Name: counting bacteria with dilution plates
Uploaded: 2023-04-30T07:09:34.000Z
Duration: 10 min 53 s
Channel: JoVE

1. Configuración
<ol><li>Un diagrama de flujo con una lista de todos los materiales, un protocolo experimental escalonado y un método para desechar suministros deben escribirse en un cuaderno de laboratorio y mantenerse cerca del espacio de trabajo experimental.</li>
	<li>Los espacios de trabajo deben esterilizarse con un antiséptico adecuado (70% etanol) y el experimentador debe mitigar el riesgo de contaminación mediante el uso de prendas de laboratorio limpias que también los protejan de anomalías de exposición. Las prendas adecuadas incluyen, entre otras, un abrigo de laboratorio, guantes de látex o nitrilo, googles, respiradores y zapatos cerrados. Es fundamental mantener la técnica aséptica en todo momento.</li>
	<li>Preparar 90 ml de 0,45% de salina. Usando un cilindro graduado limpio, mida 90 ml de agua estéril y transfiéralo a un matraz Erlenmeyer limpio etiquetado 0.45% solución salina. Pesar .405 g de cloruro sódico (Sigma-Aldrich NaCl S9888) y añadirlo al matraz etiquetado 0,45% de solución salina. Gire repetidamente hasta que no quede visible ningún soluto.</li>
	<li>Una vez completado, el experimentador debe volver a esterilizar todas las superficies y descartar cualquier organismo no deseado, existencias de diluyentes, platos de petri o bucles de inoculación desechables de acuerdo con las directrices de la OSHA. Las prendas de laboratorio se pueden quitar antes de lavarse las manos.</li>
</ol>2. Preparación de medios
<ol><li>Seleccione los medios que sean apropiados para el cultivo de un organismo deseado. En la mayoría de los escenarios, un caldo permitiría un crecimiento bacteriano suficiente. Dado que aquí se desean organismos de un protocolo Winogradsky, una columna que consiste en carbonato de calcio, azufre, celulosa y barro se ensambló y se dejó sin perturbaciones durante 7 días. La columna de nombre anterior se separa en secciones aeróbicas, microaerofílicas y anaeróbicas.</li>
	<li>Elija un medio apropiado para enchapar el organismo de interés. La suplementación de medios líquidos con agar de grado microbiológico se emplea típicamente como un agente solidificante. El medio/agar LB es suficiente cuando se cosechan muestras de regiones aeróbicas, microaerófilas y anaeróbicas de la columna con nombre anterior. Nota: Para este procedimiento no se cosecharon muestras de la región microaeroófila. Sin embargo, estos organismos deben ser cultivados en frascos de velas. La introducción de una vela a esta cámara de cultivo antes de sellar crea un ambiente de bajo oxígeno que es adecuado para la proliferación microaerofílica.</li>
	<li>Dado que deseamos preparar 250 ml, utilice frascos Erlenmeyer de 500 ml (o más) para evitar la ebullición al autoclave. Etiqueta un "Caldo" y el otro "Agar".</li>
	<li>Determine la cantidad de medios necesarios para crear cada solución siguiendo las recomendaciones de concentración del fabricante. El agar LB, utilizado aquí, se prepara combinando 25g/L con agua ultrapura. Nuestro volumen de 250 ml requiere una solución de 6,25 LB Agar/250 ml de agua. Del mismo modo, el caldo LB se prepara combinando la misma proporción de caldo LB y agua. Puesto que no se complementa con un agente solidificante, no se endurecerá cuando se enfríe.</li>
	<li>Pesar el medio y mezclarlo con agua en proporciones consistentes con las recomendaciones del fabricante. Agregue 6.25g de agar LB a un matraz etiquetado como "Agar", y 6.25g de caldo LB a un matraz etiquetado como "Broth". Añadir 250 ml de agua ultrapura a cada matraz.</li>
	<li>Envuelva la lámina de aluminio sobre cada matraz y utilice un autoclave para esterilizar los medios durante un mínimo de 15 minutos a 121oC, 15 psi.</li>
	<li>Con un guante o almohadilla resistente al calor, retire los matraces del autoclave cuando el ciclo esté completo y colóquelos en un baño de agua de 40-50 oC.</li>
	<li>Una vez alcanzada la temperatura adecuada, vierta el contenido del matraz etiquetado como "Broth" en un Erlenmeyer de 250 ml, o matraz de fondo redondo. Etiquetar el matraz de 250 ml "solución0".</li>
	<li>Obtenga 10, 100 mm x 15 mm de platos de petri estériles y etiquételos con la fecha, el nombre, el tipo de medio utilizado y la zona de columna de Winogradsky de la que se cosecharán los organismos.</li>
	<li>Retire el matraz etiquetado como "Agar" del baño de agua y comience a verter en cada uno de los platos de 10 petri. No se deben añadir más de 15 ml a cada plato. Esto también se puede realizar con un pipetador y una pipeta serológica de 25 ml para mejorar la precisión. Use una punta de pipeta estéril para eliminar las burbujas presentes, y luego cubra con las tapas de la placa y deje que se solidifique durante la noche.</li>
</ol>3. Preparación diluyente
<ol><li>Prepare diez tubos de ensayo capaces de almacenar 20 ml o más en un bastidor y etiquételos T1-T10. Cada número de tubo es coherente con el factor de dilución al que corresponde (es decir, T4 a 1x10-4 o 0,0001 o 1/10.000 de concentración de stock).</li>
	<li>Pipet 9 mL de 0.45% salina en cada uno de los 10 tubos de ensayo.</li>
	<li>Los espacios en blanco salinos ahora están listos para ser esterilizados por autoclave. Utilice papel de aluminio para cubrir cada uno de los 10 tubos de ensayo y luego transfieralos a un bastidor de tubo de ensayo compatible con autoclave. Esterilice durante un mínimo de 15 minutos a 121oC, 15 psi.</li>
	<li>Retire los espacios en blanco con guantes resistentes al calor y deje enfriar. Cubra y almacene a 4oC hasta que sea necesario cuando los tubos hayan alcanzado la temperatura ambiente, o cuando se enfríen al tacto.</li>
</ol>4. Cultivo de organismo objetivo
<ol><li>Inocular la "solución0"con una sola colonia a partir de una placa previamente rayada o de 50 ml de una culata congelada. Permita que el organismo objetivo se replique colocando la "solución0"inoculada en una incubadora de 37oC durante la noche con temblores (si es necesario). (Nota: El matraz debe estar cubierto para evitar la contaminación. Si el organismo objetivo es aeróbico, utilice gasas estériles y tapones de algodón para evitar la contaminación. Si evalúa las regiones de la columna Winogradsky, simplemente retire 1 gramo de cada zona deseada (aeróbico y anaeróbico a los efectos de este estudio) y vuelva a suspender en T1 antes de continuar con el paso 5.3.</li>
</ol>5. Dilución en serie
<ol><li>Obtenga el matraz etiquetado como "Caldo nutritivo" de la incubadora y agite vigorosamente.</li>
	<li>Pipet 1 mL de "solución0"en el tubo de ensayo etiquetado T1. Vórtice T1. Si evalúa los explantes de Winogradsky, pese 1 gramo de la zona deseada y agréguelo a La T1 antes del vórtice. (Nota: 1 mL se utiliza aquí para la simplicidad- volúmenes más pequeños o más grandes de diluyente también se pueden utilizar).</li>
	<li>Retire 1 ml del tubo de ensayo T1 y agréguelo al tubo de ensayo T2. Vórtice T2.</li>
	<li>Retire 1 ml del tubo de ensayo T2 y agréguelo al tubo de ensayo T3. Vórtice T3.</li>
	<li>Retire 1 ml del tubo de ensayo T3 y agréguelo al tubo de ensayo T4. Vortex T4.</li>
	<li>Retire 1 ml del tubo de ensayo T4 y agréguelo al tubo de ensayo T5. Vórtice T5.</li>
	<li>Retire 1 ml del tubo de ensayo T5 y agréguelo al tubo de ensayo T6. Vortex T6.</li>
	<li>Retire 1 ml del tubo de ensayo T6 y agréguelo al tubo de ensayo T7. Vortex T7.</li>
	<li>Retire 1 ml del tubo de ensayo T7 y agréguelo al tubo de ensayo T8. Vortex T8.</li>
	<li>Retire 1 ml del tubo de ensayo T8 y agréguelo al tubo de ensayo T9. Vortex T9.</li>
	<li>Retire 1 ml del tubo de ensayo T9 y agréguelo al tubo de ensayo T10.</li>
</ol>6. Revestimiento de propagación
<ol><li>Pipet 100 l de una muestra diluida de T1 directamente sobre una placa de petri. Este paso puede ser, pero no necesita ser, repetido para cada tubo.</li>
	<li>Obtener una varilla de propagación estéril y desechable o una llama esterilizar una varilla de esparcimiento de vidrio. En un movimiento en el sentido de las agujas del reloj/en el sentido contrario a las agujas del reloj, deslice la parte horizontal de la varilla de propagación para distribuir equitativamente la muestra dentro de la placa petri.</li>
	<li>Repita el proceso para cada zona de la columna Winogradsky que se va a evaluar.</li>
	<li>Incubar placas en una incubadora de 37oC durante 24 horas. Para organismos anaeróbicos, utilice una cámara anaeróbica.</li>
</ol>7. Streaking
<ol><li>Seleccione una dilución adecuada de su organismo objetivo. Por ejemplo, la solución4 producirá una dilución 1/10.000 de su concentración inicial. Normalmente, las diluciones de 1/1.000th (T3/Solution), 1/1.000.000th (T6/Solution6) y 1/1,000,000 th (T9/Solution9)se evalúan para enumerar microbios.</li>
	<li>Usando un lazo de inoculado desechable estéril de plástico o un bucle de inoculado de metal reutilizable que ha estado bajo fuego durante no menos de 10 segundos, sumerja en la solución deseada del paso 5. Los bucles de inoculación calibrados deben transferir 0,01 ml. (Precaución: No permita que el bucle flameado entre en contacto con las bacterias inmediatamente después de retirarse del calor)</li>
	<li>Levante ligeramente la cubierta de la placa de petri en un lado para que sólo el bucle inoculado pueda acceder al agar. Deslice el bucle inoculante a través de la parte superior de los medios de comunicación de una manera en zig-zag teniendo cuidado de no comprometer el agar. Baje la tapa del plato de petri.</li>
	<li>Utilice un nuevo bucle de inoculado desechable o vuelva a esterilizar su bucle reutilizable.</li>
	<li>Gire la placa aproximadamente 1/3rd (118o) y reduzca la frecuencia del movimiento en zig-zag.</li>
	<li>Una vez más, utilice un nuevo bucle desechable o vuelva a esterilizar un bucle de metal antes de girar una última vez y reduzca la frecuencia en zig-zag una vez más. Baje la tapa del plato de petri.</li>
	<li>Repita los pasos 7.2 - 7.6 hasta que se hayan rayado al menos tres platos de petri para tres diluciones diferentes, utilizando un nuevo bucle desechable o volviendo a poner en llamas un bucle reutilizable(Figura 2).</li>
	<li>Coloque platos de petri rayados en una incubadora de 37oC durante la noche. Para los organismos anaeróbicos, utilice una cámara anerobica.</li>
</ol>8. Análisis de datos y resultados
<ol><li>Los cultivos fueron cosechados de las zonas oxic y anóxicos de una columna Winogradsky de 7 días. Estas zonas son adecuadas para anaerobios heterotróficos y oxidantes de hierro, respectivamente.</li>
	<li>Los explantes de columna se diluyeron en serie antes de rayar o esparcirse en las placas de agar LB.</li>
	<li>Streaking reveló una población mixta de cada una de las zonas de Winogradsky evaluadas. Las placas de propagación produjeron resultados similares.</li>
	<li>Para calcular cFU/ml o CFU/g, promediar el número de colonias contadas a partir de tres placas. Multiplique el número medio de colonias por el factor de dilución y divida por la cantidad alícuota. Por ejemplo, si se contara un promedio de 65 colonias en placas inoculadas con 0,1 ml de solución6 (T6), la fórmula descrita anteriormente equivaldría a 650.000.000 de UFC/ml.</li>
	<li>Las colonias aisladas ahora se pueden elegir de cada placa para su uso en ensayos de enriquecimiento para determinar la identidad de las especies.</li>
</ol>

La enumeración bacteriana y el aislamiento de cepas por chapado requieren concentraciones manejables de organismos objetivo. Por lo tanto, el blindaje exitoso está supeditado a la dilución en serie. Como tal, las técnicas antes mencionadas siguen siendo la piedra angular del examen microbiológico y la experimentación. Aunque simple por diseño, los factores de dilución y la técnica de chapado pueden ser modificados por el experimentador para reforzar los resultados sin comprometer la integridad de cada método. Trazar las cuatro fases del crecimiento bacteriano puede ser útil al caracterizar los microbios deseados. Estas fases, retraso, registro, estacionario y muerte, están marcadas por cambios en la replicación bacteriana. La fase de retraso presenta un crecimiento lento debido a la adaptación fisiológica, la fase log es el período de máxima proliferación que presenta un aumento exponencial en las células viables, la fase estacionaria se alcanza debido a limitaciones ambientales y acumulaciones de toxinas, antes de la fase de muerte donde el recuento celular comienza a caer. Esto se puede lograr diluyendo en serie (o diluyendo 1 paso para evitar confusiones) Solución0 cada hora durante un total de 8 horas, comenzando en el tiempo0 (la solución0 debe ser devuelta a una incubadora de agitación después de cada dilución). Calcule el registro10 de CFU/ml para un único diluyente de Tiempo0 y trace en el eje Y. Repita este cálculo para la muestra Tiempo1 (asegúrese de calcular CFU/ml utilizando el mismo factor de dilución que Tiempo0). Repita hasta que cada vez (Tiempo1-Tiempo8) se tracen en el eje X.

diluciones en serie y enchapado: enumeración microbiana

Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

Fuente: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1y Christopher P. Corbo1 1 Departamento de Ciencias Biológicas, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301
La evaluación cuantitativa de los prokaryotes puede ser onerosa dada su abundancia, propensión a la proliferación exponencial, diversidad de especies dentro de una población y necesidades fisiológicas específicas. Acomenda este desafío, está la naturaleza de cuatro fases en la que las bacterias se replican (retraso, registro, estacionario y muerte). La capacidad de estimar con precisión la concentración de microorganismos es necesaria para una identificación, aislamiento, cultivo y caracterización exitosas (6). Como tal, los microbiólogos han empleado la dilución en serie y diversas técnicas de chapado durante más de un siglo para cuantificar de forma fiable la carga bacteriana y viral en entornos clínicos, industriales, farmacéuticos y académicos de laboratorio (2,4,6). Las descripciones de esta metodología aparecieron por primera vez en 1883 cuando el científico y médico alemán Robert Koch publicó su trabajo sobre agentes causantes de enfermedades infecciosas (2). A menudo conocido como el padre de la bacteriología moderna, las técnicas de Koch se han convertido en el estándar de oro para la enumeración de microorganismos, cultivables o de otro tipo, en todo el mundo.
La dilución en serie es una reducción sistemática de una entidad conocida o desconocida (un soluto, organismo, etc.) mediante la resuspensión sucesiva de una solución inicial (solución0)en volúmenes fijos de un diluyente líquido (en blanco). Estos espacios en blanco suelen consistir en 0,45% de salina, aunque la composición puede ser variada (7). Mientras que un experimentador puede elegir cualquier volumen para cada diluyente, más a menudo es un múltiplo de 10, facilitando la reducción logarítmica de la muestra. Por ejemplo, la solución0 contiene un total de 100 células de E. coli suspendidas en 10 ml de caldo nutritivo. Si se retira 1 ml de la solución0 y se añade a 9 ml de solución salina (diluyente1), la nueva solución (solución1) contendría 1/10de la concentración inicial de E. coli. En este ejemplo, la nueva solución (solución1) contendría 10 células de E. coli. Repetir este proceso eliminando 1 ml de la solución1 y añadiéndola a otros 9 ml de solución salina (diluyente2)produciría la solución2,que contiene sólo una sola célula de E. coli. Dado que cada nueva solución (9 ml de diluyente + 1 ml de solución) contiene un total de 10 ml, podemos concluir que el factor de dilución para esta reducción es de 10 o que se trataba de una dilución serial de 10 veces(Figura 1). Puesto que sólo comenzamos con 100 células en este ejemplo y nos estamos diluyendo por un factor de 10, sólo se requieren dos pasos para alcanzar la concentración mínima absoluta de 1 célula.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig1.jpg"> Figura 1: Dilución en serie de una solución de stock. Se añade una alícuota de 1 ml de la solución en stock (solución0) al tubo 1 que contiene 9 ml de solución salina al 0,45% (dilent1); el producto de esta mezcla es la solución1. Repita alístique1 ml de la solución recién creada1 y agregándola al tubo 2. La alícuota y la resuspensión continúan de esta manera hasta que se alcanza el tubo final, diluyendo la concentración de stock por un factor de 10 cada uno con cada paso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La dilución en serie es la técnica más sencilla para obtener concentraciones manejables de un organismo deseado y se complementa con el rayado y la propagación de la placa de petri, sólo dos de las muchas técnicas de chapado utilizadas por los microbiólogos. Este beneficio de este enfoque es que el experimentador puede cosechar cepas puras de una sola especie o cepas separadas de una población mixta (7). El rayado se logra introduciendo un organismo en un medio sólido (generalmente consistente en agarosa) sobre el que crecerá si se dispone de los nutrientes adecuados. Barrer suavemente un bucle inoculante estéril a través del medio (de modo que quede una racha sutil) en un patrón sinusoidal rígido distribuirá el organismo proporcionalmente a la frecuencia de la forma de onda del experimentador. Dividir la placa Petri en tercios o cuartos (racha de cuadrante) y disminuir la frecuencia de cada racha a medida que se introduce una nueva región del plato reducirá gradualmente el número de microorganismos que pueden ocupar esa región, produciendo colonias únicas en lugar de una césped bacteriano incuantificable. El revestimiento extendido no diluye además las muestras; un esparcidor de vidrio estéril se utiliza para distribuir una alícuota de medios de suspensión a través de un plato de petri completo(Figura 2). Las colonias que crecen en la placa de propagación surgen de una sola célula y cada colonia en el plato se puede contar para estimar el número de unidades formadoras de colonias por mililitro (CFU) en una suspensión dada, representada como CFU/mL (6)(Figura 3) Agar suave y réplica El revestimiento son variaciones de las técnicas antes mencionadas y permiten el aislamiento de bacteriófagos y cribado mutante, respectivamente (1,7).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig2.jpg"> Figura 2: Rayado de placas para la enumeración bacteriana y aislamiento de deformación unitaria. Etiquete la parte inferior de una placa de petri con información de identificación (nombre de bacteria, fecha, medios) y divídala en tercios. Después de seleccionar una dilución adecuada de la muestra de stock, tome un bucle de inoculado estéril (desechable o flameado) y sumerja el tubo de ensayo (aquí, T3). Levante ligeramente la cubierta de la placa de petri en un lado para que sólo el bucle inoculado pueda acceder al agar. Deslice el bucle inoculante a través de la parte superior de los medios de comunicación de una manera en zig-zag teniendo cuidado de no comprometer el agar. Gire la placa aproximadamente 1/3rd (118o) y reduzca la frecuencia del movimiento en zig-zag. Gire una última vez y reduzca la frecuencia en zig-zag una vez más. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig3.jpg"> Figura 3: Extender el revestimiento. 1 g de la zona aeróbica se resuspendió en T1 y luego se diluyó en serie. Para distribuir el inóculo por cada plato se utiliza una varilla de esparcimiento desechable de vidrio estéril o plástico para distribuir el inóculo. Esto se repitió con 1 g de la zona anaeróbica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Al igual que con las diluciones en serie, se emplea una escala logarítmica para expresar la concentración del organismo. El número de colonias cultivadas en platos de petri estándar de 100 mm x 15 mm se puede enumerar manualmente (o automatizar con la ayuda del procesamiento computacional) mediante la identificación de racimos aislados de crecimiento. Cuenta que el total de menos de 30 o más de 300 debe definirse como demasiado pocos para contar (TFTC) o demasiado numerosos para contar (TNTC), respectivamente. En el caso de este último, se debe realizar una dilución en serie para reducir la concentración antes de volver a rayar una nueva placa de petri. Promediar el número de colonias autónomas identificadas a partir de tres platos de petri separados y multiplicar la media por el factor de dilución producirá CFU/ml; trazando el registro10 de CFU/ml contra el tiempo revelará el tiempo medio de generación del organismo (7).

Diluciones en serie y enchapado: enumeración microbiana

Source: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1, and Christopher P. Corbo1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island ...

A veces, para identificar y estudiar las bacterias, primero necesitamos aislarlas y enriquecerlas a partir de una muestra. Por ejemplo, las muestras obtenidas de una columna de Winogradsky están mezcladas, lo que significa que contienen múltiples especies o cepas de bacterias, por lo que estudiar una bacteria individual o enumerar los diferentes tipos presentes puede ser un desafío. Con este fin, las técnicas de dilución y siembra en serie se emplean normalmente para cuantificar de forma fiable la carga bacteriana y aislar las colonias individuales. La dilución en serie es un proceso a través del cual la concentración de un organismo, bacterias en este ejemplo, se reduce sistemáticamente a través de la resuspensión sucesiva en volúmenes fijos de diluyente líquido. Por lo general, el volumen del diluyente es un múltiplo de 10 para facilitar la reducción logarítmica del organismo de la muestra. Por ejemplo, primero se retira un gramo de sedimento de la zona de interés de Winogradsky y se añade a 10 mililitros de un medio líquido adecuado. Luego, se agrega un mililitro de esta primera dilución a otro tubo que contiene nueve mililitros de medio. El proceso se puede repetir hasta que se hayan preparado varias concentraciones diferentes de bacterias. La dilución en serie es la clave para la enumeración de bacterias en este ejemplo, ya que las muestras mezcladas de una columna de Winogradsky contienen un número desconocido, a menudo grande, de bacterias. A continuación, el recubrimiento de rayas y el recubrimiento extendido permiten el aislamiento y la enumeración de bacterias dentro de una muestra, respectivamente. El rayado se logra introduciendo una muestra diluida en una sección del medio sólido suplementado con nutriente, que se divide en tercios. Este inóculo se extiende sobre cada tercio de la placa en un patrón en zig-zag. A medida que se rayan diferentes secciones de la placa, cruzándose desde la muestra anterior solo una vez, la muestra se extiende más finamente. Esto significa que es posible que solo necesite rayar una dilución para lograr colonias individuales en las secciones posteriores. Después de la incubación, las placas rayadas permiten observar la morfología de la colonia, información que puede ayudar a diferenciar entre las diferentes especies bacterianas. Alternativamente, si el objetivo principal es la enumeración de las bacterias en la muestra extendida, se puede utilizar el recubrimiento. En el recubrimiento extendido, una alícuota de una sola muestra se distribuye uniformemente sobre toda la superficie del medio sólido. Por lo general, debido a que no conocemos los números bacterianos en la muestra mezclada, se hace una placa de extensión para cada una de las diluciones o una muestra representativa de ellas. Después de la incubación, la enumeración se puede realizar utilizando estas placas de esparcimiento. Cualquier placa con un conteo de colonias inferior a 30 debe descartarse, ya que los recuentos pequeños están sujetos a un mayor error. Del mismo modo, se deben descartar los recuentos superiores a 300 porque el hacinamiento y la superposición de colonias pueden llevar a una subestimación del recuento de colonias. Si el conteo de colonias de cada una de estas placas restantes se registra y se multiplica por el factor de dilución, y luego se divide por el volumen plateado, esto produce las unidades formadoras de colonias, o UFC, por mililitro de suspensión. En este video, aprenderá cómo evaluar cualitativa y cuantitativamente una muestra que contiene una bacteria conocida y las comunidades microbianas contenidas en varias regiones de una columna de Winogradsky a través de dilución en serie, recubrimiento extendido y recubrimiento de rayas. Primero, póngase el equipo de protección personal adecuado, incluida una bata de laboratorio, guantes y gafas. A continuación, esterilice el espacio de trabajo con etanol al 70% y limpie la superficie. A continuación, reúna dos matraces Erlenmeyer de 500 mililitros y etiquete un caldo y el otro agar. Para preparar la solución de agar LB, mezcle aproximadamente 6,25 gramos de agar LB, tres gramos de agar técnico y 250 mililitros de agua destilada en el matraz de agar etiquetado. Luego, prepare el caldo LB combinando 2. 5 gramos de medio LB y 100 mililitros de agua destilada en el caldo etiquetado con el matraz. Después de esterilizar los matraces en autoclave, use un guante resistente al calor para quitar los matraces del autoclave y colóquelos en un baño de agua de 40 a 50 grados Celsius. Una vez que los matraces estén a 50 grados centígrados, prepare cuidadosamente tres alícuotas de 100 mililitros de la solución de caldo y etiquete cada solución alícuota como cero. A continuación, reúna 10 placas de Petri estériles y etiquételas con la fecha, el nombre, el tipo de medio utilizado y la zona de la columna de Winogradsky de la que se cosecharán los organismos. Pipetear 15 mililitros de agar del matraz de agar en cada placa de Petri. A continuación, utilice la punta de la pipeta para eliminar las burbujas, vuelva a colocar las tapas de las placas y deje que se solidifiquen en la mesa de trabajo durante la noche. Al día siguiente, limpie la mesa de trabajo con etanol al 70%. A continuación, etiquete 10 tubos de ensayo de 20 mililitros T1 a T10 y colóquelos en una rejilla. Pipetee nueve mililitros de solución salina de .45% en cada tubo. Ahora, cubra cada uno de los 10 tubos de ensayo sin apretar con sus tapas y transfiéralos a un soporte de tubos de ensayo compatible con autoclave. Una vez completado el ciclo, retire los blancos de solución salina con guantes resistentes al calor y deje que se enfríen. Guarde los tubos a temperatura ambiente hasta que hayan alcanzado aproximadamente 22 grados centígrados. Para cultivar un organismo objetivo conocido, E. coli en este ejemplo, inocule 100 mililitros de solución cero con una sola colonia de una placa previamente rayada. Luego, tapa el tubo e incuba durante la noche a 37 grados centígrados. Para evaluar las regiones de una columna de Winogradsky, agregue aproximadamente un gramo de material de la zona aeróbica a T1 y vuelva a suspender por vórtice. Luego, repita este proceso con un gramo de material de la zona anaeróbica. Retire el tubo que contiene la solución cero inoculada con E. coli de la incubadora y agítelo. A continuación, pipetee un mililitro de la solución en un tubo de ensayo T1 y vórtice para mezclar. Retire un mililitro de solución de T1 y transfiéralo a T2, agitando el vórtice para mezclar. Repita este proceso a través del tubo T10. Para evaluar las zonas aeróbicas y anaeróbicas de la columna de Winogradsky, extraiga un mililitro de solución de cada uno de los tubos T1 previamente preparados y transfiéralo a los tubos T2 apropiados. A continuación, continúe con las diluciones en serie a través de los tubos T10 como se ha demostrado anteriormente. Para extender la placa, pipetee 100 microlitros de la muestra diluida de cada tubo T3 en la placa de Petri correspondiente. Luego, use una varilla de esparcimiento estéril para distribuir suavemente la muestra en la placa de Petri y vuelva a colocar la tapa de la placa. Repita este proceso para las diluciones T6 y T9, como se demostró anteriormente. Incubar las placas que contienen organismos aeróbicos en una incubadora a 37 grados centígrados durante 24 horas. Incubar las placas que contienen organismos anaeróbicos en una cámara anaeróbica ajustada a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, retire las placas de dilución T3, T6 y T9 de la incubadora y de la cámara anaeróbica y transfiéralas a la mesa de trabajo. Trabajando con una placa a la vez, deslice un bucle de inoculación estéril a través de la parte superior del medio en un patrón en zig-zag. Luego, vuelva a colocar la tapa de la placa de Petri. A continuación, gire la placa en 1/3 y esterilice el bucle para reducir la frecuencia del patrón en zig-zag realizado anteriormente. Nuevamente, después de esterilizar el bucle, gire la placa 1/3, reduzca la frecuencia del patrón en zig-zag por última vez y vuelva a colocar la tapa. Repita este método de rayado para las placas restantes, como se mostró anteriormente. Luego, coloque las placas rayadas que contienen organismos aeróbicos en una incubadora a 37 grados Celsius durante la noche y las placas rayadas que contienen organismos anaeróbicos en una cámara anaeróbica configurada a 37 grados Celsius durante la noche. Los cultivos se cosecharon en las zonas aeróbicas y anaeróbicas de una columna Winogradsky de siete días. Luego, los cultivos se diluyeron en serie antes de rayar y esparcir en placas de agar LB. Las rayas revelaron una población mixta de cada una de las zonas de Winogradsky evaluadas, y las placas esparcidas produjeron resultados similares. Un plato veteado de una población mixta dará lugar a colonias bacterianas de diferentes formas, tamaños, texturas y colores. En contraste, las placas rayadas y extendidas que contenían el organismo conocido, E. coli, demostraron una población homóloga. Por lo general, es mejor calcular las UFC por mililitro utilizando el recuento promedio de colonias de tres placas distribuidas con la misma muestra y factor de dilución. Multiplique el número promedio de colonias por el factor de dilución y divida por la cantidad alícuota. Finalmente, las colonias aisladas elegidas de cada placa se pueden utilizar en ensayos de enriquecimiento adicionales para determinar la identidad de la especie.

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Education

Educación

JoVE Science Education

Advanced Biology

Biología Avanzada

Microbiology

Microbiología

counting bacteria with dilution plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs.

Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed volume of diluent, or blank, such as 0.45% saline. When 1 mL is transferred into 9 mL of saline, the sample is diluted 10-fold. Repeating that step again lowers the concentration even more, and only two steps are needed in the example of 100 E. coli cells to reach a single cell.

Plating methods help separate microorganisms and make colonies visible. Streaking uses a sterile inoculating loop on agar, a solid growth medium, to spread cells across the plate. In a quadrant streak, the plate is divided into thirds or fourths, and each new area is streaked less often so fewer cells land there. This can produce single colonies instead of a bacterial lawn and can help isolate a pure strain from a mixed sample.

Spread plating uses a sterile glass spreader to distribute an aliquot over the whole petri dish. This method does not add another dilution step. The colonies that grow are counted as colony forming units, or CFU, which are reported as CFU/mL. Soft agar and replica plating are related methods. They can be used for bacteriophage isolation and mutant screening.

Colony counts are usually done on standard 100 mm by 15 mm petri dishes. Isolated colonies can be counted by hand or with computer tools. Plates with fewer than 30 colonies are too few to count, or TFTC. Plates with more than 300 colonies are too numerous to count, or TNTC. If a plate is TNTC, another serial dilution should be done before restreaking a new plate.

To estimate CFU/mL, scientists average the number of colonies from three separate plates and multiply by the dilution factor. The same log scale used in dilution work also helps show how organism concentration changes over time. Plotting log10 CFU/mL against time can reveal the mean generation time of the organism.

Counting Bacteria with Dilution Plates

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Esta colección brinda las herramientas clave en la investigación microbiológica, incluyendo la técnica estéril adecuada y el revestimiento, cómo utilizar medios selectivos y enriquecer muestras, y métodos de cultivo para muestras mixtas o puras. Además, proporciona información sobre como examinar los métodos comunes para identificar aislados microbianos, así como procedimientos para la manipulación genética de bacterias.

Learn how serial dilution, streaking, and spread plating help scientists count bacteria, isolate colonies, and estimate CFU/mL in lab samples.

Counting Bacteria with Dilution Plates

Description

Transcript

Tags