferencia y dibuje un gráfico.</li>
</ol>

Avances en los tratamientos de los trastornos del sueño: un enfoque de detección basado en Drosophila

<ol><li>Le Bon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+REM+and+NREM+in+the+NREM-REM+sleep+cycle%3A+a+review+on+competing+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Medicine%22%5BJournal%5D)">Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts.</a> Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).</li>
<li>Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+function%3A+Toward+elucidating+an+enigma%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Medicine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sleep function: Toward elucidating an enigma.</a> Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).</li>
<li>Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-analysis+of+quantitative+sleep+parameters+from+childhood+to+old+age+in+healthy+individuals%3A+developing+normative+sleep+values+across+the+human+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan.</a> Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).</li>
<li>Li, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperexcitable+arousal+circuits+drive+sleep+instability+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging.</a> Science. 375 (6583), eabh3021(2022).</li>
<li>Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+problems+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Sleep problems in the elderly.</a> Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).</li>
<li>Gulia, K. K., Kumar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+disorders+in+the+elderly%3A+a+growing+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Psychogeriatrics%22%5BJournal%5D)">Sleep disorders in the elderly: a growing challenge.</a> Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).</li>
<li>Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+and+aging%3A+1.+Sleep+disorders+commonly+found+in+older+people%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Medical+Association+Journal%22%5BJournal%5D)">Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people.</a> Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).</li>
<li>Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+disorders+in+the+elderly%3A+Diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+and+Family+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management.</a> Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).</li>
<li>Foley, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+complaints+among+elderly+persons+-+an+epidemiologic-study+of+3+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Sleep complaints among elderly persons - an epidemiologic-study of 3 communities.</a> Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).</li>
<li>Yu, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insomnia+Severity+Index%3A+psychometric+properties+with+Chinese+community-dwelling+older+people%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Advanced+Nursing%22%5BJournal%5D)">Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people.</a> Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).</li>
<li>Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+duration+and+sleep+quality+in+relation+to+12-year+cardiovascular+disease+incidence%3A+the+MORGEN+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study.</a> Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).</li>
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<li>Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+uncoupling+and+up-regulation+of+benzodiazepine+and+GABA+recognition+sites+following+chronic+diazepam+treatment+of+HEK+293+cells+stably+transfected+with+alpha1beta2gamma2S+subunits+of+GABA+%28A%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedeberg%27s+Archives+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).</li>
<li>Lader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+benzodiazepine+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Substance+Abuse+Treatment%22%5BJournal%5D)">History of benzodiazepine dependence.</a> Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).</li>
<li>Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+of+dementia+in+patients+with+insomnia+and+long-term+use+of+hypnotics%3A+a+population-based+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study.</a> Plos One. 7 (11), e49113(2012).</li>
<li>Kang, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zolpidem+use+and+risk+of+fracture+in+elderly+insomnia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Preventive+Medicine+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients.</a> Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).</li>
<li>Kao, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+zolpidem+and+cancer+risk%3A+a+Taiwanese+population-based+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Protocols%22%5BJournal%5D)">Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study.</a> Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).</li>
<li>Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+clinical+safety+of+ramelteon%3A+an+evidence-based+review%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Medicine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review.</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).</li>
<li>Friedrich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+liver+injury+during+antidepressant+treatment%3A+results+of+amsp%2C+a+drug+surveillance+program%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126(2016).</li>
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<li>Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+effects+of+dimethyl+sulfoxide+%28DMSO%29%3A+changes+in+sleep+architecture+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats.</a> Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).</li>
<li>Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotor+activity+level+monitoring+using+the+Drosophila+Activity+Monitoring+%28DAM%29+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518(2010).</li>
<li>Gilestro, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+tracking+and+analysis+of+sleep+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster.</a> Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).</li>
<li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li>
<li>Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAABA%3A+interactive+machine+learning+for+automatic+annotation+of+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior.</a> Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).</li>
<li>Donelson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+positional+tracking+for+long-term+analysis+of+Drosophila+sleep+and+locomotion+using+the+%26%2334%3Btracker%26%2334%3B+program%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the &#34;tracker&#34; program.</a> Plos One. 7 (5), e37250(2012).</li>
<li>Cichewicz, K., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShinyR-DAM%3A+a+program+analyzing+Drosophila+activity%2C+sleep+and+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms.</a> Communications Biology. 1, 25(2018).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

El método descrito es adecuado para la detección rápida de medicamentos para dormir pequeños y medianos. En la actualidad, la mayoría de los métodos convencionales de detección de fármacos de alto rendimiento se basan en los niveles bioquímicos y celulares. Por ejemplo, se examina la estructura y las propiedades del receptor para buscar ligandos específicos que puedan unirse a él22. Otro enfoque consiste en analizar el modo de unión y la fuerza de los fragmentos moleculares de fármacos seleccionad...

El sueño, uno de los comportamientos esenciales necesarios para la supervivencia humana, se caracteriza por dos estados principales: el sueño de movimientos oculares rápidos (REM) yel sueño de movimientos oculares no rápidos (NREM). El sueño NREM comprende tres etapas: N1 (la transición entre la vigilia y el sueño), N2 (sueño ligero) y N3 (sueño profundo, sueño de ondas lentas), que representan la progresión de la vigilia al sueño profundo1. El sueño juega un papel crucial tanto en la salud física como en la mental2. Sin embargo, el envejecimiento reduce la duración total del sueño, la eficiencia del sueño, el porcentaje de sueño de ondas lentas y el porcentaje de sueño REM en adultos3. Las personas mayores tienden a pasar más tiempo en sueño ligero en comparación con el sueño de ondas lentas, lo que los hace más sensibles a los despertares nocturnos. A medida que aumenta el número de despertares, el tiempo medio de sueño disminuye, lo que da lugar a un patrón de sueño fragmentado en los ancianos, que puede estar asociado a una excitación excesiva de las neuronas Hcrt en ratones4. Además, las disminuciones relacionadas con la edad en los mecanismos circadianos contribuyen a un cambio más temprano en la duración del sueño 5,6. En combinación con las enfermedades físicas, el estrés psicológico, los factores ambientales y el uso de medicamentos, estos factores hacen que los adultos mayores sean más susceptibles a los trastornos del sueño, como el insomnio, el trastorno del comportamiento del sueño REM, la narcolepsia, los movimientos periódicos de las piernas, el síndrome de piernas inquietas y los trastornos respiratorios del sueño 7,8.
Los estudios epidemiológicos han demostrado que los trastornos del sueño están estrechamente relacionados con las enfermedades crónicas en los ancianos9, incluyendo la depresión 10, las enfermedades cardiovasculares11 y la demencia12. Abordar los trastornos del sueño desempeña un papel crucial en la mejora y el tratamiento de las enfermedades crónicas y en la mejora de la calidad de vida de los adultos mayores. En la actualidad, los pacientes recurren principalmente a fármacos como las benzodiacepinas, las no benzodiacepinas y los agonistas de los receptores de melatonina para mejorar la calidad del sueño13. Sin embargo, las benzodiacepinas pueden conducir a una regulación negativa de los receptores y a la dependencia después de un uso prolongado, causando síntomas graves de abstinencia tras la interrupción14,15. Los medicamentos no benzodiacepinas también conllevan riesgos, como demencia16, fracturas17 y cáncer18. El agonista del receptor de melatonina de uso común, el ramelteón, reduce la latencia del sueño, pero no aumenta la duración del sueño y tiene problemas relacionados con la función hepática debido a la extensa eliminación del primer paso19. La agomelatina, un agonista de los receptores de melatonina y antagonista de los receptores de serotonina, mejora el insomnio relacionado con la depresión, pero también presenta un riesgo de daño hepático20. En consecuencia, existe una necesidad urgente de medicamentos más seguros para tratar o aliviar los trastornos del sueño. Sin embargo, las estrategias actuales de cribado de fármacos, basadas en experimentos moleculares y celulares combinados con sistemas automatizados y análisis informáticos, son costosas y requieren mucho tiempo21. Las estrategias de diseño de fármacos basadas en la estructura, que se basan en la estructura y las propiedades de los receptores, requieren una comprensión clara de la estructura tridimensional de los receptores y carecen de capacidades predictivas de los efectos de los fármacos22.
En el año 2000, con base en los criterios de sueño propuestos por Campbell y Tobler en 1984 23, los investigadores establecieron modelos animales simples para estudiar el sueño 24, incluyendo Drosophila melanogaster, que exhibía estados similares al sueño25,26. A pesar de las diferencias anatómicas entre Drosophila y los humanos, muchos componentes neuroquímicos y vías de señalización que regulan el sueño en Drosophila se conservan en el sueño de los mamíferos, facilitando el estudio de las enfermedades neurológicas humanas27,28. Drosophila también se utiliza ampliamente en los estudios del ritmo circadiano, a pesar de las diferencias en los osciladores centrales entre moscas y mamíferos 29,30,31. Por lo tanto, Drosophila sirve como un valioso organismo modelo para estudiar el comportamiento del sueño y realizar pruebas de detección de drogas relacionadas con el sueño.
Este estudio propone un enfoque rentable y sencillo basado en el fenotipo para el cribado de fármacos de moléculas pequeñas para tratar los trastornos del sueño utilizando moscas envejecidas. La regulación del sueño en Drosophila está altamente conservada25, y la disminución del sueño observada con la edad puede ser reversible mediante la administración de fármacos. Por lo tanto, este método de detección basado en el fenotipo del sueño puede reflejar intuitivamente la eficacia del fármaco. Alimentamos a las moscas con una mezcla del fármaco investigado y la comida, monitorizamos y registramos el comportamiento del sueño utilizando el Drosophila Activity Monitor (DAM)32 y analizamos los datos adquiridos utilizando el paquete de datos SCAMP2020 de código abierto de MATLAB (Figura 1). El análisis estadístico se realiza mediante estadísticas y software de gráficos (ver Tabla de Materiales). A modo de ejemplo, demostramos la efectividad de este protocolo mediante la presentación de datos experimentales sobre la reserpina, un inhibidor de molécula pequeña del transportador vesicular de monoaminas que se ha reportado que aumenta el sueño33. Este protocolo proporciona un enfoque valioso para identificar medicamentos para tratar los problemas de sueño relacionados con la edad.

<table><tbody><tr><td>Ager</td><td>BIOFROXX</td><td>8211KG001</td><td></td></tr><tr><td>Caja de clima artificial</td><td>PRANDT</td><td>PRX-1000A</td><td>sitio web oficial:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/</td></tr><tr><td>DAM2 Drosophila Activity Monitor</td><td>TriKineics</td> Sitio web oficial <td>de DAM2</td><td>:https://www.trikinetics.com/</td></tr><tr><td>DAM2system</td><td>TriKineics</td><td>versión:v3.03</td><td>sitio web oficial:https:// www.trikinetics.com/</td></tr> <tr><td>DAMFileScan</td><td>TriKineics</td><td>versión:1.0.7.0</td><td>sitio web oficial:https://www.trikinetics.com/</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>SIGMA</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Activity Monitoring Incubator</td><td>Tritech Research</td><td>DT2-CIRC-TK</td><td>sitio web oficial:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html</td></tr><tr><td>Drosophila Botellas</td><td>Biologix</td><td>51-17720</td><td>sitio web oficial:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48</td></tr><tr><td>Drosophila: w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center&nbsp;</td><td></td><td></td>BDSC_3605</tr><tr><td>Excel</td> versión <td>de Microsoft</td><td>:Excel 2016</td><td>sitio web oficial:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel</td></tr><tr><td>Tubos de vidrio</td><td>TriKinetics</td><td>PPT5x65</td><td>sitio web oficial:https://www.trikinetics.com/</td></tr><tr><td>MATLABR2022b</td><td>MathWorks</td><td>versión:9.13.0.2049777</td><td>sitio web oficial:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html</td></tr><tr><td>Prisma</td><td>GraphPad</td><td>Versión:Prisma 8.0.1</td><td>sitio web oficial:https://www.graphpad.com/features</td></tr><tr><td>Reserpine</td><td>MACKLIN</td><td>R817202-1g</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>SIGMA</td><td>1245GR500</td><td></td></tr><tr><td>SCAMP</td><td>Vecsey Lab</td><td>N/A</td><td>sitio web oficial:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/</td></tr></tbody></table>

detección de fármacos de moléculas pequeñas de alto rendimiento para trastornos del sueño relacionados con la edad con drosophila melanogaster

High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster

El sueño, un componente esencial de la salud y el bienestar general, a menudo presenta desafíos para las personas mayores que experimentan con frecuencia trastornos del sueño caracterizados por una duración del sueño más corta y patrones fragmentados. Estas interrupciones del sueño también se correlacionan con un mayor riesgo de diversas enfermedades en las personas mayores, como diabetes, enfermedades cardiovasculares y trastornos psicológicos. Desafortunadamente, los medicamentos existentes para los trastornos del sueño se asocian con efectos secundarios significativos, como deterioro cognitivo y adicción. En consecuencia, se necesita urgentemente el desarrollo de nuevos medicamentos para los trastornos del sueño, más seguros y más eficaces. Sin embargo, el alto costo y la larga duración experimental de los métodos actuales de detección de drogas siguen siendo factores limitantes.
Este protocolo describe un método de cribado rentable y de alto rendimiento que utiliza Drosophila melanogaster, una especie con un mecanismo de regulación del sueño altamente conservado en comparación con los mamíferos, lo que lo convierte en un modelo ideal para estudiar los trastornos del sueño en los ancianos. Al administrar varios compuestos pequeños a moscas envejecidas, podemos evaluar sus efectos sobre los trastornos del sueño. Los comportamientos de sueño de estas moscas se registran mediante un dispositivo de monitorización infrarroja y se analizan con el paquete de datos de código abierto Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Este protocolo ofrece un enfoque de detección de bajo costo, reproducible y eficiente para la regulación del sueño. Las moscas de la fruta, debido a su corto ciclo de vida, bajo costo de cría y facilidad de manejo, sirven como excelentes sujetos para este método. A modo de ilustración, la reserpina, uno de los fármacos probados, demostró la capacidad de promover la duración del sueño en moscas ancianas, destacando la eficacia de este protocolo.

La reserpina es un inhibidor de molécula pequeña del transportador vesicular de monoaminas (VMAT), que inhibe la recaptación de monoaminas en las vesículas presinápticas, lo que conduce a un aumento del sueño33. Se examinaron los efectos de la reserpina como promotores del sueño en moscas de 30 días de edad, y el grupo de control se alimentó únicamente con el disolvente dimetilsulfóxido (DMSO). En el grupo de Reserpina, las moscas más viejas mostraron un aumento significativo del sueño tanto duran...

Se presenta un protocolo para el cribado de fármacos de alto rendimiento para mejorar el sueño mediante el seguimiento del comportamiento del sueño de las moscas de la fruta en un modelo de Drosophila de edad avanzada.

Detección de fármacos de moléculas pequeñas de alto rendimiento para trastornos del sueño relacionados con la edad con Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders ...

Las técnicas de cribado de fármacos incluyen el cribado de alto rendimiento, que utiliza la automatización para el descubrimiento de fármacos, los diseños basados en la estructura y la búsqueda de moléculas de unión al receptor en función de la estructura, y un diseño basado en fragmentos, que utiliza la resonancia magnética nuclear y la espectrometría de masas para optimizar los fragmentos moleculares e identificar los compuestos. El sistema DAM mide el sueño de las moscas mediante la detección de ladrillos de rayos infrarrojos. Sin embargo, este método puede sobrestimar el sueño si las moscas permanecen estáticas en un extremo del tubo, o si la mosca no es muy móvil.Además, el orden de cualquier fármaco probado puede afectar a la ingesta de frutos de mosca, lo que podría sesgar los resultados experimentales. Por lo tanto, nuestro experimento incorporará varios estiramientos para mitigar estos factores y mejorar la precisión. En comparación con los métodos basados en el análisis de video, nuestro método ofrece capacidades de alto rendimiento, reduce el costo y simplifica la operación.Por lo tanto, el proceso de los datos experimentales también es relativamente sencillo, donde el gráfico resultante representa visualmente los efectos del medicamento.

high-throughput-small-molecule-drug-screening-for-age-related-sleep

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Se describen los procedimientos para el registro diario de los ritmos de actividad...

Ensayo Actividad locomotora para el Estudio de los ritmos circadianos y del sueño en los parámetros Drosophila</em

Nanoinjection parejas y Ensayo de electrofisiología para la detección de bioactividad de compuestos utilizando el Drosophila melanogaster Sistema de fibra gigante

Los ensayos sencillos para medir la sensibilidad al etanol y la tolerancia rápida en Drosophila facilitan el uso de este organismo modelo para investigar estos importantes comportamientos relacionados con el etanol. Aquí, se describe un ensayo relativamente simple y escalable para medir la sensibilidad al etanol y la tolerancia rápida en moscas.

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Este protocolo describe un ensayo de alto rendimiento para probar las preferencias de puesta de huevos de Drosophila melanogaster a una resolución de un solo animal.  Este ensayo proporciona una plataforma simple, eficiente y escalable para identificar genes y componentes de circuitos que controlan un proceso de toma de decisiones simple.

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Presentamos un protocolo utilizando un enfoque genético directo para la detección de mutantes que exhiben neurodegeneración en Drosophila melanogaster. Incorpora un ensayo de escalada, análisis histológico, mapeo genético y secuenciación de ADN para identificar en última instancia nuevos genes relacionados con el proceso de neuroprotección.

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Drosophila es un modelo experimental ampliamente utilizado adecuado para la detección de medicamentos con posibles aplicaciones para la terapia oncológica. Aquí, describimos el uso de fenotipos de color ocular variegados Drosophila como un método para el cribado de compuestos de moléculas pequeñas que promueven la formación de heterocromatina.

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Los métodos actuales para medir la sensibilidad al alcohol en Drosophila están diseñados para probar grupos de moscas. Presentamos un ensayo simple, de bajo costo y de alto rendimiento para evaluar la sensibilidad a la sedación del alcohol en un gran número de moscas individuales. El método no requiere herramientas especializadas y se puede realizar en cualquier laboratorio utilizando materiales comunes.

Método de alto rendimiento para medir el tiempo de sedación del alcohol de la Drosophila melanogaster individual

El presente protocolo evalúa la actividad locomotora de Drosophila mediante el seguimiento y análisis del movimiento de las moscas en una arena hecha a mano utilizando el software de código abierto Fiji, compatible con plugins para segmentar píxeles de cada fotograma basado en grabación de vídeo de alta definición para calcular parámetros de velocidad, distancia, etc.

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Este protocolo detalla el uso de larvas de Drosophila para identificar compuestos anticonvulsivos únicos para el tratamiento de la epilepsia.

Actividad convulsiva inducida por electrochoque en larvas de Drosophila

El protocolo presenta un método rentable y de alto rendimiento para evaluar la neurotoxicidad en la mosca de la fruta a través de la cuantificación de la disfunción locomotora como alternativa a los modelos tradicionales de mamíferos. Su objetivo es evaluar los efectos neurotóxicos de compuestos farmacéuticos, agentes ambientales o modificaciones genéticas utilizando un modelo sensible, reproducible y éticamente favorable.

Análisis conductual de la disfunción locomotora en Drosophila melanogaster como lectura de la neurotoxicidad

Aprende a realizar cribado de fármacos de alto rendimiento para trastornos del sueño relacionados con la edad utilizando Drosophila melanogaster. Este protocolo mejora la precisión en la medición del comportamiento del sueño mediante detección de infrarrojos.

Detección de fármacos de moléculas pequeñas de alto rendimiento para trastornos del sueño relacionados con la edad con Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal

Detección de fármacos de moléculas pequeñas de alto rendimiento para trastornos del sueño relacionados con la edad con Drosophila melanogaster

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